应用先进的背皮窗室对转基因荧光小鼠肿瘤相关血管的活体显微镜观察
2018年1月19日
该协议描述了表达细胞特异荧光标记的转基因小鼠的活体成像。活体成像提供了一种非侵入性的方法, 用于高分辨率观察活体动物使用植入窗口, 通过它的微观可视化过程是可能的。这种方法对于研究纵向过程尤其有用。
该协议的总体目标是使用先进的背侧皮褶室在小鼠模型中详细检查肿瘤相关脉管系统的发展。这种方法可以帮助回答癌症领域的关键问题，例如改进治疗和了解肿瘤进展。这种技术的主要优点是可以在正确的环境中、在真实的生活中研究过程，并且这些过程可以随着时间的推移而研究。
该程序将由我实验室的高级研究员 Ann Seynhaeve 博士演示。从非转基因供体小鼠中，收获直径为 10 mm 的非坏死肿瘤片段，用于植入受体小鼠的背窗室。使用正常小鼠供体进行同基因肿瘤治疗，或将免疫缺陷小鼠供体用于异种移植物。
受体小鼠必须至少 12 周大，体重为 20 克或以上。在无菌条件下进行所有外科手术。例如，对手术器械和腔室材料进行高压灭菌。
对受体小鼠进行镇静后，使用电动修剪器去除整个背面的毛发，然后使用脱毛凝胶。将皮肤冲洗干净并擦干。最后，用乙醇将脱毛的皮肤擦洗干净。
现在，沿 Spine 标记一条水平中心线。然后，将视图窗口放置在线下方至少 2 毫米的位置，并在蒙皮上标记窗口的周长。接下来，使用手术刀和剪刀小心地去除周边线内的皮肤，不要损坏下面的筋膜。
然后，拉起皮褶并使用打耳器在窗户区域的两侧引入 1 毫米的孔，用于将窗户固定到位的螺栓。将背架放在鼠标上，然后将螺母放在螺栓上固定框架。接下来，将蒙皮拉过框架两到三毫米，以确保它合适。
如果是这样，请将 23 号针刺入框架顶部的两个缝合孔。通过拧紧螺母来固定框架，并用夹紧针架固定它们 不要过度拧紧螺母并防止皮肤转动螺栓。接下来，用缝合线更换针头，将框架固定在皮肤上。
现在将鼠标转到一侧。从这个角度引入一块厚填充玻璃和一个标准的 12 毫米盖板玻璃。用固定环固定两者，使面板紧贴玻璃。
下一步是使用 0.9% 氯化钠水合窗口。让几滴落在观察区域并吸收多余的部分。现在，在窗口正下方，使用一根 25 号针头弯曲 90 度，在筋膜上做一个深口袋，可以容纳一立方毫米的肿瘤组织。
然后将肿瘤组织插入口袋中。最后，使用标准的 12 毫米盖玻片和固定环关闭窗口视图区域。任何气泡都会在一小时内消散。
在对鼠标进行镇静之前，将定制的温控平台加热至 37 摄氏度。让鼠标镇静后，将其放在加热的平台上。连接鼻锥以输送异氟醚，如果评估需要五分钟以上，请进行眼科预约。
现在，使用窗户的螺栓将腔室用螺栓固定在定制的支架上，并将支架固定到平台上。然后，用水和棉花清洁玻璃窗。现在，在显微镜下，在明场和荧光下使用 10 倍物镜检查肿瘤中的血管发育。
大体检查后，打开共聚焦激光器。将显微镜控制面板设置为每转 100 伏特的智能增益。每圈 10% 的智能偏移，中等缩放的中等 X 和 Y 定位以及每圈 100 微米的 Z 位置。
将采集模式设置为 XYZ 或 XYZT。选择分辨率。选择 2 或 400 赫兹的采集速度。
将针孔设置为一个通风单元。并选择双向 X 选项。当评估具有可能重叠光谱范围的多个荧光基团时，选择帧之间的顺序扫描以防止渗漏并设置正确的光束路径。
将线平均值设置为 4，最后，为实验选择新的数据集。现在，专注于感兴趣的组织，最好使用具有更高数值孔径的干镜片。接下来，使用快速实时扫描，通过将增益和偏移调整到没有过度曝光的位置来获得最佳信噪比。
现在，在 acquire 选项卡中选择 Z 堆栈。进行快速 Z 扫描。从快速扫描中，确定完全扫描的开始和结束位置。
然后，根据针孔大小设置 Z 步长并继续进行全扫描。使用所述方案在肿瘤植入后对表达荧光标记的宿主小鼠进行成像。eNOStag-GFP 标记在高尔基体和内皮细胞的细胞膜中表达。
ROSAmT/mG 标记在表达 Cre 重组酶的细胞中普遍表达红色荧光和绿色荧光。该技术的一个应用是研究血管发育，因为所有阶段都可以在肿瘤中看到。例如，可以看到内皮前沿发芽到未血管化的区域。
肿瘤也有受损的血管和已建立的血管床和成熟的分支血管。另一个应用是通过对血液应用标记（例如发出荧光的纳米颗粒）来研究管腔形成、血流和外渗。因此，可以在血管管腔和内皮尖端细胞附近观察到血流。
在尖端细胞中，可以观察到管腔的形成。活体显微镜也可用于研究化疗药物的效果。例如，将纳米颗粒注射到 eNOStag-GFP 动物体内 24 小时后，纳米颗粒保留在脉管系统中，外渗到肿瘤间质中的可能性最小。
然而，当纳米颗粒与 TNF 联合给药时，观察到外渗到肿瘤间质中。这是肿瘤间药物递送增加的证据。观看此视频后，您应该对如何安装背侧皮褶窗室以及如何使用共聚焦显微镜研究肿瘤相关过程有很好的了解。
概述
本协议概述了使用先进的背部皮褶室进行转基因小鼠肿瘤相关血管的活体成像。这种无创成像技术允许对生物过程进行长期高分辨率观察。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 肿瘤学
- 成像技术
背景
- 活体成像为活体生物系统提供了洞察。
- 带有荧光标记的转基因小鼠能够可视化特定细胞类型。
- 这种方法特别适用于研究肿瘤进展和治疗反应。
- 可以进行纵向研究以观察随时间变化的情况。
研究目的
- 检查小鼠模型中肿瘤相关血管的发展。
- 提高对肿瘤进展和治疗干预的理解。
- 利用先进的成像技术进行实时观察。
使用的方法
- 将肿瘤碎片植入背部窗口室。
- 在无菌条件下进行手术程序。
- 使用共聚焦显微镜对血管发育进行成像。
- 应用荧光标记以研究血流和血管形成。
主要结果
- 观察肿瘤中的内皮前沿和腔形成。
- 观察血流动力学和纳米颗粒的血管外渗。
- 证据表明TNF治疗可增强药物向肿瘤间质的递送。
- 展示了该技术在癌症研究中的实用性。
结论
- 背部皮褶室有效用于研究肿瘤血管。
- 活体成像可以揭示肿瘤生物学的关键洞察。
- 该方法在评估治疗策略方面具有潜在应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Dynamic, high-resolution intravital microscopy of tumor-associated vasculature enables real-time assessment of vascular development, drug delivery, and therapeutic response in preclinical oncology models. This approach addresses the limitations of static histology by providing temporal and spatial insights critical for target validation and mechanistic de-risking. Integration of transgenic fluorescent models and advanced imaging chambers supports predictive confidence at key discovery and translational inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of tumor vessel formation and remodeling in vivo.
- Supports mechanistic de-risking by tracking endothelial tip cell dynamics and lumen formation.
- Facilitates functional validation of vascular targets through longitudinal imaging.
- Improves predictive confidence for anti-angiogenic and vascular-targeted therapies.
Screening & Assay Development
- Provides a validated, reproducible platform for evaluating compound effects on tumor vasculature.
- Generates quantitative outputs such as blood flow, extravasation, and vascular integrity.
- Enables standardization of imaging parameters for cross-study comparability.
- Supports screening of nanoparticle and chemotherapeutic delivery in a physiologically relevant context.
Translational & Preclinical Research
- Aligns preclinical vascular responses with disease-relevant tumor microenvironments.
- Enables assessment of therapeutic modulation of vascular permeability and drug localization.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation of vascular-targeted interventions.
- Provides translational biomarker insights for vascular response and drug delivery efficacy.
Pipeline & Workflow Integration
This intravital imaging workflow bridges early discovery, lead identification, and preclinical validation by enabling real-time, quantitative assessment of tumor vasculature and therapeutic response in transgenic mouse models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on vascular development, tip cell behavior, and drug-induced vascular changes.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative imaging outputs for compound evaluation and assay standardization.
- Analytics: Provides high-content readouts on blood flow, extravasation, and vessel integrity for comparative analysis.
- Translational Research: Aligns imaging outputs with disease-relevant vascular phenotypes and drug delivery endpoints.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for diverse oncology and vascular biology programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in vascular target validation.
- Operational Value: Standardizes imaging protocols for reproducibility and scalability across studies.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by providing actionable, real-time vascular response data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of vascular-targeted and drug delivery programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in surgical implantation and advanced confocal microscopy.
- Demands access to transgenic fluorescent mouse lines and imaging infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of imaging parameters and data analysis workflows.
- Adaptation may be needed for different tumor models or therapeutic modalities.
- Potential limitations include surgical complexity and animal welfare considerations.
