成像中性粒细胞吞噬体和细胞质使用比例测量pH指示剂

这手稿描述了一种简单的方法来测量吞噬体的pH值和面积以及使用比率量度指示器seminaphthorhodafluor（SNARF）-1，或S-1人和小鼠嗜中性粒细胞的胞质pH值。这是使用活细胞共聚焦荧光显微镜和图像分析来实现的。

这种共聚焦显微镜技术的总体目标是对中性粒细胞吞噬液泡和细胞质的 pH 值和面积进行成像。该方法能够监测和量化吞噬液泡和细胞质中 pH 值的动态变化，以及吞噬液泡的体积。这些测量值随 NADPH 氧化酶的活性而变化，可用作其功能和穿过吞噬液泡膜的离子通量的替代标志物。

该技术的主要优点是吞噬体和细胞质都可以用具有较宽 pH 范围的染料同时成像。要开始此程序，通过在 100 μL 高级 DMSO 中稀释 50 μg 羧基-S-1 琥珀酰亚胺酯来制备等分试样。涡旋均匀混合。

接下来，在 15 毫升试管中制备 1 毫升 10 至 8 次热灭活或 HK 念珠菌在 0.1 摩尔碳酸氢钠中。向 HK 念珠菌中加入 100 微升羧基-S-1，一次一滴，同时在 2， 000 RPM 的涡旋中混合。之后，用铝箔包裹管子，并将其在室温下放在滚筒上一小时。

一小时后，以 2、250 倍 g 离心洗涤 HKC-S-1 3 次，每次 10 分钟。对于前两次洗涤，将沉淀重新悬浮在 15 毫升 0.1 摩尔碳酸氢钠中。第三次洗涤后，将其重新悬浮在 1 毫升 BSS 缓冲液中。

将 HKC-S-1 悬浮液转移到 100 微升等分试样的试管中，并储存在零下 20 摄氏度。要对人中性粒细胞的 HKC-S-1 进行调理，请将 100 微升人 IGG 血清添加到 100 微升解冻的 HKC-S-1 中。在 37 摄氏度和 1， 1000 RPM 的热摇床上混合 60 到 90 分钟，然后在滚筒上以 4 摄氏度混合 2 小时。

之后，在 BSS 缓冲液中以 17， 000 次 g 离心，每次 1 分钟，洗涤样品 3 次。随后，将样品重悬于 100 μL BSS 缓冲液中。对于人外周血中性粒细胞，通过静脉穿刺从健康供体身上取 15 毫升血液，并将其转移到含有 90 微升肝素钠溶液的 20 毫升注射器中，每毫升 1， 000 IU。

使用移液器吸头，将 1.5 毫升 10% 葡聚糖溶液注入注射器中。轻轻倒置 3 次，然后将其直立在长凳上 30 至 60 分钟。30 到 60 分钟后，血液应大致分成两半，顶部是稻草色的血沉棕黄层，底层包含红细胞。

小心地通过针头推出顶层或用移液器吸头将其取出，然后将其转移到 15 毫升的试管中，避免取出红色层。使用 5 毫升移液器，将 3 至 4 毫升密度梯度培养基添加到试管底部，在血沉棕黄层下方，以获得两个不同的层。随后，将样品以 900 倍 g 离心 10 分钟。

倒出上清液，留下红色沉淀。之后，轻轻涡旋以扰乱沉淀。接下来，向沉淀中加入 7 毫升蒸馏高压灭菌水，并将其倒置 20 秒以重新悬浮沉淀。

然后，加入 7 毫升 2x 生理盐水，倒置几次混合，裂解剩余的红细胞，然后以 300 倍 g 离心样品 5 分钟。倒出上清液，将沉淀重悬于 BSS 缓冲液中，至大约每毫升 10 至 6 的四倍。在此过程中，在室温下用 200 μL 聚-L-赖氨酸预处理八孔显微镜板 40 至 60 分钟，然后去除聚-L-赖氨酸并用 200 μL 蒸馏水洗涤孔两次。

接下来，向每个孔中加入 200 微升制备好的细胞悬液，并在室温下孵育 30 至 60 分钟。之后，向试管中加入 100 μL 高级 DMSO 并涡旋混合，制备等分试样的 S-1-AM 酯。在一个小试管中，加入 1.7 毫升 BSS 缓冲液和 20 微升 S-1-AM，涡旋混合物。

然后，用 200 微升 BSS 缓冲液洗涤孔两次，并用 S-1-AM 溶液替换缓冲液。注意不要通过将液体轻轻地移入孔壁来干扰附着在孔底部的细胞单层。随后，将样品在室温下孵育至少 25 分钟。

之后，用 200 微升 BSS 缓冲液洗涤孔两次。为了测试抑制剂，在 BSS 缓冲液中配制适当药物的预混液，并用它洗涤孔两次。接下来，以 5 微米的密度对调理后的 HKC-S-1 进行约 3 秒的超声处理，并向每个孔中加入 10 微升，然后将板在 37 摄氏度下孵育 15 至 20 分钟，使细胞准备好成像以进行吞噬快照。

使用共聚焦显微镜，调整激光波长，使细胞在 555 纳米处被激发，并通过两个探测器在 560 至 600 纳米和 610 纳米以上检测到发射。接下来，使用 63X 油浸透镜观察细胞。使用连续切片扫描图像设置可查看中心切片。

利用荧光强度和检测器通道的增益，调整激光的聚焦和强度以及两个通道的增益，以优化图像。之后，使用设置分割图像以查看两个通道。在实验开始之前，检查细胞质或液泡中是否有荧光强度饱和，它们会表现为红点。

如果是这样，请降低激光强度，以便有最少数量的红点，但细胞和吞噬体足够明亮和清晰，可以看到。在此过程中，打开 ImageJ 并将选择用于分析的图像文件加载到工具栏上。要组合这两个通道，请使用 Image（图像）、Color（颜色），然后使用 Make Composite（合成）。

右键单击以选择要存储结果的文件。接下来，单击工具栏上的线条工具并双击以将宽度增加到 2。在吞噬体的宽度上画一条线，然后右键单击以测量 pH 值。

细胞质 pH 值可以通过在细胞质上画一条线以相同的方式测量。完成测量后，右键单击以选择 Save File（保存文件）。要测量吞噬体面积，请使用工具栏上的第四个图标在该区域周围徒手绘制。

随后，右键单击以选择 Measure Area （测量面积）。这是对应于 pH 值的 S-1 染色吞噬体的近似颜色的定性视觉键。黄色表示酸度较高，而红色表示碱性较高。

该图像显示了吞噬作用 20 分钟后缺乏 Hvcn1 通道的小鼠结合骨髓中性粒细胞。吞噬体看起来非常红、呈碱性和肿胀。这里的红色箭头指向细胞内念珠菌，而这个箭头指向细胞外念珠菌。

该图像显示了摄入念珠菌的野生型小鼠骨髓中性粒细胞。它们的碱性比 Hvcn1 敲除的中性粒细胞低得多。该图像显示了吞噬作用后同一时间点的人外周血中性粒细胞。

它们看起来比小鼠野生型细胞略碱性，但吞噬体仍然没有 Hvcn1 敲除细胞那么大和红色，这张图片显示了在 5 微摩尔二苯碘存在下吞噬念珠菌的人中性粒细胞。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在大约四到五个小时内完成。在尝试此过程时，重要的是要记住在分离中性粒细胞时要小心，以免它们被激活。

为了确定所看到的对液泡或胞质 pH 值或液泡体积变化的影响是否是由于呼吸爆发的变化，那么这种呼吸爆发可以通过其他直接测量自由基产生或耗氧量的方式进行测量。看完这个视频后，您应该对如何分离人中性粒细胞，然后对吞噬体和细胞质进行染色和成像有一个很好的了解。不要忘记，处理人类血液样本可能非常危险，因此在执行此程序时应始终采取预防措施，例如戴手套和穿防护服。