分析营养补充剂在实验性结肠炎期间对肠道上皮屏障功能的有益作用

本实验方案的总体目标是评估补充性营养素在葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠结肠炎模型中的作用。该方法有助于解答肠道免疫学领域中的关键问题，推动结肠炎模型实验方向的临床科学发展。该技术的主要优势在于成本低、无需复杂设备，并可对整个结肠的形态学进行清晰分析。

该方法可用于评估因中性粒细胞过度募集而在结肠中产生的氧化应激。通过灌胃给予营养补充剂时，首先用手抓住小鼠颈背部皮肤，将尾巴置于无名指与拇指根部之间以固定小鼠。接着，保持小鼠直立姿势，将灌胃针从动物口腔左侧插入，并沿上颚小心推进以定位食管。

若无阻力，将针头推进至胃部。缓慢注入全部补充剂，随后小心拔出注射器，并测量动物的体重。根据体重减轻的百分比，评分为0到4分，然后采集新鲜粪便样本，使用提供的采样棒将样本均匀涂抹于愈创木脂粪便隐血检测试剂盒的载玻片上。

关闭试剂盒正面的盖子，并打开背面窗口，向样本位置的背面加入两滴显色液。30秒后读取结果，根据信号强度赋予0至4分的评分。随后观察第二份新鲜粪便样本以评估粪便性状，根据实际情况赋予0至4分的评分。

为了测定体内肠道上皮通透性，将麻醉后的动物置于仰卧位，做正中切口以暴露肠道。找到盲肠，在升结肠近端部分做一小切口。然后插入一支22号饲喂针头，并用普通丝线结扎固定针头。

用大量 PBS 缓慢冲洗针头，以清洗结肠内所有粪便，随后注入伊文思蓝溶液，直至染料到达肛门。15 分钟后，用过量 PBS 冲洗导管，直至肛周冲洗液变澄清。然后切除结肠，并用更多 PBS 冲洗组织，接着加入 1 毫升 6 毫摩尔的 N-乙酰半胱氨酸，以去除黏附在结肠黏液上的任何染料。

现在将结肠纵向切开，再用 PBS 和 N-乙酰半胱氨酸冲洗组织一次，然后记录结肠的重量和长度，并将组织置于 2 毫升 N,N-二甲基甲酰胺中，在室温下轻轻振荡，以提取残留染料，次日上午在 610 纳米波长处通过分光光度法测定染料浓度。在给予葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导结肠炎 7 天后，分离整个结肠并记录其长度。对于瑞士卷切片法，将结肠纵向打开，仔细清除任何粪便物质，然后使用细圆木棒或尖头镊子将组织卷起，使黏膜面朝向内侧。

然后小心地将组织放入包埋盒中，并加入5 mL 10%甲醛在室温下固定。将结肠紧密卷起而不折叠至关重要，以避免在组织切片过程中出现问题，否则可能导致临床组织损伤，并被误判为与结肠炎相关的损伤。48小时后，用自来水冲洗样本18小时，随后通过乙醇系列进行脱水处理。

最后一次浸入无水乙醇后，将组织在二甲苯中进行四次每次一小时的孵育。最后一次二甲苯浸入后，将样品置于50毫升液体石蜡中，进行一次17小时和一次3小时的孵育。3小时孵育结束后，将样品浸入装有8至10毫升新鲜液体石蜡的22立方毫米方形塑料模具中，孵育24小时。

待石蜡完全凝固后，使用切片机获取五微米厚的组织切片，随后将切片短暂浸入含有0.3%明胶的1升水浴中，并立即转移至经多聚赖氨酸处理的载玻片上，用于苏木精-伊红（H&E）染色。进行氧化应激分析时，首先使用疏水笔在组织周围划出屏障。接着，将八微米厚的组织冷冻切片在避光条件下，于37摄氏度下与五微摩尔浓度的二氢乙啶（DHE）水溶液共同孵育30分钟。

孵育后，在室温下用 PBS 轻轻振荡洗涤三次，每次 15 分钟。将样品空气干燥，加入一滴封片剂以保护荧光信号。随后在激光扫描共聚焦显微镜下以 40 倍放大倍数观察氧化乙啶的荧光。

DSS处理导致疾病活动指数持续升高，符合预期，并在诱导后第7天达到最高分值。抗炎饮食补充可延缓结肠炎的早期发病，但其保护作用在后期时间点仅略为明显。饮食干预还可能防止DSS诱导的肠道上皮通透性增加以及结肠长度缩短。

对石蜡包埋的远端结肠组织进行苏木精和伊红染色显示，对照组样本呈现正常形态，而经DSS处理的动物则表现出典型的结肠炎特征。值得注意的是，同时进行饮食补充可明显缓解结肠炎引起的形态学改变，整体形态接近对照组。远端结肠组织的免疫荧光染色还表明，在DSS诱导的结肠炎过程中，紧密连接和黏附连接分子发生内化，且这些蛋白在隐窝上皮细胞接触部位的共定位部分丧失。

重要的是，当DSS处理的小鼠接受抗炎和抗氧化饮食补充剂时，这种内化作用会减弱。此外，补充饮食可抑制DSS诱导结肠炎后中性粒细胞向结肠的大量募集，从而同时缓解中性粒细胞引起的氧化应激，并轻微减少炎症细胞因子的产生。在此操作之后，可进行其他方法，如使用溢出室（oozing chamber）测量，以分析结肠上皮屏障的电阻。

该技术建立后，为结肠炎研究领域的科研人员提供了有力工具，有助于在可重复的小鼠模型中探索溃疡性结肠炎发病的分子机制。观看本视频后，您应能够充分理解如何分析结肠炎的发展过程，以及营养补充剂对肠上皮屏障功能的有益作用。请务必注意，使用活体动物进行实验必须遵循严格的伦理标准，以避免造成不必要的痛苦。