Name: 暴露在生理条件下的氧气在人体细胞中帽结合蛋白质分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: 学习利用琼脂糖连接的m7GTP帽类似物在低氧条件下捕获帽结合蛋白的方法，以鉴定新型氧调控翻译因子。该技术有助于研究肿瘤细胞中的蛋白质合成调控机制。

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本工作得到了加拿大自然科学与工程研究理事会以及安大略省研究与创新部的支持。

1. 细胞培养的准备工作
<ol>
	<li>购买市售的人源细胞株。 
	注意：本实验方案使用 HCT116 结肠直肠癌细胞和原代人肾近端小管上皮细胞（HRPTEC）。</li>
	<li>配制 500 ml HCT116 细胞培养用培养基：高糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM），添加 7.5% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素/链霉素（P/S）。</li>
	<li>配制 500 ml HRPTEC 细胞培养用培养基：上皮细胞培养基，添加 5% FBS、1% 上皮细胞生长补充剂和 1% 青霉素/链霉素（P/S）。</li>
	<li>配制 500 ml 1×磷酸盐缓冲液（PBS）：140 mM NaCl、3 mM KCl、10 mM Na2HPO4、15 mM KH2PO4。调节 pH 至 7.4，并在 121 °C 下高压灭菌 40 分钟。</li>
</ol>
2. 细胞培养的启动
<ol>
	<li>小心吸出培养皿中80-90%汇合度的培养基，注意不要扰动细胞。</li>
	<li>每个培养皿中加入 3-5 ml 1×PBS，轻轻摇晃培养瓶以润洗培养皿表面，然后小心吸除 1×PBS。重复上述操作进行第二次 1×PBS 洗涤。</li>
	<li>将3 ml 0.05%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）分装至各培养皿中，轻轻摇动使胰蛋白酶-EDTA均匀覆盖细胞。于37 °C孵育2–3分钟。</li>
	<li>将脱离的细胞转移至15 ml离心管中，在4,000 x g下离心90秒。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于1 ml完全DMEM培养基中。</li>
	<li>使用血细胞计数板对细胞进行计数。计算需要多少个无热原、聚苯乙烯材质的 100 mm 细胞培养皿，以达到每平方厘米约 2,500–5,000 个细胞的初始接种密度。2.</li>
	<li>将按步骤1.2或1.3配制的完全细胞培养基在37 °C水浴中预热30–45分钟。</li>
	<li>用70%乙醇对培养基瓶和细胞冻存管进行去污染处理。此后所有操作均应无菌进行。</li>
	<li>将完全DMEM培养基每6 ml分装至若干个100 mm细胞培养皿中，培养皿数量应确保能够使用步骤2.6中所述接种密度将冻存细胞的全部体积接种完毕。</li>
	<li>将步骤2.6中计算出的细胞悬液体积转移至每个100 mm培养皿中。手动轻轻晃动每个培养皿，使细胞在培养皿表面均匀分布。</li>
	<li>将接种后的100 mm细胞培养皿置于37 °C、5% CO₂的培养箱中2 在培养箱中孵育细胞至少24小时，然后再进行后续步骤。</li>
</ol>
3. 传代培养
<ol>
	<li>在显微镜下观察每块细胞培养皿，确定细胞汇合度百分比（覆盖培养皿面积的细胞百分比）。将细胞放回培养箱，并预热完全培养基和1×PBS。若细胞汇合度达到80-100%，则进行下一步操作。</li>
	<li>小心吸去每块培养皿中的旧培养基，注意不要扰动细胞。</li>
	<li>每个培养皿中加入 3-5 ml 1× PBS，轻轻摇晃培养瓶以润洗培养皿表面，然后小心吸除 1× PBS。重复操作，进行第二次 1× PBS 洗涤。</li>
	<li>将3 ml 0.05%胰蛋白酶-EDTA分装至每个培养皿中，轻轻摇动使胰蛋白酶-EDTA均匀覆盖细胞。于37 °C孵育2–3分钟。</li>
	<li>孵育期间，将完全培养基每份10 ml分装至所需数量的培养皿中，以获得每平方厘米2,500–5,000个细胞的密度2.</li>
	<li>当细胞从培养皿上脱落时，迅速加入3 ml 1×定义型胰蛋白酶抑制剂，轻轻摇晃培养皿1分钟，以确保所有胰蛋白酶-EDTA均被中和。</li>
	<li>将已脱落的细胞转移至一个无菌的15 ml离心管中，备用。向培养皿中加入3 ml 1×PBS，收集残留的细胞，并将液体转移至同一15 ml离心管中。</li>
	<li>以150 × g离心5分钟，使细胞沉淀。</li>
	<li>吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于3 ml完全培养基中。</li>
	<li>使用血细胞计数板对细胞进行计数，并将细胞接种于含15 ml完全培养基的150 mm培养皿中，使细胞密度达到每平方厘米2,500–5,000个细胞2每次加帽结合实验使用两个150 mm的培养皿。 
	注意：液体培养基中氧气向细胞的扩散程度取决于培养液体积36建议在实验之间保持培养基体积的一致性，无论使用贴壁细胞还是悬浮细胞。为避免扩散差异，可对培养基进行预处理（如讨论部分所述，在工作站中孵育24小时）。</li>
	<li>将接种后的培养皿置于37 °C、5% CO₂的培养箱中培养2 在培养箱中孵育细胞，至少24小时后进行后续步骤。</li>
</ol>
4. 生理氧暴露
<ol>
	<li>在显微镜下观察细胞。为获得最佳结果，24小时暴露实验应确保细胞融合度为70-80%，48小时暴露实验为50-60%，72小时暴露实验为40-50%。</li>
	<li>将细胞放入低氧工作站中，根据实验需要设定处理时间（24、48或72小时）。</li>
	<li>将工作站设置为适当的生理氧浓度。 
	注意：例如，3% O2 的设定应同时包含5% CO2 和92% N2。 
	注意：若需在特定时间段内实现动态范围内的氧浓度波动，可将程序预设于仪器中，或在指定时间间隔手动调节氧浓度。</li>
	<li>将湿度设置为60%。尽管如此，工作站内环境仍较为干燥，在长时间实验（&#62;48小时）中培养基会明显蒸发。建议在工作站内放置一个细胞培养瓶作为培养基储备（使培养基与工作站内气氛达到平衡），以便补充细胞培养皿中的培养基。 
	注意：所有在细胞裂解前与细胞接触的溶液（如PBS和胰蛋白酶-EDTA）均应在低氧工作站内预平衡24小时，以使溶解氧与大气氧充分平衡36。</li>
	<li>在细胞裂解前，始终将细胞保留在工作站内。</li>
</ol>
5. 准备帽结合实验的缓冲液
<ol>
	<li>配制 1× Tris 缓冲盐水（TBS）。
	<ol>
		<li>在 800 ml 去离子水（dH2O）中溶解 8.76 g NaCl 和 6.05 g Tris 碱（Tris Base）。</li>
		<li>使用 1 M HCl 将溶液调至最终 pH 值为 7.4。</li>
		<li>用去离子水（dH2O）定容至 1 L。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制非变性裂解缓冲液。在进行帽结合实验当天配制裂解缓冲液。额外多配制一些裂解缓冲液，用于洗涤空白琼脂糖珠和 γ-氨基苯基-m7GTP 琼脂糖 C10 偶联珠（步骤 7.9 和 7.13）。
	<ol>
		<li>在 7 ml 去离子水（dH2O）中加入 160 µl 5 M NaCl、160 µl 1 M Tris-HCl（pH 7.4）、40 µl 200 mM NaF、40 µl 1 M MgCl2 和 40 µl 1 mM 原钒酸钠。</li>
		<li>向 7 ml 溶液中加入 40 µl Igepal。由于 Igepal 极为黏稠，建议剪去移液器吸头尖端以帮助吸取。</li>
		<li>通过反复吹打或涡旋混合 7 ml 溶液，直至 Igepal 完全溶解。</li>
		<li>将溶液终体积调至 8 ml，并置于冰上保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制 4× 十二烷基硫酸钠（SDS）-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）上样缓冲液。
	<ol>
		<li>在烧杯中混合 16 ml 1 M Tris-HCl（pH 6.8）、12.64 ml 甘油和 8 ml 二硫苏糖醇（DTT）。</li>
		<li>加入 3.2 g SDS 和 0.16 g 溴酚蓝。使用磁力搅拌器搅拌，使粉末完全溶解。</li>
		<li>分装至 1.5 ml 微量离心管中，于 -20 °C 保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 细胞裂解
<ol>
	<li>在进行帽结合实验当天，配制非变性裂解缓冲液并置于冰上保存。</li>
	<li>将1×PBS和胰蛋白酶在37 °C水浴中预热30分钟。</li>
	<li>为每项帽结合实验，将980 µl裂解缓冲液分装至1.5 ml微量离心管中。</li>
	<li>向980 µl裂解缓冲液中加入10 µl 4-(2-氨基乙基)苯磺酰氟盐酸盐和10 µl 100×蛋白酶抑制剂混合物。置于冰上保存。</li>
	<li>在低氧工作站内，将每个150 mm培养皿中的培养基弃入废液容器中。</li>
	<li>用3–4 ml预热的1×PBS洗涤细胞，并弃去所有液体。</li>
	<li>向每个培养皿中加入1 ml预热的0.05%胰蛋白酶-EDTA，静置2分钟，或直至细胞不再贴壁。</li>
	<li>使用移液器将一个培养皿中的细胞转移至1.5 ml微量离心管中。根据需要重复此步骤，使每个培养皿的细胞分别转移至独立的1.5 ml微量离心管中。</li>
	<li>以6,000 × g离心1.5 ml微量离心管90秒，使细胞沉淀。</li>
	<li>使用移液器吸除胰蛋白酶，避免扰动沉淀。若沉淀被扰动，需以6,000 × g再次离心90秒。</li>
	<li>通过轻轻吹打200 µl预热的1×PBS至沉淀上方，洗涤细胞。若沉淀被扰动，需重新离心。</li>
	<li>吸除PBS，避免扰动沉淀。</li>
	<li>从已配制的1 ml裂解缓冲液中移取500 µl至第一个细胞沉淀中。通过反复吹打完全重悬沉淀。</li>
	<li>将重悬的细胞与第二个细胞沉淀混合，并通过反复吹打重悬第二个沉淀。重复此过程，直至每个样品的所有沉淀均被合并并完全重悬。</li>
	<li>将裂解液转移至1.5 ml微量离心管中，与剩余的500 µl裂解缓冲液混合。</li>
	<li>将样品从低氧工作站中取出。 
	注意：加入裂解缓冲液后，所有后续步骤均应在常氧环境中进行，因为低氧工作站设定温度为37 °C，而后续步骤需在低温（4 °C或冰上）进行。</li>
	<li>在4 °C条件下旋转孵育1.5–2小时，通过温和振荡裂解细胞。</li>
	<li>在4 °C条件下以12,000 × g离心15分钟，去除细胞碎片。</li>
	<li>将上清液转移至新的1.5 ml微量离心管中，弃去沉淀。</li>
	<li>保留部分上清液（5–10%），作为全细胞裂解液输入对照，用于后续的Western印迹分析。</li>
</ol>
7. 帽结合实验
<ol>
	<li>每个样本中，加入50 µl空白琼脂糖珠对照悬液和50 µl γ-aminophenyl-m7GTP 琼脂糖 C10 连接珠悬液分装至 1.5 ml 微量离心管中。使用剪刀剪去移液器吸头尖端，以方便收集珠悬液。</li>
	<li>通过在500 × g下离心30秒使珠子沉淀。</li>
	<li>小心移除上清液，并将珠子重悬于500 µl TBS中。</li>
	<li>重复步骤 7.2 和 7.3。在 500 × g 离心 30 秒以沉淀磁珠，并移除上清液。</li>
	<li>将步骤6.19中含裂解液的上清液转移至含有空白琼脂糖珠的1.5 ml微量离心管中。 
	注意：空白琼脂糖珠用于预清除步骤，以去除裂解液中非特异性结合珠子的蛋白质。</li>
	<li>在 4 °C 下轻轻振荡孵育 10 分钟。</li>
	<li>将空白琼脂糖珠在500 × g离心30秒以沉淀。</li>
	<li>将裂解液转移至含有γ-aminophenyl-m的1.5 ml微量离心管中7GTP 琼脂糖 C10 连接珠</li>
	<li>将空白琼脂糖珠重悬于500 µl裂解缓冲液中，于500 × g离心30秒使珠子沉淀，弃去上清液。重复此步骤四次，共洗涤五次。</li>
	<li>将空白琼脂糖珠重悬于1× SDS-PAGE上样缓冲液中，95 °C煮沸90秒。置于-20 °C保存，用于后续Western印迹分析，以检测目标蛋白是否非特异性结合至珠粒。</li>
	<li>将裂解液与γ-氨基苯基-甲基7在4 °C下轻轻振荡孵育1小时，使用GTP琼脂糖C10交联珠捕获帽结合蛋白。</li>
	<li>离心收集γ-aminophenyl-m7通过在500 × g下离心30秒收集GTP琼脂糖C10交联珠，弃去上清液。</li>
	<li>洗涤 γ-aminophenyl-m7重复步骤7.9，使用GTP琼脂糖C10交联珠。</li>
	<li>将珠子重悬于600 µl裂解缓冲液中。</li>
	<li>加入GTP至终浓度为1 mM。</li>
	<li>孵育 γ-aminophenyl-m7GTP琼脂糖C10偶联珠 + 1 mM GTP，4 °C下轻柔振荡孵育1小时。注意：此步骤可解离与m非特异性结合的蛋白质7GTP（三磷酸鸟苷）即， 也与非甲基化的GTP相互作用。</li>
	<li>γ-氨基苯基-m沉淀7通过在500 × g下离心30秒，收集GTP琼脂糖C10交联珠。</li>
	<li>将上清液转移至新的1.5 ml微量离心管中，加入200 µl 4x SDS-PAGE上样缓冲液（50 mM Tris-HCl，100 mM DTT，2% SDS，0.1%溴酚蓝，10%甘油）。将GTP对照样品于-20 °C保存，用于后续的Western印迹分析37. 重复步骤 7.9 洗涤磁珠。</li>
	<li>将珠子重悬于1× SDS-PAGE上样缓冲液（50 mM Tris-HCl, 100 mM DTT, 2% SDS, 0.1%溴酚蓝和10%甘油）中，95 °C煮沸90秒。储存该样品于–20 °C，用于后续分析。7-20 °C 保存 GTP 结合部分，用于后续 Western 印迹分析37.</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

在生理性氧浓度条件下分析人细胞中的帽结合蛋白，有助于鉴定新型的氧调控翻译起始因子。这些因子与mRNA 5'端帽子结构或其他帽结合相关蛋白的亲和力，可通过其与m7GTP偶联琼脂糖微珠的结合强度来测定。该技术的一个局限性在于，它检测的是细胞裂解后蛋白的帽结合潜能，但实验在非变性条件下进行，能够维持蛋白质-蛋白质相互作用以及翻译后修饰（PTMs）。多个蛋白质-蛋白质相互作用介导了eIF4E家族与mRNA 5'端帽子结构的结合。4E-BP通过与eIF4E结合并阻断其与eIF4G的相互作用，从而抑制eIF4E功能，阻止43S前起始复合物的招募38。eIF4E/4E-BP复合物仍结合于mRNA 5'端帽子结构上，抑制该转录本的翻译起始，因此可在m7GTP亲和层析中作为eIF4E活性被抑制的标志。相反，eIF4E在m7GTP柱上与eIF4G的结合则可作为活跃翻译起始的标志。翻译后修饰（PTMs）是调控翻译起始因子活性的另一机制。例如，Mnk1对eIF4E的磷酸化可增强其与mRNA 5'端帽子结构的亲和力39。干扰素刺激基因15（ISG15）编...

转录后调控在基因表达中正逐渐被视为与转录调控同等重要的环节，尤其在细胞应激期间尤为显著1。翻译调控的关键环节在于起始阶段这一限速步骤，蛋白质合成的初始过程涉及真核起始因子4E（eIF4E）与mRNA 5'端的7-甲基鸟苷（m7GTP）帽子结构的结合2。eIF4E是名为eIF4F的三聚体复合物的一部分，该复合物还包括RNA解旋酶eIF4A和支架蛋白eIF4G，后者在招募其他翻译因子及40S核糖体过程中发挥必需作用3。在正常的生理条件下，绝大多数mRNA通过依赖帽子结构的机制进行翻译；但在细胞应激期间，约有10%的人类mRNA含有5'非翻译区（UTR），可能支持不依赖帽子结构的翻译起始1,4。传统上，依赖帽子结构的翻译与eIF4F复合物被视为同义，然而，应激条件下eIF4F的特异性变体已成为当前研究热点5-8。
多种细胞应激会通过雷帕霉素靶蛋白复合物1（mTORC1）抑制eIF4E的活性。该激酶在应激条件下功能受损，导致其下游靶标之一——4E结合蛋白（4E-BP）的活性增强。非磷酸化的4E-BP可结合eIF4E，阻断其与eIF4G的相互作用，从而抑制帽依赖性翻译9,10。有趣的是，eIF4E的一个同源蛋白eIF4E2（又称4EHP）与4E-BP的亲和力显著较低11，这可能使其逃避应激介导的抑制作用。事实上，尽管eIF4E2最初因其无法与eIF4G相互作用而被鉴定为翻译抑制因子12，但在缺氧应激期间，它能够启动数百种在其3'非翻译区含有RNA缺氧反应元件的mRNA的翻译6,13。这一激活过程依赖于eIF4G3、RNA结合蛋白基序4以及缺氧诱导因子（HIF）2α的协同作用，形成一种缺氧特异性的eIF4F复合物，即eIF4FH6,13。在正常条件下作为抑制因子时，eIF4E2则与GIGYF2和ZNF598结合14。这些复合物的部分成分是通过琼脂糖偶联的m7GTP亲和树脂鉴定出来的。这种经典方法15是翻译研究领域的标准技术，也是目前分离帽结合复合物最有效且最常用的手段，广泛应用于下拉实验和体外结合实验16-19。随着人们对帽依赖性翻译机制的认识不断深入，发现其组分具有高度的灵活性和可变性6-8,13，该方法成为快速鉴定参与应激反应的新型帽结合蛋白的有力工具。此外，eIF4F复合物的变异可能具有广泛意义，因为多个真核模式生物似乎利用eIF4E2同源蛋白应对应激，例如A. thaliana20、S. Pombe21、D. melanogaster22和C. elegans23。
有证据表明，eIF4F 的变化可能不仅限于应激条件，还参与正常生理过程24。组织中的氧气供应（在毛细血管末端）或组织内部（通过微电极测量）在不同器官中存在差异：脑部为 2–6%25，肺部为 3–12%26，肠道为 3.5–6%27，肝脏为 4%28，肾脏为 7–12%29，肌肉为 4%30，骨髓为 6–7%31。细胞和线粒体内的氧气浓度低于 1.3%32。这些数值远低于细胞常规培养所处的常氧环境，更接近缺氧状态。这表明，以往被认为仅在缺氧条件下发生的细胞过程，可能在生理条件下同样具有相关性。有趣的是，eIF4F 和 eIF4FH 在多种人类细胞系中，于生理氧浓度（即&#34;physioxia&#34;）环境下，积极参与不同类别或特定群体 mRNA 的翻译起始过程24。低氧环境还促进正常的胎儿发育33，且细胞在生理氧浓度下通常表现出更高的增殖速率、更长的寿命、更少的 DNA 损伤以及更弱的总体应激反应34。因此，eIF4FH 很可能是生理条件下选择性基因表达的关键因子。
本文提供了一种在固定的生理性氧浓度条件下，或在更接近组织微环境的动态波动氧浓度范围内培养细胞的实验方案。该方法的一个优势在于，细胞可在低氧工作站内直接裂解。而在其他实验方案中，从低氧细胞培养到细胞裂解的转换过程往往并不明确。通常情况下，细胞需先从小型低氧培养箱中取出后再进行裂解，但这种暴露于常氧环境的过程可能会影响细胞的生化通路，因为细胞对氧气变化的响应极为迅速（仅需一至两分钟）35。某些帽结合蛋白需要与第二个碱基相互作用，或能够水解m7GTP，因此在纯化过程中可能会遗漏部分帽结合蛋白。本方案中可使用与琼脂糖偶联的酶抗性帽类似物进行替代。通过本文所述方法研究eIF4FH及其他eIF4F变体的活性与组成，将有助于揭示细胞在生理条件或应激反应中所依赖的复杂基因表达机制。

<table><tbody><tr><td>&amp;gamma;-氨基苯基-m&lt;sup&gt;7&lt;/sup&gt;GTP 琼脂糖 C&lt;sub&gt;10&lt;/sub&gt;-偶联微珠</td><td>Jena Bioscience</td><td>AC-1555</td><td>琼脂糖偶联的 m&lt;sup&gt;7&lt;/sup&gt;GTP</td></tr><tr><td>100 mm 培养皿</td><td>Corning</td><td>877222</td><td>10 cm 培养皿</td></tr><tr><td>150 mm 培养皿</td><td>Thermofisher</td><td>130183</td><td>15 cm 培养皿</td></tr><tr><td>AEBSF 盐酸盐</td><td>ACROS Organics</td><td>A0356829</td><td>AEBSF</td></tr><tr><td>琼脂糖微珠</td><td>Jena Bioscience&amp;nbsp;</td><td>AC-0015</td><td>琼脂糖微珠对照</td></tr><tr><td>溴酚蓝</td><td>Fisher</td><td>BP112-25</td><td>SDS-PAGE 上样缓冲液组分</td></tr><tr><td>1.5 ml 离心管</td><td>FroggaBio</td><td>1210-00S</td><td>用于离心小体积样品</td></tr><tr><td>15 ml 锥形离心管</td><td>Fisher</td><td>1495970C</td><td>用于原代细胞培养</td></tr><tr><td>确定型胰蛋白酶抑制剂</td><td>Fisher</td><td>R007100</td><td>DTI</td></tr><tr><td>二硫苏糖醇</td><td>Fisher</td><td>BP172-25</td><td>DTT</td></tr><tr><td>上皮细胞培养基（完整试剂盒）</td><td>ScienCell</td><td>4101</td><td>包含血清和生长因子添加剂</td></tr><tr><td>甘油</td><td>Fisher</td><td>BP229-1</td><td>SDS-PAGE 上样缓冲液组分</td></tr><tr><td>100 mM 鸟苷-5'-三磷酸，1 ml</td><td>Jena Bioscience</td><td>272076-0251M</td><td>GTP</td></tr><tr><td>HCT116 结肠直肠癌细胞</td><td>ATCC</td><td>CCL-247</td><td>人源癌细胞系</td></tr><tr><td>人肾近端小管上皮细胞</td><td>ATCC</td><td>PCS-400-010</td><td>HRPTEC</td></tr><tr><td>Hyclone DMEM/高糖</td><td>GE Life Sciences</td><td>SH30022.01</td><td>人细胞培养的标准培养基</td></tr><tr><td>Hyclone 青霉素-链霉素溶液</td><td>GE Life Sciences</td><td>SV30010</td><td>DMEM 中的抗生素组分</td></tr><tr><td>H35 HypOxystation</td><td>Hypoxygen</td><td>N/A</td><td>低氧工作站</td></tr><tr><td>Igepal CA-630</td><td>MP Biomedicals</td><td>2198596</td><td>裂解缓冲液中的去垢剂组分</td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>Fisher</td><td>P288-500</td><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Fisher</td><td>P217-500</td><td>KCl</td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Fisher</td><td>M33-500</td><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Fisher</td><td>BP358-10</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>氟化钠</td><td>Fisher</td><td>5299-100</td><td>NaF（裂解缓冲液中的磷酸酶抑制剂组分）</td></tr><tr><td>磷酸氢二钠</td><td>Fisher</td><td>5369-500</td><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>优质胎牛血清</td><td>Seradigm</td><td>1500-500</td><td>FBS</td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合物（100 倍）</td><td>Cell Signalling</td><td>58715</td><td>裂解缓冲液组分</td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠</td><td>Fisher</td><td>BP166-100</td><td>SDS</td></tr><tr><td>正钒酸钠</td><td>Sigma</td><td>56508</td><td>Na&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;VO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Tris 碱</td><td>Fisher</td><td>BP152-5</td><td>缓冲液组分</td></tr><tr><td>0.05% 胰蛋白酶-EDTA（1 倍）</td><td>Life Technologies</td><td>2500-067</td><td>用于解离贴壁细胞的胰蛋白酶</td></tr></tbody></table>

生理氧条件下人细胞中帽结合蛋白的分析

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

转录后调控是基因表达调控的关键环节，尤其在细胞应激期间尤为重要。通过eIF4F复合物介导的帽依赖性翻译是真核细胞启动蛋白质合成最主要的途径，但目前正发现该复合物在特定应激条件下的变异形式。利用与琼脂糖偶联的m7GTP（一种5' mRNA帽子类似物）亲和树脂纯化帽结合蛋白，是鉴定参与翻译起始调控因子的有效工具。缺氧（低氧）是一种在胚胎发育和肿瘤进展过程中常见的细胞应激状态，其过程高度依赖于翻译调控。此外，最近有研究报道，人类成体器官的氧含量（生理氧水平为1–9%氧气）低于常规细胞培养所用的空气氧浓度，更接近于缺氧状态。随着对缺氧型eIF4F复合物（eIF4FH）的持续表征，人们对通过5' mRNA帽子结构理解氧依赖性翻译起始机制的兴趣日益增加。我们近期建立了一种人源细胞培养方法，用于分析受氧气可及性调控的帽结合蛋白。本方案强调，细胞培养和裂解步骤必须在缺氧工作站中进行，以避免接触氧气。为使液体培养基与工作站内气氛充分平衡，细胞至少需孵育24小时。若需更短时间点，可使用预先平衡的去氧培养基（预处理培养基）以克服此限制。某些帽结合蛋白需要与第二个碱基相互作用，或能够水解m7GTP，因此在纯化过程中可能遗漏部分帽结合分子。本方案中可替换为与酶抗性帽类似物偶联的琼脂糖树脂。该方法可帮助研究者鉴定参与帽依赖性翻译的新型氧调控翻译因子。

利用m7GTP亲和柱分析eIF4E和eIF4E2在不同氧浓度下的帽结合能力
图1和图2展示了两种主要帽结合蛋白在两种人源细胞系中响应氧气浓度变化的典型m7GTP亲和纯化结果的Western印迹图：图1为原代人肾近端小管上皮细胞（HRPTEC），图2为结直肠癌细胞（HCT116）。细胞在指定的氧气条件下培养24小时，以确保培养液中溶解的氧气与低氧工作站内的气体充分平衡。输入泳道（IN）代表加入m7GTP偶联琼脂糖 beads 前，全细胞裂解液的10%上样量。该输入泳道用作基准，以评估目标蛋白在m7GTP下拉实验中的富集程度。GTP泳道为使用1 mM GTP洗脱的m7GTP beads 洗脱液，此步骤可用于检测那些也能识...

本文介绍了在生理氧浓度条件下分析结合mRNA 5'端帽子结构的翻译起始因子的人源细胞培养方案。该方法利用琼脂糖偶联的m7GTP帽类似物，适用于研究帽结合因子及其相互作用分子。

转录调控是基因表达调控的关键环节，尤其在细胞应激期间尤为重要。通过eIF4F复合物介导的帽依赖性翻译……

本实验的总体目标是在低氧条件下捕获帽结合蛋白。该方法利用与琼脂糖连接的七甲基鸟苷帽类似物，来研究帽结合因子及其相互作用伙伴。该方法将有助于回答蛋白质合成领域中的关键问题，例如鉴定参与帽依赖性翻译的新型氧调控因子。该技术的主要优势在于，细胞从培养到裂解的整个过程均保持在低氧工作站中。该技术的应用意义延伸至癌症治疗领域，因为肿瘤内的癌细胞处于极低的氧气环境中，而翻译调控在肿瘤进展中起着关键作用。我们最初产生该方法的想法，是源于阅读了Corona同事近期发表的一项研究，该研究报道组织的实际氧合水平更接近于我们所说的低氧状态，而非细胞常规培养所用的常氧条件。按照文本方案中所述的细胞培养步骤开始本实验。使用血细胞计数板计数细胞后，将细胞接种于直径150毫米的培养皿中，每皿加入15毫升完全培养基，使细胞密度达到每平方厘米2500至5000个细胞。每个帽结合实验需使用两个直径150毫米的培养皿。将接种后的培养皿置于37摄氏度、5%二氧化碳气氛的培养箱中。待细胞培养至少24小时后，将细胞放入低氧工作站中处理所需时间。随后，将工作站调节至相应的生理氧浓度。将一份X浓度的磷酸盐缓冲液（PBS）和胰蛋白酶在37摄氏度水浴中预热30分钟。每个帽结合实验分别取980微升裂解缓冲液加入1.5毫升离心管中。在冰上向980微升裂解缓冲液中加入10微升100倍蛋白酶抑制剂混合液和10微升4-苯磺酰氟盐酸盐。在低氧工作站内，将每个150毫米培养皿中的培养基弃入废液容器中。随后，用3至4毫升预热的1× PBS洗涤细胞，并弃去液体。向每个培养皿中加入1毫升预热的0.5%胰蛋白酶EDTA，静置2分钟，或直至细胞不再贴附于培养皿表面。使用移液器将一个培养板中的细胞转移至1.5毫升微量离心管中。根据需要重复此操作，使每个培养板的细胞分别转移至单独的1.5毫升微量离心管中。在6000 ×g 条件下离心90秒，使细胞沉淀。离心后，用移液器吸取胰蛋白酶，注意不要扰动沉淀。用预热的1× PBS洗涤细胞，将200微升PBS轻轻滴加到离心管中沉淀上方。然后用移液器吸除PBS，注意不要扰动沉淀。接下来，从已配制的1毫升裂解缓冲液中吸取500微升，加入第一个细胞沉淀中。通过反复吹打彻底重悬沉淀。将重悬的细胞与第二个细胞沉淀混合，并通过反复吹打将第二个沉淀完全重悬。对每个样品重复此步骤，直至所有沉淀均已合并并重悬。接下来，将裂解液与剩余的 500 微升裂解缓冲液加入一个 1.5 毫升的微量离心管中。从低氧工作站中取出样品。将样品在4°C下轻轻振荡1.5至2小时，以裂解细胞。孵育结束后，在4°C下以1200 × g离心15分钟，去除细胞碎片。将上清液转移至新的1.5毫升微量离心管中，弃去沉淀。保留一部分上清液，作为蛋白质印迹分析的全细胞裂解液输入对照。为准备帽结合实验，用剪刀剪去移液器吸头尖端，以便收集珠子悬液。每个样品分别将50 µL的空白琼脂糖珠对照悬液和50 µL的m7GTP琼脂糖C10偶联珠悬液转移至不同的1.5 mL微量离心管中。然后，将悬液在500 × g离心30秒，使磁珠沉淀。小心移除上清液，并将磁珠重悬于500 µL的TBS中。重复上述步骤后，再次在500 × g离心30秒沉淀磁珠，并移除上清液。接下来，将含有裂解液的上清液转移至含有空白琼脂糖珠的1.5毫升微量离心管中。在4°C下轻轻振荡孵育10分钟。10分钟后，于500 × g离心30秒，使空白琼脂糖珠沉淀。离心后，将未结合到珠粒的裂解液转移至含有m7GTP琼脂糖C10连接珠粒的1.5毫升微量离心管中。用500微升裂解缓冲液重悬空白琼脂糖珠粒，于500 × g离心30秒使珠粒沉淀，弃去上清液。重复此步骤四次，共洗涤五次。将空白琼脂糖珠重新悬浮于一倍体积的SDS-PAGE上样缓冲液中，95摄氏度煮沸90秒。将样品于20摄氏度保存，用于后续的Western印迹分析，以观察目的蛋白是否非特异性结合到珠子上。将裂解液与 m7GTP 交联 C10 琼脂糖 beads 在 4 摄氏度下轻柔振荡孵育一小时，以捕获帽结合蛋白。振荡结束后，于 500 × g 离心 30 秒，收集 m7GTP 交联 C10 琼脂糖 beads。弃去上清液后，按前述方法洗涤 m7GTP 交联 C10 琼脂糖 beads。将珠子重悬于 600 µL 裂解缓冲液中，并加入 GTP 至终浓度为 1 mmol/L。将 m7GTP 琼脂糖 C10 偶联珠子与 1 mmol/L GTP 在 4 °C 条件下轻轻振荡孵育 1 小时。此步骤可解离与 m7GTP 非特异性结合的蛋白质。将m7GTP琼脂糖C10交联珠在500 × g离心30秒以收集沉淀。将上清液转移至新的1.5毫升微量离心管中，并加入200微升4× SDS-PAGE上样缓冲液。按照之前的方法洗涤珠子后，将珠子重悬于1× SDS-PAGE上样缓冲液中，在95°C下煮沸90秒。图中显示了在氧浓度波动条件下，人原代肾近端小管上皮细胞中两种主要帽子结合蛋白的典型 m7GTP 亲和纯化结果的代表性 Western 印迹。细胞裂解物分别暴露于 8%、5%、3% 或 1% 氧气环境中 24 小时。泳道包括：占总细胞裂解物 10% 的上样输入量（input）、经 GTP 洗脱以检测 m7GTP 特异性的对照，以及 GTP 洗脱后仍结合于 m7GTP 琼脂糖 beads 上的蛋白。通过 Image J 对至少三次独立实验的数据进行量化，并以相对于全细胞裂解液10%输入量的相对密度单位表示。结果表明，在生理氧条件下培养的人类细胞利用两种帽结合蛋白来招募不同的 mRNA 进行翻译。观看本视频后，您应能充分理解如何在低氧条件下捕获帽结合蛋白。进行此操作时，重要的是要记住，在裂解之前始终将细胞保留在低氧工作站中，因为氧气会迅速改变这些翻译起始因子的生物化学特性。在此步骤之后，可进一步采用其他方法（如多聚体分离纯化）来回答更多问题，例如在低氧条件下哪些帽结合蛋白与活跃的翻译过程相关联。

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Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

暴露在生理条件下的氧气在人体细胞中帽结合蛋白质分析

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用于氧气输送的分级多孔UiO-66纳米颗粒的合成、血红蛋白封装及生物正交PEG化

本方案描述了一种利用微电穿孔法高效转染新鲜分离的人绒毛细胞滋养层细胞中siRNA，并鉴定这些细胞中DNA-蛋白质复合物的方法。在4天的培养期间，可通过Western印迹和EMSA分析对转染细胞进行监测。...

新鲜分离的人绒毛细胞滋养层细胞的siRNA转染及EMSA分析

学习利用琼脂糖连接的m7GTP帽类似物在低氧条件下捕获帽结合蛋白的方法，以鉴定新型氧调控翻译因子。该技术有助于研究肿瘤细胞中的蛋白质合成调控机制。

生理氧条件下人细胞中帽结合蛋白的分析

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