利用转基因荧光小鼠和改良型背部皮肤折叠窗腔进行肿瘤相关血管的活体显微成像

本方案的总体目标是利用先进的背部背侧皮肤折叠室技术，在小鼠模型中详细研究肿瘤相关血管系统的发育过程。该方法有助于回答癌症领域中的关键问题，例如改善治疗策略以及理解肿瘤进展机制。该技术的主要优势在于能够在真实的生理环境中对生物学过程进行研究，并且能够对这些过程进行长期动态观察。

该操作将由本实验室的高级研究员 Ann Seynhaeve 博士进行演示。从非转基因供体小鼠身上，取一个直径为 10 mm 且无坏死的肿瘤组织片段，用于移植到受体小鼠的背部窗口腔室内。进行同系移植肿瘤实验时使用正常小鼠作为供体，进行异种移植时则使用免疫缺陷小鼠作为供体。

受体小鼠必须至少12周大，且体重达到20克或以上。所有外科手术操作均须在无菌条件下进行。例如，对手术器械和手术室材料进行高压灭菌处理。

在麻醉受体小鼠后，使用电动剪毛器去除整个背部的毛发，然后使用脱毛膏。用清水冲洗皮肤并擦干。最后，用乙醇擦拭脱毛后的皮肤以彻底清洁。

现在，沿脊柱标记一条水平中线。然后，将观察窗置于该线以下至少 2 mm 处，并在皮肤上标记观察窗的轮廓线。接着，使用手术刀和剪刀，仔细去除轮廓线内的皮肤，注意不要损伤下方的筋膜。

然后，提起皮肤褶，使用耳缘打孔器在窗口区域两侧各打一个1毫米的孔，用于固定窗口的螺栓。将背架放置于小鼠背部，并通过在螺栓上安装螺母来固定背架。接着，将皮肤拉过背架边缘2至3毫米，以确保其贴合牢固。

如果需要，使用23号针头穿过框架顶部的两个缝合孔。通过拧紧螺母来固定框架，并使用持针器夹紧螺母，注意不要过度拧紧，以免皮肤随螺栓转动。接着，将针头替换为缝合线，以将框架牢固地缝合在皮肤上。

现在将小鼠侧放。从该角度插入一块较厚的填充玻璃和一块标准的12毫米盖玻片。用固定环固定两者，使筋膜紧贴玻璃。

下一步是使用0.9%氯化钠溶液润湿观察窗。滴加几滴至观察区域，并吸去多余液体。现在，在观察窗稍下方，使用带有90度弯曲的25号针头在筋膜上制作一个深 pocket，以容纳1立方毫米的肿瘤组织。

然后将肿瘤组织插入该囊袋中。最后，使用标准的12毫米盖玻片和固定环封闭观察窗区域。任何气泡都将在1小时内消散。

在对小鼠进行麻醉前，将定制的温控平台预热至37摄氏度。麻醉小鼠后，将其放置在预热的平台上。连接鼻罩以输送异氟烷，若评估过程将超过五分钟，需使用眼用软膏。

现在，使用窗口的螺栓将腔室固定到定制支架上，并将支架固定在平台上。然后，用水和棉球清洁玻璃窗口。接着，在显微镜下使用10倍物镜，通过明场和荧光照明检查肿瘤中血管的发育情况。

大体检查完成后，打开共聚焦激光器。将显微镜控制面板设置为智能增益每转100伏，智能偏移每转10%，中等缩放倍数，中等X和Y轴位置，以及每转Z轴位置100微米。

将采集模式设置为 XYZ 或 XYZT。选择分辨率。选择 2 或 400 赫兹的采集速度。

将针孔设为一个艾里单位，并选择双向X选项。当检测多个可能存在光谱重叠的荧光染料时，应在帧间选择逐帧扫描模式以防止串色，并设置正确的光路。

将线平均值设为四，最后为实验选择一个新的数据集。现在，聚焦于目标组织，在此过程中，最好使用数值孔径较高的干镜。接下来，使用快速活体扫描，通过调整增益和偏移，使信号达到最佳信噪比，同时确保无过曝现象。

现在，在采集选项卡中选择Z轴层扫。进行快速Z轴扫描。根据快速扫描的结果，确定完整扫描的起始和终止位置。

然后，根据针孔大小设置Z步长，并进行完整扫描。在肿瘤移植后，使用所述方案对表达荧光标记的宿主小鼠进行成像。eNOStag-GFP标记在内皮细胞的高尔基体和细胞膜中表达。

ROSAmT/mG 标记在所有细胞中表达红色荧光，而在表达 Cre 重组酶的细胞中表达绿色荧光。该技术的一个应用是研究血管发育，因为在肿瘤中可以观察到血管发育的所有阶段。例如，可以观察到内皮细胞前沿向无血管区域出芽生长。

肿瘤还具有受损的血管以及由成熟分支血管构成的稳定血管网络。另一种应用是通过标记血液（如荧光纳米颗粒）来研究管腔形成、血流和血管外渗。因此，可以在血管管腔内以及内皮尖端细胞附近观察到血流情况。

在尖端细胞中，可观察到管腔的形成以及库存情况。活体显微镜还可用于研究化疗药物的作用。例如，在将纳米颗粒注射到eNOStag-GFP动物体内24小时后，纳米颗粒仍保留在血管系统中，仅有极少部分外渗至肿瘤间质。

然而，当纳米颗粒与TNF联合给药时，可观察到纳米颗粒渗出至肿瘤间质中，这表明肿瘤内的药物递送量有所增加。观看本视频后，您应能够充分掌握背侧皮肤折叠窗植入技术，并了解如何利用共聚焦显微镜研究与肿瘤相关的过程。