通过有氧运动在小鼠中激活自噬

本实验的总体目标是通过强制或自主跑步在小鼠体内生理激活自噬，随后检测特定组织中自噬的水平。该方法有助于回答关于自噬的关键问题，特别是自噬及其活动如何介导有氧运动带来的有益效应。该技术的主要优势在于，体育运动是一种在小鼠体内快速诱导自噬的有氧调节方式。

本实验使用八至十二周龄的 C57 black six 小鼠，该小鼠携带一种转基因，可用于在体内检测运动诱导的自噬，即 GFP-LC3。关于小鼠跑台使用的详细信息，请参见以下 JoVE 出版物。将跑台的电刺激强度设置为低强度。

在前两次训练中，使小鼠适应十度斜坡的开放式跑步机。第一天，以每分钟8米的速度让小鼠在跑步机上运动5分钟。第二天，先以每分钟8米的速度让小鼠跑5分钟，随后将速度提升至每分钟10米，总运动时间为10分钟。

第三天，让小鼠连续跑90分钟。将跑步机速度设为每分钟10米，通过轻柔的触碰刺激小鼠奔跑，以避免反复的足部电击。在90分钟跑步过程中，必须密切观察并适当干预小鼠，防止其受到过多电击。

在整个运行过程中，用手指轻触小鼠以促使其保持在跑轮上。40分钟后，将速度每分钟增加1米。50分钟后，再次将速度每分钟增加1米。

60 分钟后，再将速度增加 1 米/分钟。70 分钟后，开始每 5 分钟增加一次速度，使 90 分钟跑步的最后 5 分钟速度达到 17 米/分钟。试验结束后，如需取组织样本，应立即处死小鼠。

进行此实验时，将小鼠单独饲养。使用与前述相同的品系。准备一个直径为11.4厘米的小鼠跑轮，并连接自行车计程表。

每次旋转应记录为358毫米的行进距离。将小鼠放入含有转轮的笼子中，让其自由使用两周。每24小时，从里程表记录小鼠跑动的距离。

两周后，根据需要收获组织进行分析。为检测自噬流，用自噬抑制剂氯喹处理小鼠三天。将氯喹溶于磷酸盐缓冲液（PBS）中，浓度为每毫升5毫克，按每克体重50微克的剂量腹腔注射给药。

连续三天每天给小鼠注射一次，并在最后一次注射后三小时采集组织。对于跑步机运动的小鼠，在第三天注射后90分钟开始90分钟的跑步，使跑步在注射后三小时结束。随后处死小鼠并立即采集其组织。

在动物接受实验处理后的90分钟内，通过准备固定液开始灌注。用15至20毫升新配制的4%多聚甲醛充满一支30毫升注射器，并将该注射器连接至20号导管针。将装有液体的注射泵连接好，并设置为以每小时90毫升的速度持续灌注。

将动物置于清洁的工作台面上，呈仰卧位，从膈膜处切开胸腔以暴露心脏。随后，将导管针插入右心室。接着，在肝脏上做一小切口以排出血液，并启动泵。

注入固定液，直至肺和肝脏完全变为苍白色。通常，15 毫升固定液已足够。灌注完成后，拔出针头，采集所需组织。

为获取骨骼肌，需解剖股外侧肌。轻轻向后牵拉腿部皮肤以暴露肌肉并定位股四头肌。随后分离出股外侧肌，该肌肉是附着于股骨上段的外侧肌肉。

为进一步固定和脱水，将收获的组织置于4%多聚甲醛中，在4摄氏度下保存24小时。次日，将组织转移至15%蔗糖磷酸盐缓冲液（PBS）中，在4摄氏度下浸泡过夜，或直至组织完全沉入溶液底部。随后，将组织转移至30%蔗糖PBS溶液中，在4摄氏度下继续浸泡过夜或更长时间。

在这些浸泡过程中，应尽可能将组织置于避光环境中。接下来，将组织放入包埋介质（如OCT）中，必要时切成较小的片块。然后，将其置于小型培养皿中，静置数分钟以适应环境。

随后，将样本转移至包埋盒中，并加入足量的OCT包埋剂以完全覆盖。在包埋盒中，使切面朝下放置，并避免产生气泡。然后，将样本置于装有干冰且加盖的泡沫盒中冷冻，直至OCT变为白色。

现在，将单个样品用标记好的铝箔包裹，密封于塑料袋中，并在可进行处理前于负80摄氏度保存。使用GFP标记的LC3作为报告系统，观察到按照所述方法进行运动的小鼠中自噬被诱导。自噬刺激后，LC3从细胞质易位至自噬体，形成点状结构。

运动小鼠的骨骼肌和大脑皮层中GFP-LC3点状结构数量明显多于静息状态小鼠。使用LC3抗体进行的Western blot分析显示，运动显著促进了脂质结合型LC3-II的生成，提示胞质中的LC3-I向LC3-II的转化增加。随后，检测了自噬 cargo 受体p62的降解情况。

与静息状态相比，90分钟的跑步机运动导致骨骼肌中p62的降解程度更高。在运动前注射氯喹可逆转这一效应。由于氯喹是溶酶体降解的抑制剂，这些数据表明所观察到的现象是由于自噬流增强所致，而非自噬体降解受阻。

该技术在建立后，曾作为自噬研究领域的先驱方法，用于探索运动对代谢降解机制及动物行为的影响。在实施该操作过程中，重要的是需在小鼠跑动时对其进行监测。在该操作步骤之后，可采用透射电子显微镜等方法进行后续分析。

可以进行动物显微镜检查，以回答有关选择性自噬途径（如线粒体自噬和脂滴自噬）中运动作用的额外问题。