通过神经残端将钙染料载入蛙类神经末梢：蛙类神经肌肉接头中钙瞬变的记录

大家好，我叫Dimitry Samigullin，我在俄罗斯科学院卡赞生物化学与生物物理学研究所的突触过程生物物理学实验室工作。在我们实验室，我们研究神经肌肉接头中钙信号传导的多种方式。测量突触钙水平最常用的方法之一是光学记录。

本文介绍了通过蛙类神经残端向神经末梢加载钙离子敏感性染料的方法，同时提供了检测和分析蛙类神经末梢大规模钙瞬变的实验方案。利用该方法，可研究活性药物在突触活动期间对突触前钙离子水平的影响。

配制染料加载溶液。荧光素钙染料俄勒冈绿BAPTA以少量粉末形式提供，每管500微克，体积为500微升。向粉末中加入14微升含有HEPES的溶液。

涡旋混匀上样溶液，并离心以充分混合。用铝箔包裹含有上样溶液的样品瓶，避免光照。将上样溶液于-20摄氏度冷冻保存。

染料加载步骤。从动物体内解剖出皮肤胸肌。将解剖得到的组织固定在银衬里培养皿中。

用精细的不锈钢针固定组织。向培养皿中加入任氏液。使用剃须刀片从微量移液管的细端切下一小段，长约2毫米。

准备一块橡皮泥，用于将充液毛细管固定在培养皿上。通过硅胶管和由移液管制成的接头，将充液毛细管与塑料注射器连接。用塑料移液管吸除培养皿中的临时任氏液。

使用注射器进行干燥处理，以防止填充移液管时吸入溶液。将装有上样溶液的小瓶从冷冻箱中取出，置于避光处室温下解冻。

在显微镜下，使用精细镊子和剪刀，在可视控制下，无菌地靠近肌肉切断神经。保留约两毫米长的神经残端。使用橡皮泥将装有导管和注射器的填充移液管固定在培养皿上。

将其移至神经分支附近。用灌注移液管轻轻吸引神经残端。从灌注移液管的钝端移除吸管。

用注射器将填充移液管中的神经残端干燥。将带有神经残端的填充移液管向上移动。用凡士林将神经残端与外界隔离。

再次使用注射器通过填充移液管干燥神经残端。使用带长移液管尖的移液器吸取零点五微升的上样溶液。将含有上样溶液的移液管尖轻轻插入填充移液管中。

将混合物直接注入神经残端。用凡士林封闭灌注移液管的开口端。向培养皿中加入少量溶液。

将制备物置于避光且湿润的环境中，室温孵育5小时。孵育结束后，取出制备物，移除含有上样溶液的灌注毛细管。将制备物放入浴槽中，用任氏液冲洗。

将标本连同浴液在8 °C温度下于冰箱中孵育过夜。准备组织以进行显微镜观察。从浴液中取出标本。

将组织置于银衬室中固定，并轻轻拉伸。用新鲜的任氏液冲洗组织。取吸吮刺激电极。

将刺激吸引电极放入腔室中，使其尖端靠近神经的切断端。将神经吸入电极内。电极的构建方法详见Khazokoff的文章，该文章链接位于材料部分。

将制备室固定在显微镜载物台上。放置温度探针。将进液管与制备室中珀尔帖元件的电源线连接。

将流出管放入灌流室中。打开灌流泵。开启温度控制器单元。

将控制器单元的温度设置为达到 20 摄氏度。安装紫外线防护罩。在刺激器上设置延迟持续时间和周期。

将一根导线从吸电极连接到刺激器上，然后打开电源。在低倍物镜下，通过开启刺激来观察肌肉收缩情况。

用低钙高镁的任氏液填充灌流系统，设置灌流速度约为每分钟2毫升。更换物镜至40倍放大倍数。

打开Polychrome V，选择发射波长并设置为连续模式照明。打开快门。在40倍物镜和荧光模式照明下，确保末端已加载。

找到神经末梢并将其作为观察重点。图中显示了已加载的神经以及充分加载的运动神经末梢。使用Red-Short Neuro CCD相机进行视频采集。

运行 Turbo-SM 软件。选择并更改设置。输入的帧数为 500。

输入实验名称。基本配置为每秒1000帧。80乘以80。

选择外部触发。输入触发前时间。负十毫秒。

输入重复次数，20。在 Polychrome 软件中选择外部触发照明模式。运行 Clampex 软件。

加载刺激程序。该程序可从喀山联邦大学网站的实验室页面下载。在记录之前，需在Turbo-SM软件中采集暗场图像。

在三目立方体上选择光路切换级别，将100%光路导向相机。运行刺激程序。

选择感兴趣区域并检测信号。在神经刺激下，我们记录到荧光强度的变化，该变化反映了钙离子进入神经末梢的过程。数据分析。

在 Turbo-SM 软件中，选择文件。然后选择平均文件。选择文件。

输入平均文件的名称，并对其进行平均。将平均文件保存为拟合文件。选择并另存为拟合文件。

输入文件名并保存。运行 Image J，然后打开以下工具：分析、工具、ROI 管理器。

在 fit 格式中找到已保存的平均文件。将其拖放到 Image J 中。缩放窗口以获得更好的视野。在您认为是背景的区域上选择一个矩形兴趣区域。

将其添加到 ROI 管理器。在 ROI 管理器中，选择“更多”>“多测量”。加载下均值。

复制数据并导出至 Excel。在 Excel 中，使用平均值函数计算背景的平均值以获得比值。在不关闭 Excel 的情况下，返回至 Image J，关闭背景计算窗口且不保存。

使用 ROI 管理器删除矩形背景绘制。打开仪器处理中的数学减法功能，输入从 Excel 计算得到的平均阈值，从图像栈中减去背景值。

在神经末梢周围选择一个矩形的兴趣区域。将其添加到 ROI 管理器中。在 ROI 管理器中，选择“更多”，然后选择“多测量”，加载下拉菜单，选择“平均值”。

在 Excel 窗口中复制并粘贴。使用 Excel 工具绘制图表。在信号开始前选择一个平坦区域。

加载图形，包含从静息状态下的初始荧光值到信号起始阶段的详细信息。然后确定用于平均静息荧光值的数据点数量。对这些数值进行平均，进而计算出静息状态下荧光的平均值。

将信号除以静息时的荧光强度，减去1，再乘以100%。绘制信号曲线，并计算钙瞬变的幅度。

荧光信号的时间参数取决于钙离子与染料形成复合物的正向和/或逆向反应速度。钙信号的上升时间反映了钙离子进入的动力学过程、其在末梢的扩散以及钙离子与染料的相互作用。

钙瞬变的衰减速率取决于染料的亲和力、钙缓冲及其被清除的速率。通过分析钙瞬变的幅度，可用于研究不同活性物质对参与神经递质释放的钙内流的影响。该负载技术非常适用于细胞质钙变化的成像研究。

利用荧光指示剂，结合单根神经刺激和节律性突触活动，可通过分析钙瞬变幅度来研究不同物质对参与神经递质释放的钙离子内流的影响。以下几点需要特别注意。

孵育步骤包括两个阶段：室温孵育和冰箱孵育。控制染料在室温下的孵育时间非常重要。

根据神经残端的长度、染料种类以及室温条件，孵育时间可能有所不同。如果孵育时间过长，术前的神经末梢及靠近神经残端的近端部分可能会过载。由于在冰箱中孵育时间较长，染料可沿神经末梢均匀分布。

在切断神经后数分钟内，必须将其放入染料加载溶液中，以使染料进入神经；若间隔时间过长，则会导致加载效果不佳，这可能是由于神经断端闭合所致。为减少染料在局部聚集，可使用染料的延长形式。必须避免对组织进行长时间的荧光照射，因为这会影响其存活。

我们使用可见光通道的微分干涉差（Nomarski）光学系统来寻找神经末梢。在记录过程中，通过光圈限制照明视野。利用神经的快门印记可缩短加载过程的持续时间。

在这种情况下，可以使用玻璃微旁路。