Methodology for the Study of Horizontal Gene Transfer in Staphylococcus aureus

该程序的总体目标是通过解决三个主要转移途径，提供一种详细的方法来研究金黄色葡萄球菌中 DNA 的水平传递。偶联、转导和自然转化。该方法是关于人类病原体金黄色葡萄球菌中抗生素耐药基因的水平转移。

这里介绍的技术的主要优点是我们可以测试三种主要的转移模式，包括最近发现的自然遗传转化 演示该程序的将是来自我们实验室的博士生 Le Thuy。为了开始实验，在胰蛋白酶大豆肉汤中准备 5 毫升供体和受体细菌的过夜培养物。或分别含和不含 32 毫克/升氯霉素的 TSB 培养基。

在 37 摄氏度时摇晃。第二天，将过夜培养物的光密度调整为使用新鲜 TSB 培养基的光密度。将 0.5 mL 供体培养物与 0.5 mL 受体培养物混合。

并在混合物中加入 1 毫升磷酸盐缓冲盐水或 PBS。然后使用真空泵系统，将细菌混合物转移到 0.45 微米的滤膜上。将滤膜放在绵羊血琼脂平板上。

将板在 37 摄氏度下孵育一天。从板中取出滤膜，将其悬浮在 10 毫升 PBS 中。涡旋混合物约 1 分钟，以收集附着在膜上的所有细菌。

用新鲜的 TSB 将细菌悬浮液连续稀释 10 倍。将 100 微升 0、10、4 稀释样品铺在 TSB 琼脂上。或者 TSA 板补充每升 32 毫克氯霉素和每升 8 毫克四环素，以选择转偶联物。

100 微升稀释的悬浮液接种到 TSA 平板上，仅含 8 毫克/升四环素。计算收件人总数。孵育后，通过菌落 PCR 分析双抗性菌落是否存在 CFR 基因及其敏感性曲线。

根据标准微量稀释法或纸片扩散法，通过测量适当抗生素的最低抑菌浓度 MIC 来确定抗菌谱。转偶联物的磁敏分布必须与受体相同。氯霉素和其他受 CFR 基因影响的化合物除外。

排除供体菌株产生的四环素耐药性。在 5 毫升补充有 3.6 毫摩尔钙的营养肉汤中制备 N315-45 的过夜培养物。通过在 50 毫升玻璃瓶中将过夜培养物稀释 1 至 1， 000 的最终体积为 10 毫升来制备传代培养物。

将细菌在 37 摄氏度下振荡培养 1 小时，每分钟 180 转。接下来，在 NB 氯化钙培养基中制备一系列稀释的噬菌体 MR83a。将 20 微升稀释的噬菌体添加到细菌培养物中。

制备不含噬菌体感染的对照培养物，作为细菌细胞生长的阳性对照。然后在 37 摄氏度下以每分钟 100 转的速度轻轻摇动培养物过夜。第二天，选择一瓶或两瓶澄清的培养瓶，添加的噬菌体稀释度最高。

将培养物转移到 15 毫升离心管中。向试管中加入 250 微升氯仿，并通过倒置彻底混合培养物。将培养物在 4 摄氏度下以 5， 000 倍 G 离心 20 分钟。

将上清液转移到新试管中，并在 4 摄氏度下储存直至使用。准备营养肉汤琼脂培养基，并在 55 摄氏度的水浴中保温。向培养基中加入高压灭菌的 0.5 摩尔氯化钙溶液，使最终浓度为 3.6 毫摩尔。

将其倒入 90 毫米培养皿 NB 氯化钙板中。在 37 摄氏度下制备 N315 在 5 毫升 NB 氯化钙中摇动的过夜培养物。第二天，将 10 微升过夜培养物加入 200 微升 NB 氯化钙中，并将其均匀涂抹在 NB 氯化钙板上。

当板表面被液体覆盖时停止铺展。然后让板干燥 5 分钟。使用 NB 氯化钙培养基对先前制备的噬菌体进行 1 到 10 的连续稀释。

将每种噬菌体稀释液的 3 微升点到覆盖有细菌的板上。将板在 30 摄氏度下孵育过夜。第二天早上，计算噬菌斑数量并使用以下公式计算噬菌体滴度。

37 摄氏度的 5 毫升 NB 氯化钙中制备 N315、COL 或 MU50 的过夜培养物，并以每分钟 180 转的速度摇动。过夜培养后，将噬菌体在 NB 氯化钙中稀释至每毫升 109 PFU。在 50 毫升玻璃样品瓶中，混合 500 微升过夜培养物、500 微升新鲜 NB 氯化钙和 1 毫升噬菌体 109 PFU/毫升。

将混合物在 37 摄氏度下孵育，以每分钟 100 转的速度轻轻摇晃 30 分钟。孵育后，向培养物中加入 50 微升 20% 柠檬酸三钠。在 37 摄氏度下继续轻轻摇晃 30 分钟。

准备融化的脑心输液或 BHI 琼脂培养基，并将其保存在 55 摄氏度的水浴中，并用每升 32 毫克氯霉素处理琼脂培养基。然后将细菌噬菌体混合物转移到 100 毫升培养瓶中。加入 50 毫升温热的 BHI 琼脂，每升补充 32 毫克氯霉素，并充分混合。

将混合物倒入 90 毫米培养皿中。在 37 摄氏度下孵育板。通过将菌落转移到补充有 32 毫克/升氯霉素的新 BHI 琼脂平板上，进一步测试生成的菌落，即转导剂的抗性。

通过菌落 PCR 确认 CFR 基因的存在。将受体细胞在 37 摄氏度的 5 ml TSB 中振荡培养过夜。第二天早上，将 0.5 mL 过夜培养物转移到 1.5 mL 试管中。

通过离心沉淀细胞。然后用 10 mL CS2 培养基悬浮在 50 mL 试管中。接下来，在 37 摄氏度下以每分钟 180 转的速度摇动细菌，持续 8 小时，直到指数期晚期。

通过离心收获细胞。弃去上清液，将细胞重悬于 10 mL 新鲜 CS2 培养基中。向细胞悬液中加入 10 μg 纯化的质粒或基因组 DNA。

以每分钟 180 转的速度摇动培养物。然后通过离心收集细胞。将细胞重悬于 10 mL BHI 培养基中。

在对照实验中，将细胞悬液与 90 毫升融化的 BHI 琼脂补充剂与 32 毫克/升氯霉素混合，以及每升 5 微克四环素。将混合物倒入 90 毫米培养皿中，迅速冷却并让琼脂凝固。使用牙签将菌落复制到含有适当抗生素的平板上，以确认其耐药特性。

偶联方案可用于使用表皮葡萄球菌作为 CFR 供体的种内传播。并以金黄色葡萄球菌 N315 菌株为受体。用于物种间传递的方案在不同的偶联供体中使用相同的偶联载体产生相似的结果。

这是第一篇描述自然变换细节的论文。所提供的方法将有助于研究人员研究抗生素耐药性的传播和传播，以及人类病原体金黄色葡萄球菌的主要决定因素。