小鼠中自噬激活有氧运动

自噬活化是在预防许多疾病有益。一种生理方法的诱导自噬体内是体育锻炼。在这里，我们将展示如何通过有氧运动来激活自噬和在小鼠体内测量细胞自噬水平。

本实验的总体目标是通过强制或自愿跑步在小鼠体内生理上激活自噬，然后测量特定组织中的自噬水平。这种方法可以帮助回答有关自噬的关键问题，特别是自噬和作用如何促进有氧运动介导的有益效果。这种技术的主要优点是体育锻炼是使用小鼠在体内自噬之间的快速有氧摆动。

对于该实验，从 8 到 12 周龄的 C57 黑 6 小鼠开始，这些小鼠携带一个反基因来检测体内运动诱导的自噬，称为 GFP-LC3。有关使用鼠标跑步机的详细信息，请参阅以下 JoVE 出版物。将跑步机的电刺激设置为低强度。

在前两次训练中，让小鼠适应 10 度的上坡开放式跑步机。第一天，在跑步机以每分钟 8 米的速度运行的情况下，让小鼠锻炼 5 分钟。第二天，让小鼠运行 10 分钟，最初以每分钟 8 米的速度运行，5 分钟后，将速度提高到每分钟 10 米。

第 3 天，让小鼠运行整整 90 分钟。以每分钟 10 米的速度启动跑步机，并鼓励小鼠轻轻轻推跑步，以避免反复的脚部冲击。观察和纵老鼠至关重要，这样它们在 90 分钟的跑步过程中就不会受到太多电击。

在整个跑步过程中，用手指鼓励老鼠留在跑步机上。40 分钟后，6 将速度提高每分钟 1 米。50 分钟后，再次将速度提高每分钟 1 米。

60 分钟后，将速度每分钟再提高一米。70 分钟后，开始每 5 分钟增加一次速度，使 90 分钟跑步的最后 5 分钟为每分钟 17 米。试验结束后，如果需要，立即对小鼠实施安乐死以进行组织收集。

对于此测试，请单独饲养小鼠。使用与前面描述的相同的菌株。准备一个直径为 11.4 厘米的鼠标跑轮，并附有自行车里程表。

每转一圈应测量 358 毫米的行程。将鼠标移入装有滚轮的笼子中，让鼠标自由使用两周。每 24 小时记录鼠标从里程表跑过的距离。

两周后，根据需要收获组织进行分析。为了测量自噬通量，用自噬抑制剂氯喹治疗小鼠三天。将氯喹以每毫升 5 毫克的剂量溶解在 PBS 中，并以每克 50 微克的剂量腹膜内注射到小鼠体内。

连续 3 天每天给小鼠注射 1 次，并在最后一次注射后 3 小时收获组织。对于跑步机运动的小鼠，在第三天注射后 90 分钟开始 90 分钟的跑步，以便在注射后 3 小时结束跑步。然后对小鼠实施安乐死并立即收获它们的组织。

准备固定剂，在动物运动后 90 分钟内充分释放动物。在 30 毫升注射器中加入 15 至 20 毫升新鲜制备的 4% 多聚甲醛，并用 20 号导管针头连接注射器。连接加载的注射泵，并将其设置为每小时 90 毫升的连续流量。

将动物放在干净的工作台面上，以仰卧位，通过隔膜切开胸腔，露出心脏。现在，将导管针插入右心室。接下来，在肝脏上做一个小切口以排出血液并启动泵。

注射固定剂，直到肺和肝脏完全苍白。通常，15 毫升固定剂就足够了。充血后，取出针头并收集感兴趣的组织。

要收集骨骼肌，请解剖股外侧肌。短暂地向后拉腿部皮肤，露出肌肉并定位股四头肌。然后，解剖股外侧肌，这是附着在股骨上部的外部肌肉。

为了进一步固定和脱水，将收获的组织在 4 摄氏度下放入 4% 的多聚甲醛中 24 小时。第二天，将组织转移到 15% 蔗糖 PBS 中，让它们在 4 摄氏度下浸泡过夜或直到它们在溶液中沉淀。然后，将组织转移到 4 摄氏度的 30% 蔗糖 PBS 中过夜或更长时间。

在这些浴池中，请尽可能将组织置于黑暗中。接下来，将组织放入包埋介质（如 OCT）中，必要时将其切成小块。然后，让它们在一个小培养皿中适应几分钟。

然后，将它们转移到具有足够 OCT 的低温模具中。在模具中，将切片表面朝向底部，避免形成气泡。然后，将样品冷冻在装满干冰的有盖泡沫冷却器中，直到 OCT 变白。

现在，将单个样品包裹在贴有标签的箔纸中，密封在塑料袋中，并在零下 80 摄氏度下储存，直到可以处理。使用 GFP 标记的 LC3 作为报告系统，在如上所述运动的小鼠中观察到自噬诱导。自噬刺激后，LC3 以点状结构从胞质溶胶转移到自噬体。

与静息状态小鼠相比，运动小鼠在骨骼肌和大脑皮层中具有更多的 GFP-LC3 点。使用 LC3 抗体的 Western blot 分析显示，运动显着诱导脂质偶联 LC3-II 的产生，表明胞质 LC3-I 向 LC3-II 的转化增加。接下来，测量自噬货物受体 p62 的降解。

跑步机活动 90 分钟导致骨骼肌中 p62 的降解程度高于静息状态。运动前注射氯喹可以挽救这种效果。由于氯喹是溶酶体降解的抑制剂，这些数据表明观察到的现象是由于自噬体通量升高，而不是自噬体降解的阻断。

发展后，这项技术在自噬领域具有前身，以探索对运动机制在新陈代谢和动物行为降解中的影响。在尝试此过程时，重要的是要在小鼠奔跑时对其进行监测。遵循此程序的是电显微镜等方法。

可以进行动物显微镜检查以回答其他问题，例如选定自噬途径（例如线粒体自噬和脂肪吞噬）中的运动。