Name: 高度组织的Theta振荡在鼠脑的自动检测 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: 学习使用植入式脑电图无线遥测技术在小鼠海马体中分析药物诱导的高度组织化Theta振荡的方法。该技术结合小波分析进行时间频率检测，有助于理解Theta节律在认知过程中的作用，并可应用于神经退行性疾病研究。

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作者谨此感谢德国神经退行性疾病中心（DZNE）的Christina Ginkel博士和DZNE的Robert Stark博士在动物繁育与动物健康护理方面提供的协助。本研究由德国联邦药品和医疗器械机构（Bundesinstitut für Arzneimittel und Medizinprodukte, BfArM）提供资金支持。

所有动物实验均依照当地及机构动物护理委员会（德国波恩大学、BfArM、LANUV）的指导方针进行。此外，所有动物实验均符合上级法律法规。 例如， 欧盟理事会1986年11月24日指令（86/609/EEC）或个别地区或国家立法。特别致力于尽量减少使用动物数量及其遭受的痛苦。
1. 动物饲养与脑电图记录条件
<ol>
	<li>使用过滤顶笼具饲养小鼠，或使用独立通风笼具。</li>
	<li>将小鼠从动物饲养设施转移至专用实验室内适合植入动物和遥测记录的通风柜中。</li>
	<li>所有动物实验操作，包括脑电图电极植入及后续记录，均应在标准化条件下进行（22 °C 温度，12 h/12 h 光暗循环，50-60% 相对湿度，降噪环境，等）18。</li>
	<li>在植入射频发射器之前，将动物以每笼 3 - 4 只分组饲养于透明 II 型聚碳酸酯笼具中，自由摄食和饮水 ad libitum。切勿单独隔离饲养小鼠，以免引起应激反应，干扰后续实验及结果。</li>
	<li>实验与记录期间不得采用开放式饲养条件，应使用通风柜替代。</li>
</ol>
2. 无线电遥测脑电图电极植入与脑电图记录
<ol>
	<li>使用注射麻醉剂对小鼠进行麻醉， 例如， 盐酸氯胺酮/盐酸赛拉嗪（100/10 mg/kg，腹腔注射，i.p.）或吸入性麻醉药， 例如， 异氟烷17,18.
	<ol>
		<li>对于异氟烷麻醉，将小鼠置于含有4-5%异氟烷和0.8-1%氧气或碳合气（5% CO₂）的诱导室中2 和 95% O₂2).</li>
		<li>将硅胶面罩置于动物的鼻/口部，以控制所需的麻醉深度，并通过废气清除系统避免实验人员接触异氟烷。</li>
		<li>使用可注射麻醉剂， 例如， 氯胺酮盐酸盐（100 mg/kg，腹腔注射）和赛拉嗪盐酸盐（10 mg/kg，腹腔注射），若无吸入麻醉条件时使用。</li>
		<li>通过检查尾部夹捏反射、足部夹捏反射和呼吸频率来监测麻醉深度。注意人工呼吸 通过 在小鼠中，气管插管并非必需。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将射频发射器植入动物背部的皮下囊袋中。
	<ol>
		<li>去除头皮上的毛发，并用两种消毒剂对剃净的头皮进行预处理， 即， 70%乙醇和含碘消毒剂</li>
		<li>使用手术刀从额部至枕部沿中线切开头皮。</li>
		<li>从枕部切口开始，使用手术剪或手术探针进行钝性分离，在动物背部一侧皮下创建一个皮下囊袋。</li>
		<li>将发射器插入皮下囊袋中，并将柔性发射器导线的多余部分一同置入囊袋内。&#160;特别注意防止手术部位和发射器植入物的污染。使用手术单将无菌区域与非无菌区域正确隔开。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将实验动物置于立体定位仪上， 例如， 计算机化的三维立体定位装置。使用鼻夹和耳杆固定头骨。</li>
	<li>用0.3% H预处理颅骨2O2 去除颅骨上的多余组织，以暴露颅缝以及颅骨测量标志点——前囟点（bregma）和人字点（lambda）。</li>
	<li>在选定的坐标位置（见步骤 2.6），使用高速神经外科钻在无压力模式下以最大转速钻孔。 
	注意：无压钻孔可避免钻头突然穿透和损伤皮质。进行开颅手术时，建议使用神经外科高速钻机。根据电极直径选择直径为0.3–0.5 mm的标准钻头。</li>
	<li>仔细选择电极类型，考虑阻抗、直径、涂层等因素。 
	注意：聚对二甲苯涂层的钨电极或不锈钢电极最为常用。应根据实验需求选择合适的电极类型。作为预防措施，植入前需使用70%乙醇对电极尖端进行灭菌。请注意，电极涂层不耐高温，不可采用热灭菌法。</li>
	<li>对于海马CA1区脑电图记录，根据以下立体定位坐标钻孔：前囟，-2 mm；内外侧，1.5 mm（右侧半球）；背腹侧，1.3 mm（靶区：海马角（CA1）锥体层）。参考电极的钻孔位置为小脑皮层上方，立体定位坐标如下：前囟，-6.2 mm；内外侧，0 mm；背腹侧，0 mm。 
	注意：小脑电极用作伪参考电极，因为小脑是一个电活动相对静默的脑区。立体定位坐标取自标准小鼠脑图谱。</li>
	<li>在插入电极之前，将其剪短至所需长度。将电极颅外部分用机械方式夹紧在发射器的不锈钢螺旋结构上。 
	注意：应避免焊接，因为这可能会在系统中引入显著噪声。</li>
	<li>将电极固定在立体定位仪的垂直臂上，并根据前述立体定位坐标插入电极。</li>
	<li>使用玻璃离子体水门汀固定电极，并等待水门汀完全固化。</li>
	<li>使用不可吸收的5-0或6-0缝线材料，采用连续缝合方式关闭头皮。</li>
	<li>术后疼痛管理：植入后连续4天每天皮下注射卡洛芬（carprofen，5 mg/kg）。&#160;请注意，卡洛芬应在初次切口前注射（步骤 2.2.2）。</li>
	<li>植入手术后，让动物恢复10至14天，再开始记录和/或注射实验。</li>
</ol>
3. θ振荡的自发记录与药理学诱导
<ol>
	<li>使用磁性开关激活射频发射器。将动物连同其饲养笼一起放置在接收板上。进行至少24-48小时的长期海马脑电图（EEG）记录。 
	注意：对长期记录的脑电图振幅和脑电图频率特征进行分析，可深入了解θ振荡的昼夜节律依赖性及其与特定行为和认知状态/任务之间的关联。脑电图记录应始终与实验动物的视频监测相结合。</li>
	<li>为药理学诱导θ振荡，可腹腔注射单次剂量的乌拉坦（800 mg/kg，i.p.）或单次剂量的毒蕈碱型受体激动剂，例如匹鲁卡品（10 mg/kg，i.p.）、槟榔碱（0.3 mg/kg，i.p.）或氧 tremorine（0.03 mg/kg，i.p.）。预先给予小鼠N-甲基东莨菪碱（0.5 mg/kg，i.p.）以避免外周毒蕈碱样反应。所有药物均需用0.9% NaCl或林格氏液新鲜配制。&#160; 
	注意：较高剂量的毒蕈碱型受体激动剂可能在实验动物中诱发癫痫发作。此外，此处提供的剂量仅为参考值，需在所研究的小鼠品系中预先开展剂量-效应关系研究。&#160;请注意，乌拉坦是一种具有致突变性和致癌性的物质，在储存和操作时必须采取适当的防护措施。</li>
	<li>注射阿托品（50 mg/kg，i.p.），以区分阿托品敏感的II型与阿托品不敏感的I型θ振荡。 
	注意：阿托品的剂量同样依赖于物种和品系，需事先进行剂量-效应评估。阿托品注射的最佳时间点取决于所用毒蕈碱型受体激动剂的药代动力学。为识别II型θ振荡，建议在给予乌拉坦后1小时注射阿托品。</li>
	<li>应尽量避免连续应用多种药物，因为全身性药物给药会改变整体转录和翻译模式，从而影响后续的脑电图记录。需注意，短暂的θ振荡也可由感觉刺激诱发，例如尾部或足部夹捏。</li>
	<li>根据所用药物的药代动力学及具体研究方案的要求，从完整的脑电图记录中提取或导出给药前阶段（基线期）和给药后阶段的代表性脑电图数据集，并保存为ASCI或TXT文件。</li>
</ol>
4. 验证脑电图电极放置位置
<ol>
	<li>将动物放入孵育室中，并通入100%二氧化碳进行安乐死。以每分钟10-30%孵育室体积的流速将二氧化碳通入孵育室的现有空气中，可使动物迅速失去意识，同时最大程度减少其应激反应。</li>
	<li>当动物呼吸停止且眼色变浅持续2-3分钟后，将其从孵育室中取出。</li>
	<li>剪断不锈钢电极并取出射频发射器。使用剪刀或断头器对小鼠实施断头术，并用手术剪和镊子轻柔操作，将脑组织从颅骨中取出。</li>
	<li>将脑组织在含4%多聚甲醛的磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）中固定过夜。为进行冷冻保护，将脑组织转移至30%葡萄糖溶液中，并于4 °C保存，待后续处理。 
	注意：根据2012年OSHA危险信息通报标准（29 CFR 1910.1200），多聚甲醛被视为有害物质。操作时应采取必要预防措施：使用个人防护装备，确保适当通风，避免粉尘产生。此外，应消除点火源，并采取防静电措施。禁止将多聚甲醛释放到环境中。</li>
	<li>使用粘合剂将取出的脑组织固定在恒冷切片机的组织托上，切成40–75 µm厚的冠状切片。将切片贴附于载玻片上，并采用标准组织学方法用尼氏蓝染色；该步骤可显示反映先前电极位置的通道痕迹。需注意，也可使用振动切片机对未固定的脑组织进行冠状切片。</li>
	<li>仅纳入符合正确脑电图（EEG）电极放置标准的动物；对于CA1区域，深部电极尖端应位于CA1锥体细胞层内。</li>
</ol>
5. 数据采集
<ol>
	<li>以适当的采样率记录CA1区海马内脑电图（EEG），且不预先设置滤波器截止频率。 
	注意：采样率因发射器而异，决定了脑电图分析的最高频率上限。</li>
	<li>使用分析软件处理所记录的数据。通过自行编写的程序进行时频分析和计算，以充分控制分析方法的准确性（图5）20。</li>
	<li>将记录的脑电图数据切割为每段1小时的片段。建议使用高速计算机处理器，因为计算耗时较长。此外，应使用能够在多个计算核心上并行处理的软件20。</li>
</ol>
6. 脑电图数据分析
<ol>
	<li>使用复Morlet小波分析数据段，以计算振荡的频率和振幅。 
	注意：此小波（例如，Ψ(x)=(πb)(−1/2) exp(2iπcx) exp(−x2/b），其中 b 是带宽参数， c 中心频率，以及 i 虚数单位）在文献中常被用于研究脑电图（EEG）数据，因为它能同时在频率和时间上保证最优分辨率23,24.</li>
	<li>使用带宽参数和中心频率设置，特别加强频率分辨率以区分0.1 Hz水平的频率差异，同时仍保持足够的时间分辨率。 
	注意：伽马波段中的神经元活动持续时间较短25，这一原则同样适用于θ节律。因此，分析方法必须考虑足够的时间分辨率。</li>
	<li>在0.2 - 12 Hz的频率范围内分析脑电图（EEG）数据，步长为0.1 Hz，涵盖典型的delta、theta和alpha频段。</li>
	<li>建立一种自动化的复杂分析工具，用于解析theta频率结构，以替代对theta振荡的标准视觉检查；该方法称为theta检测方法（TDM）。</li>
	<li>计算每个2.5秒时间窗内theta频段（3.5–8.5 Hz）最大振幅与高频delta频段（2–3.4 Hz）最大振幅的比值。 
	注意：该商值可作为判断是否发生theta振荡的依据。theta频率范围的定义可能因所分析的功能状态及神经解剖回路/系统而异。</li>
	<li>将一段分类为 &#34;theta振荡片段，&#34; 如果在此阶段计算的比值高于1.5。 
	注意：这可确保在相关的 2.5 秒 EEG 片段中，theta 波段的最大振幅至少比上 delta 波段振幅高出 50%。需注意，该比值可能需根据所用品系和/或物种进行调整。2.5 秒的时间间隔代表 theta 振荡的最短持续时间，可避免对某些噪声较大的片段产生假阳性检测结果，并与其他文献中定义的时间范围一致。19,26上段的δ频率范围作为对照频带，因为生理相关的δ活动出现在非θ节律时期，例如在慢波睡眠期间，而该活动在θ节律期间会受到显著抑制。</li>
	<li>对每个1小时的片段重复此操作；因此，每个片段包含1,440个长度为2.5秒的EEG段。</li>
	<li>对已识别的theta振荡时段的数据进行统计学评估。</li>
	<li>计算检测到的theta事件总持续时间的统计量；不同或预定义的组别；周期（如明/暗周期）；以及其他参数。 
	注意：统计方法可能包括 t 检验、ANOVA 或 MANOVA，具体取决于变量、组别数量及实验条件 等等。</li>
	<li>计算检测到的theta时段振幅的统计量，但仅限于theta频率范围（3.5 - 8.5 Hz）。</li>
	<li>评估检测到的theta节律片段在theta频率范围（3.5 - 8.5 Hz）内的出现频率统计结果。 
	注意：theta节段的theta频率定义为该theta节段中最大theta振幅所对应的频率。</li>
</ol>

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<li>Shin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unifying+theory+on+the+relationship+between+spike+trains%2C+EEG%2C+and+ERP+based+on+the+noise+shaping%2Fpredictive+neural+coding+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biosystems%22%5BJournal%5D)">A unifying theory on the relationship between spike trains, EEG, and ERP based on the noise shaping/predictive neural coding hypothesis.</a> Biosystems. 67, 245-257 (2002).</li>
<li>Kramis, R., Vanderwolf, C. H., Bland, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+types+of+hippocampal+rhythmical+slow+activity+in+both+the+rabbit+and+the+rat%3A+relations+to+behavior+and+effects+of+atropine%2C+diethyl+ether%2C+urethane%2C+and+pentobarbital%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Two types of hippocampal rhythmical slow activity in both the rabbit and the rat: relations to behavior and effects of atropine, diethyl ether, urethane, and pentobarbital.</a> Exp Neurol. 49, 58-85 (1975).</li>
<li>Lu, B. L., Shin, J., Ichikawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+classification+of+single-trial+EEG+signals+using+a+min-max+modular+neural+network%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Massively parallel classification of single-trial EEG signals using a min-max modular neural network.</a> IEEE Trans Biomed Eng. 51, 551-558 (2004).</li>
<li>Robinson, T. E., Kramis, R. C., Vanderwolf, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+types+of+cerebral+activation+during+active+sleep%3A+relations+to+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Two types of cerebral activation during active sleep: relations to behavior.</a> Brain Res. 124, 544-549 (1977).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

θ活动在系统神经生理学中具有核心意义。它可在多个脑区观察到，尤其在海马中最为显著，且与特定的行为和认知状态相关。此外，海马θ节律在药理学上可分为阿托品敏感的II型和阿托品不敏感的I型θ节律。I型被认为与运动行为（如行走或奔跑）相关27,28,29,30,31，而II型则可在警觉静止状态下观察到27,28,29,30。警觉静止状态可通过稀少且随机的声刺激或触觉刺激等方法诱导32。II型θ节律还与被动的全身旋转有关<s...

大脑中的θ活动与多种认知和功能状态相关，包括觉醒、注意力、自主运动、探索行为、注意行为、学习与记忆、躯体感觉整合以及快速眼动（REM）睡眠。1,2主要地，作为节律性活动的θ节律可在多种脑区产生，并以高度有序和同步的方式表现为θ振荡。下文将重点讨论由隔-海马系统产生的θ活动/θ振荡的分析与量化。3,4在隔核内，GABA能、谷氨酸能和胆碱能神经元投射至海马，参与海马θ振荡活动的启动与维持。目前仍存在关于海马θ振荡是否起源于隔核的持续讨论。 即， 隔区起搏器-海马跟随者模型（海马外理论）或海马内在的（海马内理论）5,6,7.
无论其来源如何，海马θ振荡多年来一直是研究关注的焦点，尤其是在转基因小鼠模型中。这些模型允许植入深部脑电图电极，并在特定认知和行为任务下记录海马θ振荡8海马θ振荡在本质上具有异质性。根据所谓的θ振荡二元理论，可以将其区分为阿托品敏感的II型θ振荡和阿托品不敏感的I型θ振荡9,10,11后者通常可由毒蕈碱型M受体1/3 受体激动剂 例如， arecoline、pilocarpine 和 urethane。然而，urethane 是一种多靶点药物，除了激活毒蕈碱受体外，还对其他离子通道产生复杂的效应。对于 II 型 theta 节律，毒蕈碱通路包括 M 受体的激活1/3 以及随后的 Gq/11 Gα介导的磷脂酶Cβ激活1/4 (PLCβ1/4），三磷酸肌醇（InsP3），二酰甘油（DAG），Ca2+以及蛋白激酶C（PKC）。PLCβ的作用1 和 PLCβ4 在使用PLCβ1的基因敲除研究中，in thetagenesis已被验证-/- 和 PLCβ4-/- 表现出θ振荡完全消失或显著减弱的小鼠12,13,14. 额外的 M1，M3，以及 M5 毒蕈碱信号级联的下游靶点（通道/电流）包括多种电导，例如 M 型 K+ 通道（KM) 通过电压依赖性 K+ 通道（Kv7) 慢后超极化钾电流+ 通道（KsAHP）；漏钾通道+ 通道（K泄漏），可能通过TWIK相关酸敏感性K+ 通道（TASK1/3）；阳离子电流（ICAT），可能通过 Na+ 漏通道（NALCN）；以及 Ih 通过超极化激活的环核苷酸门控通道（HCN）。此外，M2/4 乙酰胆碱受体（AChRs）被报道可干扰内向整流钾通道+ 通道 3.1 (Kir3.1）和内向整流K+ 通道 3.2（Kir3.2)15.
目前，市面上可获得的分析软件能够实现基于快速傅里叶变换（FFT）的频率分析，例如，功率（P，mV2）或功率谱密度（PSD，mV2/Hz）分析。仅对θ频段进行功率或功率谱密度（PSD）分析，只能提供其活动的总体概览。然而，若要深入理解与认知和行为相关的θ活动，必须对高度有序的θ振荡进行分析。高度有序θ振荡的评估在神经退行性疾病和神经精神疾病研究领域具有核心重要性。大多数实验性疾病研究采用转基因小鼠模型，并通过高度复杂的神经外科技术记录硬膜外表面和深部脑内脑电图（EEG）。这些技术包括有线连接系统16和无线遥测系统17,18。在长期记录条件下，可记录到自发性及与行为相关的θ振荡。此外，θ振荡还可通过药物诱导产生，也可在动物接受行为或认知任务训练，或暴露于感觉刺激（如尾部夹捏）后记录到。
早期对θ振荡的表征方法由Csicsvari等人描述 等19作者设计了一种用于短期theta分析（15 - 50分钟）的半自动化工具，该工具不适用于长时间脑电图（EEG）记录。本文所述的方法可实现对长时间EEG记录的分析 &#62; 48 h20. Csicsvari 等10 也称为theta-delta比值，但未提供用于确定高度有序theta振荡的阈值。delta和theta频段的定义与我们的频率范围定义一致。由于文中未明确说明，我们推测Csicsvari采用的是基于FFT的方法。 等 计算theta-delta频段的功率。这再次明显不同于我们的方法，因为我们基于小波变换在大量频率尺度上（频率步长Δ(f) = 0.05 Hz）计算振幅，从而获得更高的精度。个体化分析的EEG片段持续时间与我们的定义相似。
Klausberger 等21 还利用θ-δ比值来分析长时程脑电图记录。然而，与我们的方法相比存在三个主要差异：i）脑电图片段的持续时间要长得多， 即， 至少6秒；ii）设定的theta-delta比值为4，远高于我们的阈值，且与不同的频率范围定义相关；iii）其功率定义可能基于FFT方法，该方法缺乏高精度，尤其对于极短的时间窗（2秒） 即， 5 个周期的 2.5 Hz 频率振荡）。在此类情况下，基于小波的分析方法更为推荐。Caplan 的一项研究 等22 仅计算了θ波功率，而忽略了θ波与δ波功率的比值。因此，卡普兰（Caplan）方法22 无法区分伴随高δ波或低δ波的认知性θ波丰富过程。
在以下实验方案中，我们将介绍一种基于小波分析的可靠方法，用于分析小鼠海马脑电图（EEG）记录中高度有序的θ振荡。由于该方法可自动运行，因此适用于大规模数据集和长期脑电图测量。

<table><tbody><tr><td>卡洛芬（Rimadyl VET - 注射液）&amp;ouml;孙</td><td>辉瑞</td><td>PZN 0110208208</td><td>20ml</td></tr><tr><td>双目手术放大显微镜</td><td>蔡司 Stemi 2000</td><td>0000001003877, 4355400000000, 0000001063306, 4170530000000, 4170959255000, 4551820000000, 4170959040000, 4170959050000</td><td></td></tr><tr><td>右泛醇（Bepanthen Wund- und Heilsalbe）</td><td>拜耳</td><td>PZN: 1578818</td><td></td></tr><tr><td>无菌手术巾</td><td>Hartmann</td><td>PZN 0366787</td><td></td></tr><tr><td>70% 乙醇</td><td>卡尔·罗特</td><td>9065.5</td><td></td></tr><tr><td>0.3% / 3% 过氧化氢溶液</td><td>Sigma</td><td>95321</td><td>30% 储备液</td></tr><tr><td>手套（无菌）</td><td>Unigloves</td><td>1570</td><td></td></tr><tr><td>牙科玻璃离子水门汀</td><td>KentDental /NORDENTA</td><td>957 321</td><td></td></tr><tr><td>基于热力的手术器械灭菌器</td><td>F.S.T.</td><td>18000-50</td><td></td></tr><tr><td>高速牙科钻机</td><td>Adeor</td><td>SI-1708</td><td></td></tr><tr><td>吸入麻醉系统（异氟烷）</td><td>哈佛仪器有限公司</td><td>34-1352, 10-1340, 34-0422, 34-1041, 34-0401, 34-1067, 72-3044, 34-0426, 34-0387, 34-0415, 69-0230</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Baxter 250 ml</td><td>PZN 6497131</td><td></td></tr><tr><td>氯胺酮</td><td>辉瑞</td><td>PZN 07506004</td><td></td></tr><tr><td>乳酸林格氏液（无菌）</td><td>布劳恩</td><td>L7502</td><td></td></tr><tr><td>尼氏染色液</td><td>Armin Baack</td><td>BAA31712159</td><td></td></tr><tr><td>无菌垫</td><td>ReWa 医院用品</td><td>2003/01</td><td></td></tr><tr><td>钢和钨电极聚对二甲苯涂层</td><td>FHC 公司，美国</td><td>UEWLGESEANND</td><td></td></tr><tr><td>立体定位仪</td><td>Neurostar</td><td>51730M</td><td>在 Stoelting 公司订购</td></tr><tr><td>（立体定位仪-新型电动立体定位系统）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>胶带（无菌）</td><td>BSN medical GmbH &amp;amp; Co. KG</td><td>626225</td><td></td></tr><tr><td>TA10ETA-F20</td><td>DSI</td><td>270-0042-001X</td><td>射频发射器 3.9 g，1.9 cc，输入电压范围 &amp;plusmn; 2.5 mV，通道带宽（B）1 - 200 Hz，标称采样率（f）1,000 Hz（f = 5B），工作温度范围 34 - 41 &amp;deg;C级电池续航时间为4个月</td></tr><tr><td>TL11M2-F20EET</td><td>DSI</td><td>270-0124-001X</td><td>射频发射器 3.9 克，1.9 立方厘米，输入电压范围 &amp;plusmn; 1.25 mV，通道带宽（B）1 - 50 Hz，标称采样率（f）250 Hz（f = 5B），工作温度范围 34 - 41 &amp;deg;C级电池续航时间1.5个月</td></tr><tr><td>Vibroslicer 5000 MZ</td><td>电子显微镜科学公司</td><td>5000-005</td><td></td></tr><tr><td>赛拉嗪（Rompun）</td><td>拜耳</td><td>PZN: 1320422</td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks 公司</td><td></td><td>编程、计算与可视化软件</td></tr><tr><td>SPSS</td><td>IBM</td><td></td><td>统计分析软件</td></tr></tbody></table>

小鼠脑电图中高度有序θ振荡的自动检测

Automatic Detection of Highly Organized Theta Oscillations in the Murine EEG

θ活动产生于隔-海马系统，可通过深部海马电极结合可植入式脑电图（EEG）遥测或系线系统进行记录。从药理学角度而言，海马θ节律具有异质性（参见双元理论），可分为I型和II型θ节律。这两种脑电亚型分别与特定的认知和行为状态相关，例如觉醒、探索、学习与记忆、高级整合功能等。在阿尔茨海默病等神经退行性疾病中，隔-海马系统的结构和功能改变可能导致θ活动/振荡受损。对海马脑电图进行标准定量分析通常包括基于快速傅里叶变换（FFT）的频率分析。然而，该方法无法提供关于θ活动总体情况，尤其是高度有序θ振荡的详细信息。为了获得海马中高度有序θ振荡的详细信息，我们开发了一种新的分析方法。该方法能够高效、经济地量化高度有序θ振荡的持续时间及其频率特征。

θ活动可在中枢神经系统（CNS）的多个区域中记录到。本文介绍了小鼠海马区θ振荡的分析方法。此类振荡可出现在不同的行为和认知状态下。建议在自发性长期、任务相关性短期以及药物诱导条件下均对θ振荡进行分析。 
图1展示了在对照条件下海马CA1区的代表性场电位记录。若动物未处于自发的“θ状态”，海马区脑电图（EEG）通常表现为大而不规则振幅（LIA）活动。给予毒蕈碱型受体激动剂（例如，槟榔碱、匹鲁卡品或尿烷）后，可诱导出高度有序的θ振荡，该振荡可被阿托品（50 mg/kg，腹腔注射）阻断（图1）。
为了以适当的时间分辨率量化高度有序的θ振荡，使用θ检测工具将2.5秒的脑电图（EEG）片段分类为θ负性或θ正性（图2）。基于此分类，可量化在自发状态或特定行为与认知任务下θ振荡的总持续时间。
<p class="jove_conten...

海马体中的θ活动与特定的认知和行为阶段相关。本文介绍一种利用时频分析方法检测海马体内高度有序θ振荡的分析技术。即， 基于小波分析的方法

Theta活动由隔-海马系统产生，可通过深部海马内电极和可植入式……记录

本实验的总体目标是利用可植入式脑电遥测技术，分析小鼠中由药物诱导的高度有序θ节律振荡。该方法有助于回答系统神经科学领域中的关键问题，例如如何通过长期海马脑电遥测记录来诱导、检测和量化小鼠脑电图中的高度有序θ节律振荡。该技术的主要优势在于，能够对大规模的小鼠海马脑电记录中的高度有序θ节律振荡进行有效分析。该技术的意义延伸至阿尔茨海默病等神经精神疾病和神经退行性疾病的治疗，因为此类疾病常伴随θ节律异常等频率改变。尽管该方法可为小鼠海马θ节律异常提供深入见解，但在适当调整后，亦可应用于其他物种（包括人类）的脑电图记录。通常情况下，若实验流程尚不成熟，该方法可能面临困难，因为θ振荡的检测分析依赖于恰当的脑电电极植入和θ节律诱导。在插入电极之前，从电极尖端刮除聚对二甲苯涂层。接着，将电极的颅外部分通过机械方式夹在发射器的不锈钢螺旋上，并将其剪短至所需长度。植入射频发射器时，将麻醉后的小鼠置于手术台上，并通过面罩持续向动物输送异氟烷。通过检查尾部夹捏反射、足部夹捏反射及呼吸频率来确认麻醉深度。随后，去除头皮部位的体毛，并用70%乙醇和含碘消毒液对剃净的头皮进行消毒。随后，使用手术刀从额部至枕部沿中线在头皮上做一切口。然后，用手术剪在动物背部一侧进行皮下分离，创建一个皮下囊袋。接着，将发射器插入该皮下囊袋中，并将柔性发射器导线的多余长度一同置入囊袋内。随后，使用鼻夹固定颅骨。然后将实验动物置于立体定位仪上，并安放耳杆。将0.3%的过氧化氢涂抹于颅骨，以去除任何残留组织，并有助于观察颅骨缝及颅骨测量标志点，如前囟点（bregma）和后囟点（lambda）。接下来，使用高速神经外科钻在无压力模式下以最大转速根据所选坐标钻孔。选择合适的电极，并在植入前用70%乙醇对电极进行消毒。应根据实验要求仔细选择电极类型。通常，聚对二甲苯涂层钨电极或不锈钢电极最为常见。随后，使用玻璃离子体水泥固定电极，并等待水泥完全固化。接下来，使用不可吸收缝合线以间断缝合方式缝合头皮。术后镇痛管理采用皮下注射卡洛芬，植入后连续给药四天，每天一次。动物术后需恢复10至14天，方可进行记录或注射实验。在此操作中，使用磁性开关激活射频发射器。进行至少24至48小时的长期海马脑电图（EEG）记录。对长期记录的脑电图振幅和脑电图频率特征进行分析，可深入了解θ振荡的昼夜节律依赖性，及其与特定行为、认知状态或任务之间的关联。为了药理学诱导θ振荡，需预先用甲基东莨菪碱处理动物，以避免外周毒蕈碱样反应。随后，向小鼠给予单次剂量的乌拉坦或毒蕈碱受体激动剂以启动θ振荡。约60分钟后，注射阿托品，以区分对阿托品敏感的Ⅱ型与对阿托品不敏感的Ⅰ型θ振荡。继续记录。为验证脑电图电极的放置位置，剪断不锈钢电极并移除射频发射器。然后处死小鼠，并从颅骨中取出脑组织。为了验证电极放置位置，使用粘合剂将取出的脑组织固定在振动切片机的组织架上，然后将脑组织切成100 µm厚的冠状切片。将切片置于玻片上，并采用标准组织学方法用尼氏蓝染色。只有当动物符合正确的脑电图电极放置标准时，才将其纳入分析。对于CA1区域，深部电极的尖端应位于CA1锥体细胞层内。上传脑电图数据。这是一段典型的30分钟脑电图（EEG）片段。请使用此处显示的复数Morlet小波函数进行时频分析。进行时频分析时，频率范围设置为0.2至12 Hz，步长设置为0.1 Hz。该脑电图片段的时频图以颜色编码形式展示，体现了theta频段和较高delta频段的活动范围。此处对提取的2.5秒脑电图（EEG）片段进行theta节段分析。由于theta频段的最大振幅与上delta频段最大振幅的比值大于1.5，因此该片段被归类为theta振荡片段。这确保了在计算的EEG片段中，theta频段的最大振幅至少比上delta频段的振幅高50%。该图展示了高度有序的θ振荡与脑电图（EEG）记录中θ波检测指标之间的相关性，其中θ振荡片段可进行量化并进行统计分析。此处为两个持续2.5秒的EEG片段，分别被视觉分类为非θ波段和θ波段。下方为CA1区EEG片段的时频分析结果，对应上方图示中0.2至12 Hz范围内的显示。通过颜色编码表示振幅，非θ波EEG片段的时频分析在时间维度上显示出频率规律波动的θ波结构特征。而具有高度同步化θ振荡的脑电段则表现为振幅稳定、频率接近恒定的6 Hz高振幅θ节律。该图中最大θ振荡与最大δ振荡振幅的比值为1.25，而此图中该比值为4.67。显然可将此段脑电图归类为θ振荡脑电段。一旦掌握该技术，若操作得当，可在一小时内完成。采用此方法后，可进一步进行其他分析，例如对其他频段进行时频分析或自动癫痫发作检测，以回答诸如其他脑电频段是否受到影响、它们如何耦合以及与神经元过度兴奋性的关系等问题。该技术建立后，为系统神经科学领域的研究人员探索转基因小鼠模型（如阿尔茨海默病小鼠模型）中海马θ节律结构的改变提供了重要途径。观看本视频后，您应能够充分理解如何诱导、检测和分析高度有序的θ振荡。

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科研

JoVE Journal

Behavior

行为

高度组织的Theta振荡在鼠脑的自动检测

本视频展示了一种在遗传工程小鼠模型中通过光敏离子通道调控其GABA能内侧隔核神经元θ振荡的实验方案。通过向海马体传递光脉冲，该方案旨在同步神经元活动并产生θ振荡，并以局部场电位的形式进行记录。...

选择性调控小鼠模型中的θ振荡

本视频展示了在离体海马组织中记录节律性神经元网络活动（也称为θ振荡）的方法。通过将电极插入不同的层次和空间位置，以检测和分析θ振荡，从而揭示海马不同层次中神经元组成的特异性以及神经网络之间的连接性。...

小鼠海马体中θ振荡的体外记录

在自由活动的小鼠中记录脑电图（EEG）和肌电图（EMG）是将行为与睡眠和觉醒的生理状态相关联的关键步骤。本文所述的实验方案提供了一种基于电缆的系统，用于在小鼠中获取脑电图和肌电图记录。...

用于测量小鼠睡眠的多导生理记录操作流程

高频振荡（HFOs）已作为术前生物标志物，用于识别药物难治性癫痫儿科患者中的致痫区。本文介绍了一种通过同步头皮脑电图（EEG）和脑磁图（MEG）无创记录、检测和定位HFOs的方法学。...

同时采用脑磁图与脑电图检测的发作间期高频振荡作为小儿癫痫的生物标志物

本文展示了针灸操作、癫痫模型的建立以及啮齿类动物睡眠分析的方法。文中描述了针灸操作过程及穴位的定位。采用匹罗卡品或戊四氮（PTZ）诱导癫痫发作。通过皮层脑电图（ECoG）、肌电图（EMG）、脑温及运动活动记录来进行睡眠分析。...

通过针灸调控大鼠和小鼠的癫痫样皮层脑电图（ECoG）及睡眠

本文介绍了描述小鼠非快速眼动睡眠期间神经和心脏变量时间动态的实验与分析方法，这些变量可调节睡眠对声学刺激的反应性。...

量化睡眠小鼠谱功率与心率的极慢动态变化

我们描述了在行为小鼠中利用光遗传学和电生理记录技术选择性操控海马θ振荡（5-10...

行为小鼠中海马θ振荡的光遗传学同步

本方案提供了一个开源的、已编译的 MATLAB...

基于计算机的多窗谱图程序用于脑电图数据

通过同步视频-脑电图-心电图-血氧饱和度-二氧化碳监测，我们建立了一种评估兔模型诱发心律失常和癫痫发作易感性的方法。这一新型记录系统为测试治疗药物的有效性和安全性提供了平台，并能够捕捉最终导致猝死的多系统复杂事件级联过程。...

用于识别清醒束缚家兔癫痫发作、心律失常和呼吸暂停的多系统监测

本方案旨在建立一种可靠且易于操作的系统，用于记录自由活动啮齿类动物的脑电图（EEG）。...

一种经济高效且微创的自由活动小鼠多部位慢性脑电图记录方案

学习使用植入式脑电图无线遥测技术在小鼠海马体中分析药物诱导的高度组织化Theta振荡的方法。该技术结合小波分析进行时间频率检测，有助于理解Theta节律在认知过程中的作用，并可应用于神经退行性疾病研究。

小鼠脑电图中高度有序θ振荡的自动检测

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