Name: 方法基因水平转移的研究金黄色葡萄球菌 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: 了解金黄色葡萄球菌基因水平转移的研究方法，包括接合、转导和自然转化三种途径。本视频演示抗生素耐药基因在病原菌中的传播机制，为微生物学和抗药性研究提供可靠的实验框架。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本工作部分得到了武田科学基金会、辉瑞学术贡献以及日本学术振兴会外国研究人员博士后奖学金（FC）的支持。

注意：本研究所使用的菌株和材料分别列于表1和材料表中。在传播实验中，使用N315和COL的cfr阳性衍生株作为cfr基因的供体菌株（N315-45和COL-45）。这些菌株此前通过接合实验获得，供体菌为一株临床分离的携带cfr基因的Staphylococcus epidermidis菌株（ST2），接合操作按照标准接合实验方案进行（见下文）。该菌株携带的cfr基因位于一种pSCFS7样质粒上7。
1. 使用滤膜交配法进行接合
注意：以携带cfr基因的S. aureus N315菌株（N315-45）7（CmR）作为供体，COL8或Mu509菌株（TetR，CmS）作为受体。能够在含32 mg/L氯霉素加8 mg/L四环素的培养基中生长的双抗性菌落（TetR，CmR）被视为疑似接合子，通过菌落PCR检测cfr基因的存在，并测定其受体菌的药物敏感性谱型。
<ol>
	<li>按照先前描述的方案进行接合实验10，并进行若干修改：
	<ol>
		<li>分别在胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）培养基中制备5 mL供体和受体菌的过夜培养物（供体加32 mg/L氯霉素，受体不加），于37 °C振荡培养。</li>
		<li>用新鲜TSB培养基将过夜培养物的光密度（OD600）调整至1（OD600 = 1.0）。取0.5 mL供体菌培养物（N315-45）与0.5 mL受体菌培养物（COL或Mu50）混合，再向混合液中加入1 mL PBS。</li>
		<li>使用真空泵系统将细菌混合液转移至0.45 µm滤膜上。</li>
		<li>将滤膜置于羊血琼脂平板上，于37 °C孵育1天。 
		注意：此步骤需使用富集培养基，以支持双重抗性菌的生长。</li>
		<li>从平板上取出滤膜，悬浮于10 mL磷酸盐缓冲液（PBS）中，充分涡旋振荡，以回收滤膜上附着的所有细菌。</li>
		<li>用新鲜TSB对细菌悬液进行10倍系列稀释。取0-10-4稀释度的样品各100 µL，接种于添加了32 mg/L氯霉素和8 mg/L四环素的TSB琼脂（TSA）平板上，用于筛选转接合子；取10-5-10-6稀释度的悬液各100 µL，接种于仅含8 mg/L四环素的TSA平板上，用于计数受体菌总数。将平板于37 °C孵育18–24小时。</li>
		<li>通过菌落PCR7检测双重抗性菌落（疑似转接合子）中cfr基因的存在，并分析其药敏谱（抗菌图谱）。</li>
		<li>根据标准微量稀释法或纸片扩散法11测定最小抑菌浓度（MICs），确定抗菌图谱。转接合子的药敏谱应与受体菌一致，仅氯霉素（以及cfr基因影响的其他化合物）除外。此步骤至关重要，用以排除供体菌株自身产生的四环素抗性。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 噬菌体转导
注意：转导实验中使用了属于长尾噬菌体科（Siphoviridae）的噬菌体 MR83a（实验室保存菌株）。以 N315-45 作为 cfr 基因的供体用于噬菌体感染，受体菌则为 N315、COL 或 Mu50 菌株。通过受体菌株在含 32 mg/L 氯霉素的培养基中生长的能力来确定其是否获得 cfr 基因。在此条件下生长的菌落进一步通过菌落 PCR 检测 cfr 基因的存在，并分析其药敏谱型以排除潜在污染。
<ol>
	<li>在供体菌上扩增噬菌体
	<ol>
		<li>在37 °C、180 rpm振荡条件下，用5 ml添加了3.6 mM Ca2+的营养肉汤（NBCaCl2）培养N315-45过夜。 
		注意：噬菌体感染需要钙离子。参见材料表。其他公司的营养肉汤可能存在诸如钙沉淀等问题。</li>
		<li>将过夜培养物按1:1,000稀释至终体积为10 mL的NBCaCl2中，分装于50 ml玻璃烧瓶或玻璃小瓶中。在37 °C、180 rpm振荡条件下培养细菌1小时。</li>
		<li>用NBCaCl2培养基对噬菌体MR83a进行系列稀释（10-2、10-3、10-4、10-5和10-6）。向细菌培养物中加入20 µl稀释后的噬菌体。同时设置一个未加噬菌体的对照培养物，作为细菌生长的阳性对照，并可用于次日测定噬菌体滴度。</li>
		<li>在37 °C、轻度振荡（100 rpm）条件下培养过夜。 
		注意：当感染的噬菌体未过量时，细胞会一定程度生长，随后因噬菌体通过裂解循环扩增而进入裂解阶段。未加噬菌体的培养物将完全生长，而加有噬菌体的培养物则表现出不同程度的透明化。</li>
		<li>选择一至两个噬菌体稀释度最高且培养液澄清的小瓶。</li>
		<li>将培养物转移至15 ml离心管中，加入250 µl氯仿，通过反复倒置充分混匀。</li>
		<li>在4 °C下以5,000 x g离心20分钟。</li>
		<li>将上清液转移至新管中，4 °C保存备用。 
		注意：噬菌体至少可稳定数月，但长期储存会导致滴度和转导效率下降。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>测定噬菌体滴度（噬菌斑测定法）
	<ol>
		<li>制备营养肉汤琼脂（1.5%琼脂）培养基，置于55 °C水浴中保温。向培养基中加入经高压灭菌的0.5 M CaCl2溶液，使其终浓度为3.6 mM。倾注至90 mm培养皿中（NBCaCl2平板）。</li>
		<li>在37 °C、振荡条件下，用5 ml NBCaCl2培养N315过夜；也可使用上述步骤2.1.3中所述的对照培养物替代。</li>
		<li>将10 µl过夜培养物加入200 µl NBCaCl2中，均匀涂布于NBCaCl2平板表面。当液体覆盖整个平板表面时停止涂布，静置晾干。</li>
		<li>使用NBCaCl2培养基对先前制备的噬菌体（步骤2.1.8）进行10倍系列稀释（从10-5至10-10）。</li>
		<li>将每种噬菌体稀释液各3 µl点样于已涂布细菌的平板上。</li>
		<li>在30 °C下培养过夜。</li>
		<li>计数噬菌斑数量，并按以下公式计算噬菌体滴度：噬菌斑形成单位（pfu）/ml = 噬菌斑数 × 稀释倍数 / 点样体积（3 × 10-3 ml）</li>
	</ol>
	</li>
	<li>噬菌体转导 
	注意：使用前一步骤（2.1.8）制备的噬菌体混合液，检测cfr基因向S. aureus菌株的转导情况。本实验中，使用N315、COL或Mu50菌株作为受体菌。
	<ol>
		<li>在37 °C、180 rpm振荡条件下，用5 ml NBCaCl2培养N315、COL或Mu50过夜。</li>
		<li>将噬菌体用NBCaCl2稀释至约109 pfu/mL。</li>
		<li>在50 ml玻璃小瓶中混合500 µl过夜培养物、500 µl新鲜NBCaCl2和1 ml噬菌体（~109 pfu/ml）；预期感染复数（MOI）不得超过1。在37 °C、轻度振荡（100 rpm）条件下孵育30分钟。 
		注意：在加入噬菌体前对受体细胞进行热处理（52 °C处理2分钟以灭活内源性限制性酶）可提高转导效率12。</li>
		<li>加入50 µl 20% Na3-Citrate。继续在37 °C下轻度振荡30分钟。 
		注意：Na3-Citrate作为中等强度的钙离子螯合剂。</li>
		<li>制备熔化的脑心浸出液（BHI）琼脂（1.5%琼脂）培养基，并置于55 °C水浴中保温。</li>
		<li>将细菌-噬菌体混合物转移至100 ml烧瓶中，加入50 ml含32 mg/L氯霉素的温热BHI琼脂，充分混匀后倾注至90 mm培养皿中。 
		注意：该方法可检测少量生长的菌落（潜在转导子）。</li>
		<li>在37 °C下培养24–48小时。</li>
		<li>通过将菌落转移至含32 mg/L氯霉素的BHI琼脂平板上，进一步检测所获得菌落（转导子）的抗性。通过菌落PCR7确认cfr基因的存在。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 自然转化
注意：自然转化实验 S. aureus 按照我们之前研究中所述的方法进行2N315 衍生株 N2-2.12,7，用作受体。在此菌株中，该 sigH 基因座被重复，以实现SigH的组成型表达2有关分离表达 SigH 的感受态变异株的详细步骤，请参见之前的描述2如果要转移的抗性标记不是氯霉素，则使用 pRIT-sigH（CmR) 可用于表达SigH，如先前所述2纯化的质粒或全DNA提取物 cfr-获得的 S. aureus COL-457 用作转化的供体DNA。
<ol>
	<li>供体DNA的制备
	<ol>
		<li>在含有50 mL添加32 mg/L氯霉素的TSB培养基的300 mL三角瓶中，于37 °C振荡培养COL-45过夜。同时培养携带pHY300 质粒(TetR)的E. coli HST04，用于提取质粒作为对照实验。 
		注意：HST04 (dam-/dcm-)缺失DNA甲基化酶基因13。其他常规含有DNA甲基化酶的菌株也可用于制备供体DNA，因为DNA甲基化状态不影响转化效率。此外，从S. aureus COL菌株中纯化的pT181质粒也可作为转化实验的阳性对照2。</li>
		<li>通过离心收集细胞（4 °C，8,000 x g，10分钟）。</li>
		<li>使用质粒DNA提取试剂盒或常规DNA纯化方法提取并纯化质粒DNA或总DNA。</li>
		<li>使用分光光度计定量纯化的DNA，并于4 °C保存备用。 
		注意：转化实验应使用新鲜制备的DNA，通常不超过一周。陈旧的DNA样品会降低转化效率。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>转化实验
	<ol>
		<li>将受体菌株（N2-2.1）在5 mL TSB培养基中，于37 °C振荡培养过夜。</li>
		<li>取0.5 mL过夜培养物转移至1.5 mL离心管中，离心沉淀细胞（4 °C，10,000 x g，1分钟）。</li>
		<li>用10 mL CS2培养基重悬细胞，置于50 mL离心管中。 
		注意：CS2培养基是一种完全合成培养基，可诱导S. aureus产生自然感受态2（参见材料表中的培养基成分）。其他标准实验室培养基，如TSB或BHI，不适合用于转化2,13。</li>
		<li>将细菌在37 °C振荡（180 rpm）培养至对数生长后期（约8小时）。</li>
		<li>离心收集细胞（4 °C，5,000 x g，5分钟）。</li>
		<li>用10 mL新鲜CS2培养基重悬细胞。</li>
		<li>向细胞悬液中加入10 µg纯化的质粒或基因组DNA（步骤3.1.4）。在37 °C、180 rpm条件下振荡孵育2.5小时。 
		注意：与DNA共孵育时间较短（&#60;2.5小时）会导致转化频率降低。</li>
		<li>离心收集细胞（4 °C，5,000 x g，5分钟）。</li>
		<li>将细胞重悬于10 mL BHI培养基中，然后将细胞悬液与90 mL已融化并预热至55 °C的BHI琼脂（添加32 mg/L氯霉素，或在对照实验中添加5 mg/L四环素）混合均匀，倒入90 mm培养皿中。迅速冷却并使琼脂凝固。</li>
		<li>将平板在37 °C培养2天。</li>
		<li>使用牙签将产生的菌落（转化子）转移至含相应抗生素的新BHI琼脂平板上进行划线传代，以确认其抗性特征。通过菌落PCR确认获得的抗性基因（cfr或tetM）7。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Lindsay, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+variation+and+evolution+of+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22IJMM%22%5BJournal%5D)">Genomic variation and evolution of Staphylococcus aureus.</a> IJMM. 300, 98-103 (2010).</li>
<li>Morikawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+cryptic+secondary+sigma+factor+gene+unveils+natural+competence+for+DNA+transformation+in+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Expression of a cryptic secondary sigma factor gene unveils natural competence for DNA transformation in Staphylococcus aureus.</a> PLoS Pathog. 8, e1003003(2012).</li>
<li>Caryl, J. A., O'Neill, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+nucleotide+sequence+of+pGO1%2C+the+prototype+conjugative+plasmid+from+the+Staphylococci%5BTitle%5D)+AND+%22Plasmid%22%5BJournal%5D)">Complete nucleotide sequence of pGO1, the prototype conjugative plasmid from the Staphylococci.</a> Plasmid. 62, 35-38 (2009).</li>
<li>Novick, R. P., Christie, G. E., Penades, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phage-related+chromosomal+islands+of+Gram-positive+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The phage-related chromosomal islands of Gram-positive bacteria.</a> Nat. Rev. Microbiol. 8, 541-551 (2010).</li>
<li>Dubey, G. P., Ben-Yehuda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intercellular+nanotubes+mediate+bacterial+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Intercellular nanotubes mediate bacterial communication.</a> Cell. 144, 590-600 (2011).</li>
<li>Dubey, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+and+Characteristics+of+Bacterial+Nanotubes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+cell%22%5BJournal%5D)">Architecture and Characteristics of Bacterial Nanotubes.</a> Dev cell. 36, 453-461 (2016).</li>
<li>Cafini, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Horizontal+gene+transmission+of+the+cfr+gene+to+MRSA+and+Enterococcus%3A+role+of+Staphylococcus+epidermidis+as+a+reservoir+and+alternative+pathway+for+the+spread+of+linezolid+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Antimicrob.+Chemother%22%5BJournal%5D)">Horizontal gene transmission of the cfr gene to MRSA and Enterococcus: role of Staphylococcus epidermidis as a reservoir and alternative pathway for the spread of linezolid resistance.</a> J. Antimicrob. Chemother. 71, 587-592 (2016).</li>
<li>Dyke, K. G., Jevons, M. P., Parker, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Penicillinase+production+and+intrinsic+resistance+to+penicillins+in+Staphylococcus+aures%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Penicillinase production and intrinsic resistance to penicillins in Staphylococcus aures.</a> Lancet. 1, 835-838 (1966).</li>
<li>Kuroda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+genome+sequencing+of+meticillin-resistant+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Whole genome sequencing of meticillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> Lancet. 357, 1225-1240 (2001).</li>
<li>Marraffini, L. A., Sontheimer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+interference+limits+horizontal+gene+transfer+in+staphylococci+by+targeting+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CRISPR interference limits horizontal gene transfer in staphylococci by targeting DNA.</a> Science. 322, 1843-1845 (2008).</li>
<li>Clinical Laboratory Standards Institute. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Methods+for+Dilution+Antimicrobial+Susceptibility+Tests+for+Bacteria+that+Growth+Aerobically+-+Seventh+Edition%3A+Approved+Standard+M7-A7%22">Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Growth Aerobically - Seventh Edition: Approved Standard M7-A7</a>. , CLSI. Wayne, PA, USA. (2006).</li>
<li>Edwards, R. A., Helm, R. A., Maloy, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+DNA+transfer+efficiency+by+temporary+inactivation+of+host+restriction%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Increasing DNA transfer efficiency by temporary inactivation of host restriction.</a> BioTechniques. 26, 892-894 (1999).</li>
<li>Thi, L. T., Romero, V. M., Morikawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+wall-affecting+antibiotics+modulate+natural+transformation+in+SigH-expressing+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Antibiot%22%5BJournal%5D)">Cell wall-affecting antibiotics modulate natural transformation in SigH-expressing Staphylococcus aureus.</a> J. Antibiot. , (2015).</li>
<li>Long, K. S., Poehlsgaard, J., Kehrenberg, C., Schwarz, S., Vester, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cfr+rRNA+methyltransferase+confers+resistance+to+Phenicols%2C+Lincosamides%2C+Oxazolidinones%2C+Pleuromutilins%2C+and+Streptogramin+A+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">The Cfr rRNA methyltransferase confers resistance to Phenicols, Lincosamides, Oxazolidinones, Pleuromutilins, and Streptogramin A antibiotics.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 50, 2500-2505 (2006).</li>
<li>Ando, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restriction-modification+system+differences+in+Helicobacter+pylori+are+a+barrier+to+interstrain+plasmid+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+microbiol%22%5BJournal%5D)">Restriction-modification system differences in Helicobacter pylori are a barrier to interstrain plasmid transfer.</a> Mol microbiol. 37, 1052-1065 (2000).</li>
<li>Evans, B. A., Rozen, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significant+variation+in+transformation+frequency+in+Streptococcus+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Significant variation in transformation frequency in Streptococcus pneumoniae.</a> ISME J. 7, 791-799 (2013).</li>
<li>Wilson, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+of+the+natural+transformation+frequency+of+Campylobacter+jejuni+in+liquid+shake+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Variation of the natural transformation frequency of Campylobacter jejuni in liquid shake culture.</a> Microbiology. 149, 3603-3615 (2003).</li>
<li>McCarthy, A. J., Witney, A. A., Lindsay, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus+temperate+bacteriophage%3A+carriage+and+horizontal+gene+transfer+is+lineage+associated%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Infect+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus temperate bacteriophage: carriage and horizontal gene transfer is lineage associated.</a> Front Cell Infect Microbiol. 2, 6(2012).</li>
<li>Lindsay, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus+genomics+and+the+impact+of+horizontal+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22IJMM%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus genomics and the impact of horizontal gene transfer.</a> IJMM. 304, 103-109 (2014).</li>
<li>Uchiyama, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intragenus+generalized+transduction+in+Staphylococcus+spp.+by+a+novel+giant+phage%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Intragenus generalized transduction in Staphylococcus spp. by a novel giant phage.</a> ISME J. 8, 1949-1952 (2014).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本研究描述了三种用于研究金黄色葡萄球菌（S. aureus）中遗传决定因子水平基因转移（HGT）的主要方法。尽管转导和接合转移已研究数十年，但自然转化的存在直到最近才被确认2。因此，S. aureus 具备所有三种主要的HGT方式，需对这三种方式均进行检测，以明确遗传决定因子可能的传播途径。本研究的目的是汇编完整的实验方案，并提供先前已发表研究中所用方法的实用信息7。尽管接合转移和转导的实验方案已有报道，但本文是首次详细描述转化实验方案的论文.
采用滤膜接合方法进行接合是一种简单且可应用于研究不同细菌物种间接合转移的技术7,10。通过使用标准化的接种物，受体菌在18–24小时后的数量可达约109 CFU/mL。转化子数量具有变异性，且数值表现出明显的菌株依赖性，但通常在接合结果为阳性时，转化子数量...

Staphylococcus aureus 是一种共生的革兰氏阳性细菌，天然定植于人类和动物的皮肤及鼻腔。该菌种是医院和医疗机构中院内感染的主要致病原因。此外，其对多种抗菌化合物产生耐药性的能力，已使由该细菌引发的感染的防控成为全球性关注的问题。
目前已知有两种主要途径参与耐药表型的传播：耐药基因型的克隆扩散以及遗传决定因子在细菌群体中的传播。对于S. aureus而言，已发现多种抗生素耐药基因（以及毒力决定因子）与可移动遗传元件（MGEs）相关1。这些元件存在于S. aureus基因组中，表明遗传物质在细菌群体内的获得与转移可能在S. aureus的适应与进化过程中发挥重要作用。
遗传物质可以通过革兰氏阳性菌中三种已知的水平基因转移（HGT）机制进行交换：转化、接合和噬菌体转导。转化涉及游离DNA的摄取。为了获得外源DNA，细菌细胞需要发育至一种特殊的生理阶段：感受态阶段。当达到这一阶段时，感受态细胞能够将DNA转运至细胞质中，从而获得新的遗传决定因子。对于S. aureus而言，其天然转化能力的存在最近已被证实2。与此一致的是，我们课题组揭示了SigH因子（一种隐匿性的二级转录σ因子）在感受态发育阶段中的表达重要性，并阐明了其组成型表达可使S. aureus进入感受态阶段，从而通过天然转化获得耐药表型2。
接合是一种将DNA从一个活细胞（供体）转移到另一个细胞（受体）的过程。两个细胞必须直接接触，使DNA在特殊结构（如管状或孔状结构）的保护下进行交换。通过此方法转移DNA需要接合装置的参与。在S. aureus中，典型的接合质粒是PGO1，其含有接合操纵子TraA3。
噬菌体转导是指通过噬菌体感染将DNA从一个细胞转移到另一个细胞的过程，其中细菌DNA被包装进入噬菌体衣壳，而非病毒DNA。大多数S. aureus分离株都被噬菌体溶原化1。在应激条件下，前噬菌体可从细菌基因组中切除并转入裂解周期。
这些是 S. aureus 中三种广为人知的 DNA 转移机制。此外还存在一些其他转移机制，例如&#34;拟转化&#34;2 以及在毒力岛转移中的噬菌体样系统4。最近，有研究团队报道了&#34;纳米管&#34;参与邻近细胞间细胞物质（包括质粒 DNA）的转移5,6，但截至目前，其他研究团队尚未发表后续验证研究。
本研究提供了用于探讨金黄色葡萄球菌（S. aureus）中水平基因转移（HGT）的必要方法，涵盖了三种主要的转移途径：接合、转导和自然转化。这些方法所得结果已被用于研究cfr基因（氯霉素/氟苯尼考耐药基因）在S. aureus菌株间的传播7。这三种技术是研究S. aureus中可移动遗传元件（MGE）传播的多功能工具。

<table><tbody><tr><td>胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）&amp;nbsp;</td><td>Becton Dickinson&amp;nbsp;</td><td>211825</td><td></td></tr><tr><td>脑心浸出液（BHI）</td><td>Becton Dickinson&amp;nbsp;</td><td>211059</td><td></td></tr><tr><td>营养肉汤 No. 2</td><td>Oxoid</td><td>CM0067</td><td></td></tr><tr><td>绵羊血琼脂</td><td>Eiken Chemical Co.,Ltd.</td><td>E-MR96</td><td>根据生产商说明，在胰蛋白胨大豆琼脂中添加5%（v/v）绵羊血制成。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>琼脂粉</td><td>和光纯药工业</td><td>010-08725</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸钠（二水合三钠柠檬酸盐）</td><td>和光纯药工业</td><td>191-01785</td><td></td></tr><tr><td>纤维素酯网格0.45 &amp;mu;m HAWG 滤膜</td><td>Merck Milipore</td><td>HAWG 02500</td><td></td></tr><tr><td>QIAfilter 质粒中量提取试剂盒</td><td>QIAGEN</td><td>12243</td><td></td></tr></tbody></table>

staphylococcus aureus中水平基因转移研究的方法学

Methodology for the Study of Horizontal Gene Transfer in Staphylococcus aureus

一种重要机会性人类病原体的关键特征 金黄色葡萄球菌 其非凡的能力是迅速获得对抗生素的耐药性。基因组学研究显示 S. aureus 携带许多位于可移动遗传元件上的毒力基因和耐药基因，表明水平基因转移（HGT）在其中发挥关键作用 S. aureus 进化。然而，目前尚缺乏对用于研究水平基因转移（HGT）的方法学的完整而详细的描述。 S. aureus 仍然缺乏，尤其是在自然转化方面，最近才在该细菌中报道了这一现象。本研究描述了三种适用于该细菌的实验方案 体外 HGT 研究 S. aureus：接合、噬菌体转导和自然转化。为此目的，该 cfr 基因（氯霉素/氟苯尼考抗性），该基因赋予分型酚类、林可酰胺类、噁唑烷酮类、截短侧耳素类和链阳性菌素A（PhLOPSA）抗性表型，被用于研究其作用机制。 S. aureus 将遗传物质转移至其他菌株的能力对于理解耐药性的快速获得至关重要，有助于阐明监测项目中报告的传播模式，或进一步预测未来的扩散方式。

此处展示的结果此前已发表（经出版方许可改编自参考文献7）。我们通过研究三种水平基因转移（HGT）机制，探讨了导致低水平利奈唑胺耐药并表达PhLOPSA耐药表型14,15的cfr基因在S. aureus菌株中的潜在传播途径。
图1 展示了接合实验中获得的结果。该接合实验方案适用于种间传递（A）以及种内传递（B），在不同接合供体中使用相同的接合载体可获得相似的结果。接合效率以 N 表示&#186; 接合子数量（菌落形成单位，或CFU/ml）/N&#186; 受体细胞的菌落形成单位（CFU/ml）。所获得的频率范围为 1 x 10-6 至 1 × 10-5，使用相似数值时 S...

我们在此描述三种不同的方案 体外 接合、转导和自然转化的研究 金黄色葡萄球菌

Staphylococcus aureus中水平基因转移研究的方法学

金黄色葡萄球菌作为主要的机会性人类病原体，其一个重要特征是能够迅速获得对……的耐药性

本实验的总体目标是提供一种详细的方法，用于研究金黄色葡萄球菌中DNA的水平转移，重点针对三种主要的转移途径：接合、转导和自然转化。该方法旨在研究人类病原体金黄色葡萄球菌中抗生素抗性基因的水平转移。本文介绍的技术主要优势在于，我们可以检测三种主要的基因转移模式，包括最近发现的自然遗传转化。演示该实验步骤的是本实验室的博士研究生 Le Thuy。开始实验时，分别用含或不含 32 毫克/升氯霉素的胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）培养基，制备 5 毫升的供体菌和受体菌过夜培养物。在37摄氏度下振荡培养。次日，用新鲜TSB培养基将过夜培养物的光密度调整至1。取0.5毫升供体培养物与0.5毫升受体培养物混合。向混合物中加入一毫升磷酸盐缓冲液（PBS）。然后使用真空泵系统，将细菌混合物转移至0.45微米滤膜上。将滤膜置于羊血琼脂平板上。将培养皿在 37 摄氏度下孵育一天。从培养皿中取出滤膜，并将其悬浮于 10 毫升 PBS 中。涡旋混合约一分钟，以收集附着在膜上的所有细菌。用新鲜的TSB对细菌悬液进行10倍系列稀释。取0、10、4稀释度的样品各100微升，接种于TSB琼脂平板上。或者接种于添加了32毫克/升氯霉素和8毫克/升四环素的TSA平板上，以筛选接合子。将稀释后的菌悬液各取100微升涂布于含8毫克/升四环素的TSA平板上，以计数受体菌总数。培养后，通过菌落PCR检测双重耐药菌落中CFR基因的存在情况，并分析其药敏谱型。根据标准的微量稀释法或纸片扩散法，测定适当抗生素的最小抑菌浓度（MICs），以确定抗菌谱。接合子的敏感性谱必须与受体菌株相同，但氯霉素及其他受CFR基因影响的化合物除外。为了排除供体菌株产生的四环素抗性，用含有 3.6 毫摩尔钙的 5 毫升营养肉汤制备 N315-45 的过夜培养物。将过夜培养物按 1:1,000 的比例稀释，最终体积为 10 毫升，分装至 50 毫升玻璃试管中制备亚培养物。在37摄氏度、180转/分钟振荡条件下培养细菌1小时。随后，在NB氯化钙培养基中制备一系列稀释的噬菌体MR83a。取20微升稀释后的噬菌体加入细菌培养物中。制备未感染噬菌体的对照培养物，作为细菌细胞生长的阳性对照。随后将培养物在37摄氏度、100转/分钟的轻柔振荡条件下过夜培养。次日，选择一至两个噬菌体稀释度最高且培养液最澄清的培养管。将培养物转移至15毫升离心管中。向管中加入250微升氯仿，通过倒置充分混匀培养物。在4摄氏度下，以5,000 × g离心20分钟。将上清液转移至新的离心管中，并在4摄氏度下保存备用。制备营养肉汤琼脂培养基，并将其置于55摄氏度水浴中保温。向培养基中加入经高压灭菌的0.5摩尔氯化钙溶液，使其终浓度为3.6毫摩尔。将其倒入90毫米的NB氯化钙培养皿中。在37摄氏度、摇床条件下，用5毫升NB氯化钙培养基培养N315过夜培养物。次日，取10微升过夜培养物加入200微升NB氯化钙培养基中，均匀涂布于NB氯化钙平板上。当培养皿表面被液体覆盖时停止涂布，随后将培养皿静置干燥五分钟。使用NB氯化钙培养基对先前制备的噬菌体进行10倍系列稀释。将每种噬菌体稀释液各取三微升点样到涂有细菌的平板上。在30摄氏度下过夜培养平板。次日早晨，计数噬菌斑数量，并使用以下公式计算噬菌体滴度。在37摄氏度、180转/分钟振荡条件下，于5毫升含氯化钙的营养肉汤中培养N315、COL或MU50过夜培养物。过夜培养后，将噬菌体用含氯化钙的营养肉汤稀释至10⁹ PFU/毫升。在50毫升玻璃小瓶中，混合500微升过夜培养物、500微升新鲜含氯化钙的营养肉汤和1毫升浓度为10⁹ PFU/毫升的噬菌体。将混合物在37摄氏度下以每分钟100转的温和振荡孵育30分钟。孵育结束后，向培养物中加入50微升20%的柠檬酸三钠。继续在37摄氏度下以温和振荡处理30分钟。制备融化的脑心浸液或 BHI 琼脂培养基，置于 55 摄氏度水浴中保温，并用终浓度为 32 毫克/升的氯霉素处理琼脂培养基。然后将细菌与噬菌体混合物转移至 100 毫升锥形瓶中，加入 50 毫升含有 32 毫克/升氯霉素的温热 BHI 琼脂，充分混匀。将混合物倒入90毫米的培养皿中。在37°C条件下培养平板。通过将生成的菌落（即转导子）转移至添加了32毫克/升氯霉素的新的BHI琼脂平板上，检测其抗性。通过菌落PCR确认CFR基因的存在。将受体细胞在37摄氏度、5毫升TSB培养基中振荡培养过夜。次日早晨，取0.5毫升过夜培养物转移至1.5毫升离心管中。通过离心沉淀细胞。然后在50毫升离心管中用10毫升CS2培养基重悬细胞。接着在37°C、180 rpm振荡条件下培养细菌8小时，直至进入对数生长后期。通过离心收集细胞。弃去上清液，并将细胞重悬于10毫升新鲜CS2培养基中。向细胞悬液中加入10微克纯化的质粒或基因组DNA。以每分钟180转的速度振荡培养物。然后通过离心收集细胞。将细胞重悬于10毫升BHI培养基中。将细胞悬液与90毫升已融化并添加32毫克/升氯霉素和5微克/升四环素的BHI琼脂混合（对照实验）。将混合物倒入90毫米的培养皿中，迅速冷却并使琼脂凝固。使用牙签将菌落转接到含有相应抗生素的平板上进行复制，以确认其抗性特征。该接合转移实验方案适用于种内转移，其中以表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）作为CFR供体，金黄色葡萄球菌N315菌株作为受体。在种间转移中，使用相同的接合质粒载体及不同的接合供体菌株，亦可获得类似结果。这是首篇描述自然转化细节的论文。所提供的方法将有助于研究人员研究抗生素耐药性的传播机制，以及人类病原体金黄色葡萄球菌中的主要决定因素。

methodology-for-study-horizontal-gene-transfer-staphylococcus

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

方法基因水平转移的研究<em&gt;金黄色葡萄球菌</em

来源： Cafini, F., 等水平基因转移研究的方法学 金黄色葡萄球菌. J. Vis. Exp. (2017)本视频通过自然转化展示了金黄色葡萄球菌（Staphylococcus...

Staphylococcus aureus 中的感受态诱导 DNA 摄取

本文介绍了一种敲除参与质粒接合的靶基因并利用接合实验分析其缺失影响的实验方案。通过缺失突变或点突变，进一步将该基因的功能定位至其序列的特定区域。...

用于细菌接合转移蛋白序列特异性分析的接合交配实验

为了理解不同条件下各种细菌接合型DNA元件的行为，我们描述了一种高分辨率检测接合频率差异的实验方案，以评估供体细菌启动接合的效率。...

高分辨率细菌接合频率比较

本文介绍了一种在细胞水平上分析动物组织中细菌基因表达的方法。该方法为研究细菌群体在感染过程中响应组织环境而产生的表型多样性提供了资源。...

一种基于荧光的方法用于研究感染组织中的细菌基因调控

该分析性计算平台为对细菌群体基因组学感兴趣的微生物学家、生态学家和流行病学家提供了实用指导。具体而言，本文展示了如何进行：i）基于系统发育指导的分层基因型作图；ii）基于频率的基因型分析；iii）亲缘关系与克隆性分析；iv）谱系差异性附属基因座的鉴定。...

细菌群体中层级基因型与附属基因组位点的启发式挖掘

接合作用通过在两个不同细胞之间转移质粒DNA介导水平基因转移，促进有益基因的传播。本研究描述了一种广泛使用的方法，用于高效检测接合性质粒的转移，该方法基于在接合性质粒、供体和受体中使用差异标记来检测转接合子。...

由天然接合性质粒介导的水平基因转移检测 E. coli

在本论文中，我们提供了一套全面的实验方案，用于评估铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的抗生素存活能力，通过将质粒转化至铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）和金黄色葡萄球菌（S.

延时落射荧光显微成像 铜绿假单胞菌 和 Staphylococcus aureus 异质性表型

详细介绍了利用滴流反应器和旋转盘反应器构建开放式系统流动生物膜的实验方案。...

用于Staphylococcus aureus生物膜分析的滴流式与旋转盘反应器的使用

小鼠皮肤和软组织感染模型用于评估耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的毒力功能及宿主免疫应答。本文介绍了一种用于皮肤和软组织感染的皮下感染模型。...

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的皮下感染

大鼠耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）实验性心内膜炎模型

了解金黄色葡萄球菌基因水平转移的研究方法，包括接合、转导和自然转化三种途径。本视频演示抗生素耐药基因在病原菌中的传播机制，为微生物学和抗药性研究提供可靠的实验框架。

Staphylococcus aureus中水平基因转移研究的方法学

探索更多视频