Name: 在缺血样条件下监测星形胶质细胞的反应性和增殖体外 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 8 s
Description: 了解从幼鼠大脑分离原代星形胶质细胞并进行氧糖剥夺实验的方法。该方案利用GFAP标记物监测细胞反应性与增殖变化，为缺血性中风研究提供可靠的体外模型。

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作者感谢 Paola López Pieraldi 提供的技术支持。A.H.M. 感谢资助本出版物的基金项目 8G12MD007600 和 U54-NS083924。我们感谢 NIH-NIMHD-G12-MD007583 基金对实验设施的支持。D.E.R.A. 感谢 NIHNIGMS-R25GM110513 项目提供的博士后奖学金。我们感谢在 RCMI 项目基金 G12MD007583 支持下，使用共用仪器区以及 Priscila Sanabria 博士在光学成像设施使用过程中提供的帮助。此外，我们感谢 Jose Padilla 在视觉实验方案的拍摄与编辑工作中所做出的杰出贡献。

采用出生后1至4天的幼年大鼠（Sprague Dawley品系）分离大脑皮层。根据美国国立卫生研究院（NIH）指南批准的方法，以断头法实施安乐死。
1. 手术器械与材料的准备
<ol>
	<li>使用钢盒或快速封口灭菌袋，将器械在高压灭菌器中灭菌（温度：121 ºC，压力：15 psi，时间：30 分钟）。参见材料表中的材料。</li>
</ol>
2. 完全DMEM培养基的配制
<ol>
	<li>在含有 700 mL 经高压灭菌水的一升烧杯中，于室温下加入 Dulbecco 改良 Eagle 培养基粉末。</li>
	<li>在使用磁力搅拌器搅拌溶液的同时，加入 3.7 g/L 碳酸氢钠。</li>
	<li>用高压灭菌水将体积补至 1 L，同时调节 pH 至 7.4，然后进行过滤。用于培养时，按所需体积补充 10% 胎牛血清和 1% 青霉素/链霉素，并在 37 ˚C 下预热。参见材料表中的材料。 
	注意： 将 pH 计电极插入培养基中，将 pH 调节至 7.4。调节过程中培养基必须持续搅拌，并使用滴管缓慢加入 1 M NaOH。</li>
</ol>
3. 原代星形胶质细胞培养
注意： 接种后，细胞培养基必须每三天更换一次，细胞可培养至汇合状态（11-13天）。第三天时，轻拍培养瓶数次，使小胶质细胞和少突胶质前体细胞从培养物中脱落，移除所有“旧”培养基，用10 mL PBS洗涤两次，吸除PBS，然后加入新鲜培养基。参见材料表中的材料。
<ol>
	<li>新生大鼠脑组织的解剖
	<ol>
		<li>在组织培养罩内进行解剖操作。取出生后1–4天的新生大鼠幼崽（每75 cm2培养瓶使用2只大鼠的脑组织）。</li>
		<li>准备三个60 mm的培养皿，每个培养皿中加入5 mL完全DMEM培养基。 
		注意：可按以下方式分配：#1用于放置每只大鼠的完整脑组织，#2用于收集所有脑皮层组织，#3用于盛放已剥离脑膜的皮层组织。</li>
		<li>抓取幼鼠并喷洒70%乙醇消毒，剪下头部，将身体部分弃入小型生物危害废物容器中。</li>
		<li>使用显微解剖镊夹住头部，沿头顶纵向剪开皮肤以暴露颅骨。</li>
		<li>换用另一把剪刀，从颅骨后部向鼻部方向做“T”形切口，再用镊子轻轻剥离颅骨。</li>
		<li>用镊子取出暴露的脑组织，并将其放入先前盛有培养基的培养皿中。</li>
		<li>后续步骤需更换为另一套无菌器械操作。</li>
		<li>用显微解剖镊将一个脑组织轻轻放置于60 mm培养皿倒置的盖子上。当培养皿置于无菌纱布上时，可清晰观察脑组织，便于解剖操作。</li>
		<li>用显微解剖镊固定脑组织，用镊子尖端沿中线裂隙轻轻分离大脑半球。</li>
		<li>将皮层组织翻起并剥离，留下白质部分，将剥离的皮层转移至标记为#2的培养皿中。对所有脑组织重复此操作，将所有解剖得到的皮层集中于#2培养皿中。</li>
		<li>从每块皮层下方取出海马组织并弃去。</li>
		<li>使用显微解剖镊和60 mm培养皿，轻轻剥离各个皮层叶的脑膜，并将去膜后的皮层组织放入标记为#3的培养皿中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>组织解离：匀浆器搅拌法
	<ol>
		<li>将组织/培养基悬浮液（去膜的皮层组织）倒入无菌搅拌袋中，加入适量培养基使袋内总体积达到5 mL。</li>
		<li>将搅拌袋放入匀浆器中，关闭门盖时保留约2 cm袋体露在外部。以高速匀浆2.5分钟完成细胞解离。 
		注意：也可选择将搅拌袋封口后，在生物安全柜内用烧杯轻轻敲击袋体实现解离。操作时需在烧杯与搅拌袋之间垫一块布，以避免摩擦。</li>
		<li>将细胞悬液倒入60目筛网中，再将滤液倒入100目筛网中，依靠重力自然过滤。</li>
		<li>使用15 mL离心管，在临床离心机（建议使用摆动转子）中以200 × g离心5分钟。</li>
		<li>将上清液倒入烧杯中，再用血清移液管加入最多5 mL培养基，重悬并进一步分散细胞沉淀。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞计数
	<ol>
		<li>用微量移液器吸取100 µL细胞悬液至1.5 mL微量离心管中，加入100 µL台盼蓝染液。</li>
		<li>取10 µL混合液加入血细胞计数板，计数方格四个角区域内的所有活细胞。</li>
		<li>在准备培养瓶前计算细胞密度的公式如下： 
		<img alt="活细胞浓度公式，方程：(活细胞数/4) × 2 × 10,000 = 活细胞数/mL。" src="/files/ftp_upload/55108/55108eq1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="方程 1"> 
		<img alt="细胞计算公式，所需细胞数/活细胞数 = 所需体积，生化方程。" src="/files/ftp_upload/55108/55108eq2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="方程 2"></li>
		<li>每25 cm2培养瓶接种至少50万个细胞。向每个培养瓶中加入最多5 mL DMEM培养基，液体不应超过瓶口颈部。将培养瓶置于37 °C、5% CO2培养箱中培养3天后更换培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>星形胶质细胞纯化技术：培养基更换、机械法及化学法策略 
	注意：与其他细胞类型相比，星形胶质细胞的代谢速率较高，因此在营养缺乏条件下，这些细胞在数天后存活率较低。相比之下，小胶质细胞不受营养剥夺影响，并可在该环境中增殖18。为减少培养中小胶质细胞的数量，作者每3天更换一次星形胶质细胞培养基。这种频繁更换培养基的操作还可减少在星形胶质细胞单层表面生长的小胶质细胞数量19。
	<ol>
		<li>使用巴斯德吸管从各培养瓶中吸除含有非贴壁小胶质细胞的培养基。用无菌过滤的PBS逐滴清洗残留碎片（每瓶5 mL）。</li>
		<li>逐滴向每个培养瓶中加入无菌过滤的DMEM培养基（含抗生素和胎牛血清，每瓶5 mL），并轻轻以环形方式晃动，使液体均匀覆盖整个表面。</li>
		<li>将细胞置于37 °C、5% CO2培养箱中培养8–10天，直至培养瓶达到汇合状态（>95% 覆盖率）。 
		注意：已有多个实验方案表明，当星形胶质细胞达到汇合状态时，采用机械方法（如震荡培养2–24小时）可使位于星形胶质细胞上方的细胞（主要是小胶质细胞和前体细胞）脱落19,20。</li>
		<li>通过以180 rpm转速进行轨道震荡30分钟，减少非星形胶质细胞。去除上清液中的细胞后，向培养瓶中加入新鲜培养基（约15 mL）。</li>
		<li>为清除少突胶质前体细胞，将震荡速度提高至200 rpm，持续6小时21,22,23，吸除上清液后加入新鲜培养基。 
		注意：为减少培养物中小胶质细胞的污染，可在原代细胞培养中依次（非同时）使用两种化学方法：阿糖胞苷（Ara-C）和L-亮氨酸甲酯（LME）24。</li>
		<li>在细胞达到100%汇合状态后（即机械去除小胶质细胞后3–4天），立即用含8 µM抗有丝分裂化合物阿糖胞苷（Ara-C）的DMEM处理细胞，持续5天（每天更换新鲜含Ara-C的DMEM）。 
		注意：添加Ara-C的时间点至关重要，因为该化合物是一种抗有丝分裂药物，可减少快速增殖的细胞（如小胶质细胞19,25和成纤维细胞26）的数量。相比之下，星形胶质细胞在汇合后会因接触抑制而停止增殖27。</li>
		<li>给予细胞2天时间从Ara-C处理中恢复。</li>
		<li>为进一步减少小胶质细胞污染，在细胞达到汇合状态后，使用50 mM L-亮氨酸甲酯（LME）溶于pH 7.4的DMEM中，在37 °C处理1小时。 
		注意：LME可穿过细胞和细胞器膜，水解后产生的L-亮氨酸在细胞溶酶体中积累。该氨基酸的积累导致溶酶体发生渗透性肿胀并破裂28,29。与其他细胞相比，LME在清除小胶质细胞方面具有高效性20,30。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 在6孔板中培养星形胶质细胞
<ol>
	<li>用多聚赖氨酸包被盖玻片
	<ol>
		<li>在每个 35 mm 培养皿中放入一片盖玻片，然后向每片盖玻片上加入 100 µL 稀释的多聚赖氨酸溶液，静置 1 小时。</li>
		<li>吸除多聚赖氨酸溶液，用 2 mL 无菌水洗涤两次。</li>
		<li>吸去水，将盖玻片置于超净台内晾干。将盖玻片储存于 -20 °C，最多可保存两周。 
		注意：将稀释后的多聚赖氨酸溶液冷冻保存，可存放最多两周。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>胰酶消化
	<ol>
		<li>使用巴斯德移液管吸除培养瓶中的培养基，每瓶加入 5 mL 经无菌过滤的 PBS 轻柔冲洗细胞。</li>
		<li>吸除 PBS，然后每瓶加入 5 mL 经无菌过滤的 0.25% 胰酶和 0.5 mM EDTA 溶液。将培养瓶置于 37 °C、5% CO2 培养箱中孵育 10 分钟。 
		注意：在细胞孵育期间，将每瓶 5 mL 新鲜完全 DMEM 预热至 37 °C。</li>
		<li>孵育 10 分钟后，轻轻振荡以确保所有细胞从培养瓶表面脱落。迅速向每瓶中加入 5 mL 预热的完全 DMEM 以中和胰酶活性。</li>
		<li>轻柔吹打细胞数次以分散任何“团块”。将两个培养瓶中的悬浮细胞转移至一个 15 mL 圆锥形离心管中。</li>
		<li>以 200 × g 离心 5 分钟以收集细胞沉淀。将沉淀重悬于 500 µL 培养基中，并继续将细胞接种至培养瓶中。 
		注意：可用于细胞分析的示例包括：1）逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）分析基因表达；2）蛋白质印迹法（Western blot）评估蛋白表达；3）流式细胞术分析神经前体细胞及目标蛋白的数量；4）免疫荧光染色分析蛋白表达与定位。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>星形胶质细胞接种
	<ol>
		<li>将原代星形胶质细胞经胰酶处理后（参见 4.2），取 100 μL 细胞悬液至 1.5 mL 微离心管中，加入 100 μL 0.5% 台盼蓝溶液。</li>
		<li>取 10 μL 经台盼蓝染色的细胞悬液加入血细胞计数板，计数所有活细胞。</li>
		<li>使用步骤 3.3 中的公式计算细胞密度，再进行培养瓶的准备。</li>
		<li>在多孔板的每个孔中加入一片无菌的、经多聚赖氨酸包被的盖玻片，用移液器加入 50,000 个细胞，并用新鲜培养基补足每孔体积至约 2 mL。</li>
		<li>将多孔板置于 37 °C、5% CO2 培养箱中培养，5–7 天后星形胶质细胞可生长并覆盖整个盖玻片表面。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 原代星形胶质细胞的氧糖剥夺（OGD）方案
<ol>
	<li>OGD 培养基的制备
	<ol>
		<li>在无葡萄糖的杜尔贝科改良伊格尔培养基中添加 3.7 g/L 碳酸氢钠和 1% 青霉素/链霉素。参见表 4中的材料。</li>
		<li>将 20 mL 无葡萄糖培养基置于气体系统中，通过移液管向培养基中通入 95% N2/5% CO2 混合气体 10 分钟，气体流速为 15 L/min（以流量计指示为准）。 
		注意：在去除培养基中的氧气后，调节 pH 至 7.4（参见步骤2.1的注释）。</li>
		<li>使用 50 mL 滤器系统过滤脱氧后的无葡萄糖培养基。 
		注意：每次实验均需新鲜配制 OGD 培养基，并在使用前用 95% N2/5% CO2 混合气体吹泡处理，以确保细胞暴露于无氧环境。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>实验步骤
	<ol>
		<li>在组织培养超净台内，移除预先准备好的盖玻片上的星形胶质细胞培养基（参见步骤 4.3.5），并用细胞用 PBS 洗涤两次，以去除细胞表面残留的葡萄糖。</li>
		<li>向每孔加入 2 mL OGD 培养基，并将多孔板放入缺氧舱中，移除盖子。</li>
		<li>将混合气体连接至进气阀，保持出气阀开放，以 15 L/min 的流速用 95% N2/5% CO2 混合气体冲洗舱体 5 分钟。</li>
		<li>停止供气，首先关闭出气阀上的夹子，然后关闭进气管路上的夹子。 
		注意：通过在舱体密封处涂抹肥皂水检查是否漏气；若密封良好，则不应产生气泡。</li>
		<li>将整个缺氧舱置于 37 °C 细胞培养箱中，进行 1 小时或 6 小时的 OGD 处理。</li>
		<li>孵育结束后，吸除 OGD 培养基，并小心加入 2 mL 完全 DMEM 培养基至每个 4.67 cm2 孔中，用于常氧条件下继续培养 24 小时。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
星形胶质细胞免疫荧光制备方案
注意：为评估星形胶质细胞纯度，可使用不同细胞标志物通过免疫荧光检测其他脑细胞类型，如神经元、小胶质细胞和少突胶质细胞。可在经历氧糖剥夺（OGD）后转入常氧条件的原代星形胶质细胞中，使用增殖标志物PCNA以及碘化丙啶（PI）进行检测。参见材料表中的材料。
<ol>
	<li>免疫荧光样品制备 
	注意： 这是一份通用的免疫荧光实验方案，可根据需要进行微小调整以获得最佳信号（例如，更长的孵育时间，孵育温度）。每种标志物来自 表1 可根据制造商的说明书使用。
	<ol>
		<li>为评估细胞活力，可将细胞孵育5分钟 37 °C 含 PI（5 µM 在完全DMEM中重悬，并用2 mL PBS洗涤两次，每次5分钟。显示PI染色的细胞活力较低。 
		注意： 使用在步骤 5.2.6 中处理的细胞。</li>
		<li>为在碘化丙啶（PI）染色后固定细胞，每4.67 cm²培养面积加入2 mL 4%甲醛溶液2 4 °C 下孵育 20 分钟。对于标记 PCNA 的样品，首选在 4 °C 下用甲醇固定 10 分钟。 
		注意： 甲醛和甲醇具有毒性。 
		注意： 始终查阅各公司提供的特异性抗体实验方案。</li>
		<li>用 2 mL PBS 清洗细胞，每次 5 分钟，重复此步骤 3 次。</li>
		<li>在室温下，将细胞置于封闭液（PBS 中含 0.5% 非离子型表面活性剂和 10% FBS）中轻轻振荡孵育 30 分钟。</li>
		<li>用 2 mL PBS 清洗细胞，每次 5 分钟，重复清洗 3 次。</li>
		<li>孵育于 4 °C，加入一抗（PCNA、GFAP），在含1% FBS的PBS溶液中4℃孵育过夜（16 h）。</li>
		<li>移除一抗溶液，加入2 mL PBS洗涤细胞5分钟，重复此步骤3次。</li>
		<li>在含1% FBS的PBS溶液中，室温孵育荧光标记的二抗，1小时。</li>
		<li>用 2 mL PBS 洗涤细胞 5 分钟，重复此步骤 3 次。加入 1 µg/mL 用 DAPI（4',6'-二脒基-2-苯基吲哚）染色 5 分钟以标记细胞核。</li>
		<li>用 2 mL PBS 洗涤细胞 5 分钟，重复该步骤两次，最后将细胞置于 PBS 中保存。</li>
		<li>使用封片剂在显微镜载玻片上制备盖玻片。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>共聚焦显微镜
	<ol>
		<li>显微镜设置完成后，将盖玻片朝下放置在显微镜载物台上。</li>
		<li>使用软件选择543 nm激光束用于GFAP-Cy3偶联抗体。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 细胞活力检测
<ol>
	<li>按照步骤 4.3 和 4.4 对星形胶质细胞进行胰酶消化并计数。</li>
	<li>将 1×104 个细胞/孔接种至 96 孔板中，并培养至细胞融合。</li>
	<li>采用步骤 5 的方法，将培养的 96 孔板分别暴露于常氧、1 小时氧糖剥夺（OGD）或 6 小时氧糖剥夺（OGD）条件下。</li>
	<li>OGD 处理后，向所有细胞中加入常氧培养基，继续培养 24 小时，并使用 MTT 试剂盒检测细胞活力（按照制造商说明书操作）。</li>
	<li>从 5 mg/mL 的 MTT 溶液中，加入总体积的 10% 至每孔，于 37 ˚C 孵育 3 小时。</li>
	<li>移除培养基，加入 200 µL 二甲基亚砜（DMSO）重悬结晶，使用分光光度计在 570 nm 波长处读取吸光值。 
	注意：与对照组细胞相比，吸光度降低表明细胞活力下降。</li>
</ol>

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<li>Berger, R., Garnier, Y., Pfeiffer, D., Jensen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharides+do+not+alter+metabolic+disturbances+in+hippocampal+slices+of+fetal+guinea+pigs+after+oxygen-glucose+deprivation%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+research%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharides do not alter metabolic disturbances in hippocampal slices of fetal guinea pigs after oxygen-glucose deprivation.</a> Pediatric research. 48 (4), 531-535 (2000).</li>
<li>Anderson, T. R., Jarvis, C. R., Biedermann, A. J., Molnar, C., Andrew, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blocking+the+anoxic+depolarization+protects+without+functional+compromise+following+simulated+stroke+in+cortical+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Blocking the anoxic depolarization protects without functional compromise following simulated stroke in cortical brain slices.</a> Journal of neurophysiology. 93 (2), 963-979 (2005).</li>
<li>Jarvis, C. R., Anderson, T. R., Andrew, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anoxic+depolarization+mediates+acute+damage+independent+of+glutamate+in+neocortical+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Anoxic depolarization mediates acute damage independent of glutamate in neocortical brain slices.</a> Cerebral Cortex. 11 (3), 249-259 (2001).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案描述了从大鼠大脑皮层中分离星形胶质细胞的方法。该方法的关键在于减少小胶质细胞、少突胶质细胞和成纤维细胞等其他细胞类型的污染。为减少小胶质细胞的数量，可采取多种措施：更换培养基、轨道振荡以及化学处理。一旦通过免疫荧光法使用特异性细胞标志物或针对主要污染细胞类型的标志物确认培养物的纯度，即可开展实验。例如，可使用针对离子化钙结合接头分子1（Iba-1）的抗体来检测小胶质细胞。神经元死亡在培养早期即开始发生，这些细胞以及少突胶质前体细胞（OPCs）会在第3天敲击培养瓶并更换培养基后被清除。31 可使用如olig2或NG2等抗体来鉴定少突胶质前体细胞。GalC可用于鉴定未成熟或成熟的少突胶质细胞，但在该培养阶段，这些细胞不太可能存在。此外，也可通过定量非GFAP阳性细胞来估算污染细胞的比例。这种最后一种方法虽不能区分具体的细胞类型，但是一种更快且更经济的评估培养物中非星形胶质细胞比例的方法。
星形胶质细胞富集培养建立后，可进行氧糖剥夺（OGD）实验以研究星形胶质细胞的反应性。通过向溶液中通入氮气以置换氧气，是一种常用的实验方案。<sup...

脑卒中被定义为&#34;一种血管源性的急性神经功能障碍，其症状和体征突然或迅速出现，对应于脑部局部区域的受累&#34;1,2。脑卒中分为两种类型：出血性脑卒中和缺血性脑卒中。当血管功能障碍由动脉瘤或动静脉畸形引起，并伴有动脉壁薄弱继而破裂时&#160;，称为出血性脑卒中3，这种情况多数会导致死亡。当血栓或栓子阻塞血流，导致脑区暂时性缺氧和葡萄糖供应不足时，则称为缺血性脑卒中4。若受累区域周围细胞无法获得足够营养，即缺血核心周围的组织出现稳态和代谢失衡、能量功能障碍、神经元死亡及炎症反应5，可导致患者终身残疾6。
缺血性脑卒中是一种多因素损伤，涉及多种细胞类型，这些细胞在不同时间点发生反应并发挥各自的作用。众多相互作用使得研究单个细胞的行为变得困难。那么，在如此复杂的环境中，我们如何研究特定细胞类型的贡献呢？一种被广泛接受的 体外 缺血模型包括将细胞暴露于无氧无糖（OGD）环境中一定时间，随后将细胞恢复至常氧环境。该系统模拟缺血性脑卒中后血流再灌注的过程。在此方法中，细胞或组织被置于无葡萄糖培养基中，并在经特殊低氧舱去除氧气的环境中进行培养。OGD孵育时间可根据研究假设的不同，从数分钟至24小时不等。研究表明，根据OGD处理时间及恢复常氧环境的时间不同，可产生特定的脑卒中表型即，可实现急性或亚慢性损伤。原代分离的星形胶质细胞在氧糖剥夺后恢复至常氧条件，是模拟脑卒中广泛研究的细胞模型 体外7使用氧糖剥夺（OGD）可以揭示孤立细胞在类似中风环境下的独立分子机制。
随着我们对星形胶质细胞生物学的认识不断加深，已明确它们在维持突触功能以及神经修复、发育和可塑性方面起着至关重要的作用8。在正常条件下，星形胶质细胞会释放并响应细胞因子、趋化因子、生长因子和胶质递质，以维持突触内的代谢平衡和稳态5,9。在急性神经炎症（如缺血性卒中）中，这些细胞可转变为反应性状态，长期过表达胶质纤维酸性蛋白（Glial Fibrillary Acidic Protein, GFAP），并在形态上表现出肥大5,10,11,12。随着缺血性梗死的发展，星形胶质细胞所提供的稳态功能受到影响，包括正常的谷氨酸摄取、能量代谢、活性分子交换以及抗氧化活性13。
活化的星形胶质细胞在梗死组织周围增殖，同时白细胞向损伤区域迁移14。星形胶质细胞的增殖可通过增殖细胞核抗原（PCNA）、Ki67 和溴脱氧尿苷（BrdU）等标记物进行检测15。这种增殖反应呈时间依赖性，并有助于形成胶质瘢痕，即在损伤后于受损部位实质周围排列的一层不可逆活化的星形胶质细胞9。该瘢痕的初始功能之一是限制免疫细胞从此区域外渗。然而，研究表明，瘢痕会成为轴突延伸的物理障碍，因其释放抑制轴突生长的分子，并形成物理屏障，阻止轴突在损伤区域周围延伸16。尽管如此，已有科学证据表明，在脊髓损伤后，完全阻止胶质瘢痕的形成可能损害轴突的再生17。因此，在研究特定损伤模型的背景下，必须考虑所测量的星形胶质细胞反应的具体情境。
所介绍的方法可用于研究星形胶质细胞在缺氧缺糖后的个体化功能，并可根据研究者希望回答的问题进行相应修改。例如，除了观察不同缺氧缺糖时间下的形态学变化及标志物表达外，还可进一步分析经缺氧缺糖处理的星形胶质细胞的上清液，以鉴定这些细胞释放的可溶性因子，或将其用作条件培养基来评估其对其他脑细胞的影响。该方法有助于开展关于星形胶质细胞反应性的研究，进而揭示在缺血性脑卒中情境下调控其反应的关键因素。

<table><tbody><tr><td>&lt;强&gt;外科手术器械 - 第1步&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>操作剪刀 5.5&amp;rdquo;</td><td>Roboz公司</td><td>RS-6812</td><td>用于断头处死大鼠的工具。</td></tr><tr><td>弯头镊子 7&amp;rdquo;&amp;nbsp;</td><td>Roboz公司</td><td>RS-5271</td><td>在移除大鼠颅骨时固定其皮肤。</td></tr><tr><td>微型解剖剪 4&amp;rdquo;&amp;nbsp;</td><td>Roboz 公司</td><td>RS-5882</td><td>同时切开大鼠的皮肤和颅骨。</td></tr><tr><td>显微解剖镊子 4&amp;rdquo; 倾斜的，精细锋利的&amp;nbsp;</td><td>Roboz公司</td><td>RS-5095</td><td>在移除大鼠颅骨时固定其皮肤。</td></tr><tr><td>显微解剖镊 4&amp;rdquo; 轻度弯曲 0.8</td><td>Roboz 公司</td><td>RS-5135</td><td>用于分离皮质的工具。</td></tr><tr><td>显微解剖镊</td><td>Roboz 公司</td><td>RS-4972</td><td>剥离脑膜</td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>Olympus</td><td>SZX16</td><td>对去除大脑皮层的脑膜至关重要。</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;DMEM 制备——步骤 2&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科&amp;rsquo;s 改良伊格尔&amp;rsquo;DMEM培养基</td><td>GibCo. 公司</td><td>11995-065</td><td>支持细胞生长。</td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Sigma-Aldrich 公司</td><td>S7277</td><td>细胞培养基添加剂</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>GibCo. 公司</td><td>10437-010</td><td>细胞培养用血清补充剂</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素&amp;nbsp;</td><td>GibCo. 公司</td><td>15140-148</td><td>抑制细胞培养中细菌的生长。</td></tr><tr><td>1L滤器系统，孔径0.22μm</td><td>康宁</td><td>431098</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;星形胶质细胞培养 - 步骤3&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 mL 血清移液管</td><td>VWR</td><td>89130-896</td><td>将DMEM用移液器加入含有细胞的容器中。</td></tr><tr><td>10 mL 血清移液管</td><td>VWR</td><td>89130-898</td><td>将DMEM用移液器加入含有细胞的容器中。</td></tr><tr><td>25 mL 血清移液管</td><td>VWR</td><td>89130-900</td><td>将DMEM用移液器加入含有细胞的容器中。</td></tr><tr><td>离心15 mL锥形管</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-200250</td><td></td></tr><tr><td>安全锁扣管 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>022363204</td><td></td></tr><tr><td>200 µL 防污染吸头</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-201725</td><td></td></tr><tr><td>屏障吸头 1 mL</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-201727</td><td></td></tr><tr><td>生物危害橙色袋 14 x 19&quot;</td><td>VWR</td><td>14220-048</td><td></td></tr><tr><td>60 mm 培养皿</td><td>Falcon</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>无菌纱布垫</td><td>霍尼韦尔安全防护</td><td>89133-086</td><td></td></tr><tr><td>Stomacher 80 Biomaster</td><td>Sewar 实验室系统</td><td>030010019</td><td>匀浆脑组织。</td></tr><tr><td>Stomacher 80 均质器无菌袋</td><td>Sewar 实验室系统</td><td>BA6040</td><td>拍击式均质器用无菌袋</td></tr><tr><td>400 mL烧杯</td><td>Pyrex</td><td>1000</td><td></td></tr><tr><td>无菌细胞分离筛，60目&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich 公司</td><td>S1020</td><td>获得均匀的单细胞悬液。</td></tr><tr><td>无菌细胞分离筛，孔径 #100</td><td>Sigma-Aldrich 公司</td><td>S3895</td><td>获得均匀的单细胞悬液。</td></tr><tr><td>倒置相差显微镜</td><td>尼康</td><td>Eclypse Ti-S</td><td>检测细胞是否存在污染或异常生长。</td></tr><tr><td>75 cm² 无菌培养瓶</td><td>Falcon</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>多孔板</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>18毫米圆形盖玻片</td><td>VWR</td><td>48380-046</td><td></td></tr><tr><td>亮线血细胞计数板</td><td>Sigma-Aldrich 公司</td><td>Z359629</td><td></td></tr><tr><td>巴斯德吸管</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20D</td><td></td></tr><tr><td>乙醇&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich 公司</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>L-亮氨酸甲酯盐酸盐 98%（LME）</td><td>Sigma-Aldrich 公司</td><td>L1002</td><td>促进原代皮质星形胶质细胞培养物中小胶质细胞的清除。</td></tr><tr><td>胞嘧啶 &amp;beta;-D-阿糖呋喃糖苷（Ara-C）</td><td>Sigma-Aldrich 公司</td><td>C1768</td><td></td></tr><tr><td>聚-D-赖氨酸氢溴化物，分子量 70,000-150,000</td><td>Sigma-Aldrich 公司</td><td>P0899</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶/EDTA</td><td>GibCo. 公司</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>Sigma-Aldrich 公司</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）片剂</td><td>Calbiochem</td><td>524650</td><td></td></tr><tr><td>无菌水</td><td>Sigma-Aldrich 公司</td><td>W3500</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;&amp;nbsp;OGD 培养基制备——步骤 5&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL 圆锥形离心管离心</td><td>VWR</td><td>89039-658</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科&amp;rsquo;s 改良的 Eagle&amp;rsquo;无糖培养基</td><td>Sigma-Aldrich 公司</td><td>D5030</td><td>支持细胞生长。</td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Sigma-Aldrich 公司</td><td>S7277</td><td>细胞培养基添加剂</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素&amp;nbsp;</td><td>GibCo. 公司</td><td>15140-148</td><td>抑制细胞培养中细菌的生长。</td></tr><tr><td>200 mM&amp;nbsp; L-谷氨酰胺&amp;nbsp;</td><td>GibCo. 公司</td><td>25030-081</td><td>促进细胞生长的氨基酸。</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）片剂</td><td>Calbiochem</td><td>524650</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 0.22 μm 孔径滤器系统</td><td>康宁</td><td>430320</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 圆锥形离心管离心</td><td>VWR</td><td>89039-658</td><td></td></tr><tr><td>单一流量计&amp;nbsp;</td><td>Billups-Rothenberg</td><td>SMF3001</td><td>测量氧气吹扫中的气体流量。</td></tr><tr><td>缺氧培养箱&amp;nbsp;</td><td>干细胞</td><td>27310</td><td>为细胞培养提供低氧环境。</td></tr><tr><td>可追溯溶解氧测定仪</td><td>VWR</td><td>21800-022</td><td></td></tr><tr><td>95% N2 / 5% CO2 气体混合物</td><td>Linde</td><td></td><td>清除环境中的氧气。</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;原代星形胶质细胞免疫荧光——步骤6&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）片剂</td><td>Calbiochem</td><td>524650</td><td></td></tr><tr><td>中性缓冲福尔马林溶液 10%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td>用于固定细胞的溶液。</td></tr><tr><td>甲醇&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td>A4544</td><td>用于固定细胞的溶液。</td></tr><tr><td>非离子型表面活性剂（Triton X-100）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>GibCo. 公司</td><td>10437-010</td><td>细胞培养用血清补充剂</td></tr><tr><td>抗 NeuN</td><td>细胞信号传导</td><td>24307</td><td>检测成熟神经元，用于验证星形胶质细胞培养。</td></tr><tr><td>抗PCNA</td><td>细胞信号传导</td><td>2586</td><td>检测增殖细胞。</td></tr><tr><td>碘化丙啶（PI）</td><td>Sigma-Aldrich 公司</td><td>P4170</td><td>细胞凋亡染色</td></tr><tr><td>抗Olig1</td><td>Abcam</td><td>AB68105</td><td>检测成熟的少突胶质细胞。</td></tr><tr><td>抗Iba1+</td><td>和光</td><td>016-20001</td><td>检测小胶质细胞。</td></tr><tr><td>抗GFAP-Cy3抗体&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich 公司</td><td>C9205</td><td>检测经处理细胞中的反应性星形胶质细胞。</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488</td><td>分子探针生命科技</td><td>A1101</td><td>抗小鼠二抗</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555</td><td>分子探针生命科技</td><td>A21428</td><td>抗兔二抗</td></tr><tr><td>4&amp;rsquo;,6&amp;rsquo;-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）</td><td>Sigma-Aldrich 公司</td><td>D9542</td><td>细胞核染色</td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

监测星形胶质细胞反应性与增殖 体外 在模拟缺血条件下

Monitoring Astrocyte Reactivity and Proliferation in Vitro Under Ischemic-Like Conditions

缺血性脑卒中是一种由血栓或栓子阻塞脑部血流引起的复杂脑损伤。这会导致脑组织缺氧和葡萄糖供应中断，进而引发能量衰竭和神经元死亡。在发生缺血性脑卒中后，星形胶质细胞会活化，并在损伤区域周围增殖。在此情况下，难以研究星形胶质细胞对缺血脑区所起的特定作用。因此，本文介绍了一种用于研究原代星形胶质细胞在缺血条件下活化与增殖反应的方法 体外 模拟缺血样环境，称为氧糖剥夺（oxygen glucose deprivation, OGD）。星形胶质细胞从出生后1至4天的大鼠幼鼠中分离获得，并通过星形胶质细胞特异性标记物胶质纤维酸性蛋白（Glial Fibrillary Acidic Protein, GFAP）及细胞核染色评估非特异性星形胶质细胞的数量。星形胶质细胞接受OGD处理的时间可自定义，其所暴露的氧气浓度百分比也可调节。这种灵活性使科研人员能够在不同细胞组中表征缺血样条件持续的时间 体外本文讨论了通过增殖细胞核抗原（PCNA）免疫荧光检测所评估的氧糖剥夺（OGD）诱导星形胶质细胞活化、肥大形态改变及增殖的时间进程。除增殖外，星形胶质细胞还会经历能量与氧化应激，并通过向细胞培养基中释放可溶性因子来响应OGD。该培养基可被收集并用于分析星形胶质细胞释放的分子对原代神经元培养物的影响，且无需细胞间直接接触。综上所述，该原代细胞培养模型可有效用于理解损伤条件下孤立星形胶质细胞的作用。

原代星形胶质细胞培养的主要问题之一是存在其他类型的细胞，例如神经元、少突胶质细胞、成纤维细胞和小胶质细胞。图1显示从大鼠皮层分离的细胞每3天更换一次培养基，部分细胞未接受处理，另一部分则添加LME处理1小时。24小时后，对细胞进行GFAP免疫染色，并用DAPI复染。未经处理的细胞中平均有39%为GFAP阴性细胞，而经LME处理的细胞中仅为8%。这些结果表明，LME处理结合换液可使GFAP阴性细胞减少4.75倍，从而获得富集的星形胶质细胞培养物。为了确定1小时或6小时的氧糖剥夺（OGD）在此方法学条件下是否影响星形胶质细胞的存活率，图2展示了损伤后24小时星形胶质细胞培养物的MTT检测结果。各组之间细胞活力无显著差异，表明这两种时间点均可用于研究星形胶质细胞的反应性。细胞增殖是OGD在星形胶质细胞中诱导的效应之一。图3中的增殖细胞核抗原（PCNA）表达从常氧细胞的10%上升至1小时OGD后的30%...

缺血性脑卒中是一种复杂的病理事件，其中星形胶质细胞在暴露于氧糖剥夺（OGD）的脑区所发挥的特定作用难以研究。本文介绍了一种获取分离星形胶质细胞的方法，并研究其在氧糖剥夺条件下的反应性及增殖能力。

缺血性脑卒中是一种复杂的脑损伤，由血栓或栓子阻塞脑部部分区域的血流引起。这会导致……

以下方案旨在展示如何从幼鼠脑组织中分离原代星形胶质细胞，以进行氧糖剥夺（OGD）实验。将纯化的星形胶质细胞暴露于氧糖缺乏的环境中，是一种可用于模拟缺血性脑卒中部分条件的实验模型。通过使用特异性星形胶质细胞标志物（如GFAP），可观察并测量细胞在经历氧糖剥夺后的系统性变化。总之，这些在模拟缺血条件下暴露的分离细胞可用于测试缺氧条件下激活的新通路，以及具有抗缺血性脑卒中保护作用的其他药物。在本实验方案的这一部分，将从新生大鼠大脑皮层中分离星形胶质细胞。该操作的目的是获得原代星形胶质细胞培养物，以进行氧糖剥夺实验。本实验所需的材料如下：在使用本实验方案前，所有材料均需进行高压灭菌。实验开始前，将生物安全柜暴露于紫外灯下至少20分钟。开始实验时，向每块培养板中加入三至五毫升完全DME培养基。将按以下方式分割：一只小鼠脑组织一份，所有皮层组织两份，所有去除软脑膜的皮层组织三份。用70%乙醇消毒后，断头处死幼鼠。从头部后侧开始，沿中线向前至鼻部做一切口。用弯头镊子去除颅骨，轻轻刮除小脑以暴露大脑皮层。用镊子取出暴露的脑组织，将脑放入含有培养基的第一只培养皿中。对所有其他幼鼠重复上述步骤。用显微解剖镊的尖端沿中线裂隙轻轻分离大脑半球。用镊子以夹取动作去除白质和海马，从而剥离皮层并将其留在原处。将剥离的皮层转移至标记为2号的培养皿中。对所有脑组织重复上述操作，将所有分离出的皮层合并置于培养皿中。轻轻摇晃培养皿，使培养基在所有皮层组织间均匀分布。使用解剖显微镜观察剥离后皮层表面的脑膜。脑膜是一层非常薄且透明的结构，可通过寻找组织周围细小的红色毛细血管来识别。仔细检查并用精细镊子从每个大脑半球的两侧轻轻剥离覆盖在大脑皮层表面的脑膜，并将其移除。将清理干净的皮层组织放入新培养皿中，标记为3号。使用胃部或搅拌器方法进行组织解离时，将培养皿中洁净的去皮皮层组织及培养基倒入无菌搅拌袋中。加入足量培养基，使搅拌袋内的总体积达到 5 毫升。将搅拌袋放入 stomacher 80 中，关闭门时留出约 2 厘米的袋体在门外可见。该仪器中的细胞解离在高速下进行2.5分钟后完成。或者，也可通过关闭无菌袋，并在生物安全柜中用烧杯轻轻敲击组织，直至组织颗粒形成细小悬浮液来进行组织解离。注意在袋与烧杯之间垫上布巾，以避免摩擦导致袋子破裂。将细胞悬液倒入60目筛网的中心。将过滤后的细胞加入100目筛网中央，静置使其依靠重力过滤。将过滤后的细胞悬液转移至15毫升锥形管中。在离心机中以200 × g的离心力离心细胞悬液，建议使用水平转子，离心5分钟。弃去上清液，倒入烧杯中丢弃。向细胞沉淀中加入完全新鲜培养基。使用血清学移液管在最多五毫升培养基中重悬并解离细胞团块。将所需量的细胞悬液加入培养瓶中，并补充培养基。将重悬的细胞团块加入含培养基的培养瓶中。将细胞均匀分布于培养瓶中，并置于37摄氏度、含5%二氧化碳的培养箱中。请记住每三天更换一次培养基。以下方法旨在可控环境中剥夺细胞的氧气和葡萄糖。该模型的目的是研究星形胶质细胞在类似缺血性中风条件下的反应。本实验所用材料包括：通过连接气体系统的移液管对无葡萄糖培养基进行气体置换。使用混合气体以每分钟10至15升的流速向溶液中鼓泡10分钟。10分钟后，将OGD培养基的pH值调节至7.4。使用50毫升滤器系统过滤已除气的无葡萄糖培养基。每次实验都必须新鲜配制OGD培养基。这将确保培养基中的氧气被彻底清除。移除星形胶质细胞培养基，并用细胞用 PBS 洗涤两次，以去除细胞中的葡萄糖。向孔板中加入 OGD 培养基。将多孔板敞盖置于缺氧舱内。将混合气体连接至进气阀，并保持出气阀打开。以每分钟10至15升的流速，用混合气体冲洗舱体5至7分钟。停止气体流动，首先关闭出口阀上的夹子，然后关闭气体入口阀管路上的夹子。将缺氧室置于细胞培养箱中，在37摄氏度下进行所需时间的氧糖剥夺（OGD）处理。孵育结束后，吸除氧糖剥夺培养基，小心地向细胞中加入完全DMEM以恢复常氧条件。将细胞放回培养箱中，在常氧条件下分别培养0、24和48小时。本方案描述了从新生大鼠大脑皮层中分离星形胶质细胞的方法。在验证原代培养物的纯度后，进行了氧糖剥夺（OGD）实验。在此类缺血样模型中，通过使用星形胶质细胞标志物（如GFAP）或增殖标志物（如PCNA）进行免疫荧光染色，监测由葡萄糖和氧气剥夺所诱导的更显著的形态学变化。该模型的优势之一在于，能够让我们研究特定细胞类型的反应。尽管该技术的局限性在于由于星形胶质细胞被分离，导致细胞间相互作用的缺失。克服这一局限性的可能方法之一，是将星形胶质细胞暴露于其他细胞类型的条件培养基中，或采用共培养体系。总之，在分离的细胞系统中采用氧糖剥夺方法，可使我们直接检测不同神经保护性或神经毒性分子的作用。此外，它也是研究星形胶质细胞生物学的有效工具。最后，该模型为在体内实验条件下研究发育中的药物奠定了坚实基础。

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在缺血样条件下监测星形胶质细胞的反应性和增殖体外

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培养 在体 内使用快速、简单且经济的AWESAM方案培养类小鼠星形胶质细胞

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一种用于光栓法脑卒中建模的整合方法 在体 内 行为小鼠中神经元和星形胶质细胞活动的光探针记录

了解从幼鼠大脑分离原代星形胶质细胞并进行氧糖剥夺实验的方法。该方案利用GFAP标记物监测细胞反应性与增殖变化，为缺血性中风研究提供可靠的体外模型。

监测星形胶质细胞反应性与增殖体外在模拟缺血条件下

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