可调谐的肺部细胞外基质水凝胶用于三维细胞培养

该方法的总体目标是制备定制化的水凝胶，以研究能够模拟肺细胞外基质复杂性的细胞及培养条件。该方法有助于回答肺部研究领域中的关键问题，例如肺细胞在健康和病理条件下如何与细胞外基质（ECM）相互作用。该技术的主要优势在于，肺ECM水凝胶可根据2D或3D培养的具体应用需求进行定制化调整。

通常，由于脱细胞技术较为复杂，初次接触该方法的研究人员可能会遇到困难，有时需要多人协作并注重细节，以优化可存活组织的产量。对于本方案，需准备一个可供脱细胞处理的猪肺。其具体制备步骤详见文字版方案。

肺组织准备好后，使用连接至肺动脉的手动泵。首先向血管系统灌注约一升水，然后向气管内灌注1.5升水。重复此操作三次，随着细胞碎片被清除，逐步增加灌注水量。

接下来，使用手动泵以Triton X-100灌注组织。然后，将组织浸入4摄氏度的Triton X-100溶液中，孵育24小时。24小时后，用蒸馏水冲洗血管系统和气管三次。

清洗后，使用手动泵以脱氧胆酸盐灌注组织，随后将组织浸入脱氧胆酸盐中，在 4 °C 下孵育 24 小时。次日，用蒸馏水冲洗组织三次，操作同前。

清洗后，使用手动泵将过滤过的氯化钠溶液灌注到组织中。然后将组织浸入过滤过的氯化钠溶液中，在 4 摄氏度下孵育一小时。孵育结束后，用蒸馏水对血管系统和气管进行三次灌注以清洗。

洗涤后，用 DNase 溶液灌注组织，然后将其浸入 DNase 溶液中，在 4 摄氏度下孵育一小时。一小时后，用 PBS（而非水）对血管和气管灌注五次。此时，仅使用不透明的白色组织，剔除所有直径为 2 毫米或更大的小管结构。

它们主要分布在肺门及肺的内侧部分。保留主要位于外周的呼吸区，保持其完整。去除小管后，将组织切成一英寸或更小的节段。

这些组织块的方向并不重要。在沥干组织块后，将其转移至一个50毫升的锥形管中，并在-80摄氏度下冷冻。可留出少量组织块用于组织学分析，以确认细胞和碎片已被清除。

为了将肺组织处理成脱细胞粉末，将装有冷冻组织的管子的管盖替换为滤纸，并用橡皮筋固定。然后，按照制造商的说明，使用冷冻干燥机对组织进行冻干，直至所有多余液体完全去除。随后，将组织在 -80 摄氏度下保存，直至进行研磨。

为准备研磨仪，首先向其中加入液氮，注意留出空间以容纳研磨管。接着，从研磨管中取出磁性研磨棒，并用组织样覆盖管底。然后，将研磨棒放回，并松散地填入更多组织样以填满研磨管。

然后，关闭研磨管，将其放入冷冻研磨机中，并加入液氮至其最大容量。接着以每分钟约600次的撞击速率运行研磨机约五分钟。之后，将脱细胞粉末储存于-80摄氏度，直至后续使用。

制备预凝胶材料时，将脱细胞组织粉末和胃蛋白酶加入一个锥形管中。然后向管中加入0.01摩尔的盐酸，使脱细胞组织粉末的终浓度为1%，胃蛋白酶的终浓度为0.01%。将该溶液在室温下持续振荡孵育48小时，以消化组织。

48 小时后，将溶液置于冰上 5 分钟。然后使用冷的 0.1 摩尔氢氧化钠将溶液的 pH 调整至 7.4，再通过加入 10X PBS 将溶液的 PBS 浓度调整至 1X。我们在调整预凝胶的时间和 pH 方面有一些经验。

可使用的范围具有一定灵活性，但如果对操作步骤进行微小改动，材料的性质可能会发生显著变化。该溶液尚未达到预凝胶状态，可用于包被未经处理的培养板以形成供细胞贴附生长的水凝胶，或形成供细胞包埋生长的水凝胶；也可在形成水凝胶前进一步修饰以提高水凝胶的刚性。如需在二维微孔凝胶涂层上培养细胞，可在96孔未经处理的组织培养板的孔中加入20微升预凝胶溶液。

然后，将培养板在4°C下冷藏过夜，使蛋白质吸附到培养板上。第二天，吸除预凝胶溶液，并用PBS清洗各孔。随后，向每个孔中加入3200个细胞，并将各孔的培养基体积补足至100 µL。

随后可将培养板进行孵育。对于包含细胞的微孔凝胶三维细胞培养，将目标细胞以每毫升一百万个的密度重悬于预凝胶溶液中。然后，迅速将16微升细胞悬液加入96孔板的每个孔中，形成厚度约为500微米的三维细胞培养体系。

在37摄氏度孵育30分钟后，凝胶将形成。凝胶形成后，向孔中加入培养基至100 µL刻度线处。若需在微孔凝胶表面进行三维细胞培养，请将100 µL预凝胶溶液加入未经处理的96孔板的孔中。

然后，将培养板在37摄氏度下孵育30分钟以使凝胶形成。一旦凝胶形成，在水凝胶上层加入3,200个细胞及100微升培养基，继续孵育培养板。水凝胶系采用所述方法从正常猪、大鼠和小鼠肺组织制备而成。

流变学测试证实，在达到37摄氏度后的最初几分钟内，超过90%的凝胶化过程已经完成。形成的水凝胶在磷酸盐缓冲液（PBS）中可长期保持稳定，但细胞黏附和增殖可能随时间发生变化。预凝胶溶液被测试用作编码以改善细胞黏附。

采用MTTSA检测人脐静脉内皮细胞的黏附与增殖。通过在孔板表面包被细胞外基质（ECM），可观察到细胞黏附和增殖的改善。在制备三维凝胶时，加入京尼平可增强水凝胶的交联。

通过流变仪进行频率扫描，水凝胶的刚度与京尼平浓度直接相关，其中位数及最具代表性的浓度为0.01%。在测试更刚性的凝胶时，通过MTTSA检测发现交联程度更高的凝胶上细胞增殖率更高。掌握该技术后，脱细胞过程可在四天内用八小时完成；预凝胶溶液可在两天内用一小时制备，凝胶形成则可在两天内用两小时完成。

采用此方法后，还可进行其他实验，如原子力显微镜（AFM）、蛋白质印迹（western blots）、染色以及免疫组织化学，以回答更多问题，例如材料的弹性模量、蛋白质组成以及细胞对材料的响应。