Image-guided, Laser-based Fabrication of Vascular-derived Microfluidic Networks

该协议的总体目标是描述如何使用配备飞秒脉冲激光器的共聚焦显微镜，使用基于图像引导的激光降解生成嵌入聚乙二醇二丙烯酸酯水凝胶中的三维血管衍生仿生微流体网络。该技术的一个显着优势是能够生成三维仿生微流体网络，该网络准确地概括了合成结构中体内脉管系统的密度、曲折度、尺寸范围和整体结构。这种微流体制造方法将提高我们在体内生成更多内容的能力，例如组织工程结构、仿生疾病模型和超高密度芯片器件。

这种方法的视觉演示至关重要，因为显微镜软件的正确设置和实施并不直观，但对于形成所需的微流体网络至关重要。文本方案中涵盖了许多准备步骤，包括生成虚拟掩模、配置显微镜以及将虚拟掩模上传到显微镜软件。要光聚合 PEGDA 水凝胶，首先将一圈双面粘合剂连接到一个 60 毫米的培养皿上，该培养皿的底部有一个 20 毫米的孔。

接下来，在通风橱中，将 1 毫升含 TEOA 的 HBS 加入到铝箔覆盖的 2 毫升琥珀色离心管中。然后，向试管中加入 10 微升 1 毫摩尔的 Eosin Y 二钠盐。现在，使用玻璃移液管将少量 NVP 移液到玻璃烧杯中。

从这个体积中，取 3.5 微升 NVP 并将其转移到混合物中。接下来，将 10 毫克 3.4 千道尔顿 PEGDA 添加到第二个铝箔覆盖管中。然后，加入 0.2 毫升混合物，制成 5% 重量（按体积计）的 PEGDA 预聚物溶液。

现在，涡旋预聚物溶液，直到 PEGDA 完全溶解。然后，将 60 微升移液到 PDMS 模具上，不引入任何气泡。现在，将丙烯酸化 40 毫米 1.5 号玻璃盖玻片置于 PDMS 垫片上的溶液中心。

然后将组件放在校准为提供 95 毫瓦的白色光源下。将聚合物固化 3 分钟。接下来，在模具和盖玻片之间流动蒸馏水，以将水凝胶与 PDMS 分离并冲洗掉水凝胶。

然后，小心地拍干盖玻片的边缘，不要从水凝胶中吸水。现在，将盖玻片粘在准备好的培养皿上。一点压力会有所帮助。

然后，将水凝胶浸入蒸馏水中。按照文本协议中的说明设置激光扫描共聚焦显微镜，然后从水凝胶可视化配置开始。然后，将水凝胶和培养皿安装到载物台插件上，并将其放在载物台上。

接下来，在培养皿中加入至少 5 毫升蒸馏水，并将水浸物镜降低到水凝胶上方，不要与其接触。现在，单击实时以打开氩激光线。然后，专注于水凝胶，直到在水凝胶的顶部可以看到 Eosin Y 信号。

为了帮助找到水凝胶，请尝试暂时增加百分比度数或针孔大小。标记水凝胶的顶部和底部以及孔底部的位置。然后使用纵杆横向移动并找到井的边缘。

在聚焦窗口中，使用 Z 位置框旁边的向下箭头将聚焦平面向下放置 150 微米。下一步至关重要。将舞台窗口中的 X 和 Y 位置归零，然后删除所有其他标记的位置，仅标记归零的位置。

现在，要开始形成入口通道的过程，首先捕捉图像，然后使用区域窗口中的矩形按钮勾勒出将成为血管网络入口的区域。然后转到 channel formation 配置。文本协议中提供了详细信息。

到达那里后，在 Z 堆栈窗口中，单击顶部和上方偏移的中心按钮，将 Z 堆栈居中到当前位置。然后，根据入口需要多大，设置间隔为 1 的切片数。现在，检查 speed 是否设置为 3，percent power 是否设置为 100。

然后继续保存配置并单击 start experiment 按钮。要在通道降级期间可视化水凝胶，如果视野中的区域为黑色，则增加通道窗口中的增益主，如果区域为白色，则减小增益主。降解后，通过返回水凝胶可视化配置并单击 live 来确保形成入口。

首先，在区域窗口下，从虚拟蒙版的 Z 堆栈中加载任何 ovl 文件，然后单击箭头按钮以查看视野中的 ROI。然后，单击实时扫描水凝胶可视化配置，并使用纵杆或载物台窗口定位水凝胶，使入口连接到血管网络内的正确位置。接下来，使用聚焦窗口中的步长并单击向下箭头，将聚焦平面放到显微镜宏观中的第一个位置，该位置从上一个居中 Z 位置下降 50 微米。

同样，现在必须将 X 和 Y 位置重新归零，删除所有其他标记的位置，并仅将此位置标记为新的零点。请务必保存此新配置。现在，在 channel formation 配置下，仅选择时间序列和漂白窗口。

接下来，打开宏并选择保存选项卡。选择之前制作的配方，然后单击应用。切勿点击 store （存储），否则配方将被覆盖。

验证设置后，再次保存通道形成配置，然后单击显微镜宏中的更新。单击"否"覆盖当前位置列表，然后单击显微镜宏中的"开始"以开始配方。降解过程完成后，在较低的激光功率下使用水凝胶可视化配置，以便能够查看 FITC 标记的葡聚糖，其信号比水凝胶的天然曙红 Y 信号更亮。

在引入荧光标记的葡聚糖之前，从水凝胶中的孔中吸出一些水。然后移液加入 10 微升过滤的 FITC 标记的葡聚糖。所描述的程序用于将大量微血管图像转换为一系列虚拟掩码，用于图像引导微流控网络的形成。

将所得的微流体网络与其来源的体内脉管系统进行比较。基于图像引导激光的水凝胶降解能够制造 3D 仿生微流体网络，该网络概括了体内脉管系统的大小、曲折和复杂结构。压力头和注射泵都用于在这些嵌入式微流体网络中启动流体流动。

观察到荧光标记的 70 道尔顿葡聚糖和 10 微米聚苯乙烯珠子在压力头诱导流的作用下从左向右移动。或者，通过在次级微流体装置内对水凝胶进行光聚合来启动注射泵驱动的流动。使用此处描述的相同方案，然后实施基于激光的降解，在封装水凝胶中制造 2D 血管衍生网络，用于注射泵驱动的流动和 65 道尔顿葡聚糖的丰富。

观看此视频后，您应该对如何使用配备飞秒脉冲激光器的激光扫描共聚焦显微镜使用基于图像引导激光的水凝胶降解生成仿生微流体网络有一个很好的了解。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在两到三个小时内完成。在尝试此过程时，重要的是要记住，包括功率、波长和扫描速度在内的激光参数需要根据降解的水凝胶配方进行调整和优化。

谢谢你，祝你的实验好运。