在无异源条件下通过三维培养制备并给予治疗性间充质干细胞/基质细胞（MSC）球体

这些实验的总体目标是高效地生成和注射经无异源条件预处理的间充质干细胞/基质细胞（MSCs）的治疗性球形聚集体（即球体），用于实验和临床应用。这些方法有助于克服MSC治疗领域中的主要障碍，例如分散细胞移植后常见的细胞滞留率低、存活率差和功能不佳，以及与组织损伤相关的不利环境条件。

这些操作方法的主要优势在于，MSC 球体的制备、预处理和注射均可在无免疫原性动物源成分（如 FBS）的条件下完成，而 FBS 目前限制了细胞的部分临床应用，也可能干扰部分临床前数据的解读。尽管这一机制在介导基于 MSC 的治疗效果方面具有潜在的重要益处，但它也可用于理解 MSC 介导的组织修复过程，以及不同培养基配方如何改变治疗相关的基因表达谱。本实验操作将由我实验室的两名技术人员 Josh Beaver 和 Bret Clough 进行示范。

按照文本方案接种并培养间充质干细胞后，使用胰蛋白酶和EDTA消化细胞，收集细胞并在450 × g条件下离心，将所有细胞合并至一个锥形管中，加入适量培养基。离心后，用少量培养基重悬细胞沉淀。计数细胞后，为形成约25,000个细胞的类球体，将收获的MSCs用以下培养基之一稀释至每微升714个细胞。

接下来，将35微升细胞悬液滴加到直径150毫米倒置培养皿盖的底部。向培养皿底部加入20毫升室温磷酸盐缓冲液（PBS），然后连续而稳定地将带有液滴的皿盖翻转，使液滴顶端朝下。随后小心地将皿盖放置在培养皿底部上。

将培养皿转移至培养箱中，静置培养三天，期间避免扰动，以确保类球体正常组装。培养结束后，开始类球体收获：小心取下皿盖并翻转，使液滴重新朝上；随后将皿盖倾斜约10至20度，用细胞刮铲将含有类球体的液滴推至培养皿边缘。

使用1 mL移液器，将球状体的终末培养基转移至15 mL锥形管中，并使用室温PBS和同一移液器吸头清洗培养板，以确保最大限度回收球状体。进行实时PCR实验时，在室温下以450 × g离心球状体悬液5分钟，然后吸除上清液。

用 PBS 洗涤类球体，并重复离心和吸除步骤。若需将类球体递送至动物体内，则无需离心，让类球体自然沉降至管底。为收集条件培养基（CM），用于后续免疫调节及抗肿瘤潜能检测，参照前述方法，使用细胞刮和移液器收集类球体及 CM 培养基至 15 毫升锥形管中。

但是，不要用 PBS 清洗盖子。在 450 × g 条件下离心 5 到 10 分钟后，将上清液转移至 1.5 毫升离心管中。随后在室温下以 10,000 × g 离心上清液 5 到 10 分钟。

然后使用移液器小心地将澄清的上清液收集到新的1.5毫升离心管中，于-80摄氏度保存。按照本视频刚刚演示的方法制备类球体后，静置3至4分钟使其沉降至管底，吸除上清液，并加入含0.2%至0.5%人血清白蛋白（HSA）的HBSS洗涤类球体，以维持无异源条件。接着，吸除上清液。

将 100 至 200 微升无菌 HBSS/HSA 覆盖于类球体上，将试管置于冰上。根据文本方案麻醉小鼠后，将动物放入 BSL-2 柜中，背侧朝下，用 70% 乙醇消毒小鼠下腹部。取下 20 号静脉留置针的保护帽，一手固定小鼠皮肤，找到屈曲膝关节与生殖区域之间人工连线的中点，将留置针套管针尖朝向中线，另一手进行腹腔注射。

轻轻将金属导丝针从导管导丝组件中取出。检查导丝上是否有血液、尿液或粪便，如有则将其丢弃。通过将装有100微升无菌HBSS/HSA的100至200微升移液器吸头插入导管注射器接头并形成紧密密封，以确认塑料导管位置正确。

然后缓慢将液体注入腹腔内。使用100至200微升的移液器吸头，收集MSA类球体及HBSS/HSA，并将全部体积通过导管注入腹腔，操作方法如前所示。接着，用100微升HBSS/HSA冲洗含有类球体的管子，并将全部体积的类球体转移至腹腔内。

将浸有消毒剂的纱布垫覆盖在导管上，缓慢地将导管从腹腔中取出并丢弃。检查导管上是否有残留的类球体。然后用手指轻轻按摩腹腔，以确保类球体均匀分布。

在将类球体注入小鼠后，立即将40至120个用于注射的类球体转移至含有1至2毫升添加了2% FBS和1×青霉素-链霉素的Alpha MEM培养基的12孔或6孔板中，以评估其活化水平。6小时后，将孔中的培养基转移至1.5或15毫升离心管中，在室温下以450 × g离心5分钟。最后，将澄清的条件培养基（CM）转移至新的1.5毫升离心管中，并按照试剂盒说明书使用商用ELISA试剂盒检测PGE-2浓度。

如图所示，当约 25,000 个 MSC 悬浮于 35 微升 CCM 液滴中时，细胞首先聚集成小的细胞团，最终在 72 小时后于液滴顶端融合形成一个致密的单细胞球。该图表明，单个致密细胞球及 XFM-1 的形成需要添加 13 毫克/毫升 HSA，该浓度反映了 CCM 中估计的总蛋白含量。在细胞球形成过程中，MSC 的表型发生显著改变；当处于适当化学成分明确且无异源的培养基中时，多种抗炎因子（包括 PGE2 和 TSG6）的表达上调。

然而，在不含HSA的XFM-2或XFM-1培养基中以球体形式培养的MSCs，其TSG6和PGE2的产生并未显著增加。最后，与体外效应类似，在通过静脉注射LPS诱导系统性炎症后，立即向小鼠腹腔注射XFM-1 HSA球体，可提高腹腔内PGE2和IL-10水平，同时降低促炎性TNF alpha。一旦掌握操作技巧，每块悬滴培养板可在一至两分钟内完成制备。

完整类球体的腹腔递送在操作得当的情况下，每只动物可在5至10分钟内完成。采用悬滴法生成间充质干细胞（MSC）类球体时，需注意不同的无异源成分培养基配方在类球体形成及促进治疗相关基因表达方面效果并不相同。在完成该操作后，可采用其他方法（如共聚焦显微镜）进一步研究MSC在类球体中的空间分布，以及类球体不同区域中MSC可能激活的其他信号通路。

在此技术发展之后，该方法使MSC科学家能够研究其他三维培养条件及其对MSC启动和治疗性基因表达的影响。观看本视频后，您应充分了解如何利用悬滴法将MSC启动为球状体，如何在体外评估其治疗效果，以及如何将完整球状体有效递送至小鼠体内以进行体内疗效测试。此外，请务必注意，操作成人人类干细胞需要特殊的设备和培训，若细胞处理不当，可能存在安全隐患。

处理成人人类干细胞时，必须始终穿戴适当的个人防护装备。