在子宫内电途径研究神经元亚群的兴奋性和单细胞连接

这种子宫内电穿孔方法的总体目标是表征正常和实验条件下皮层神经元的结构连接性和兴奋性。这种方法可以帮助回答发育神经生物学中的关键问题，例如剖析大脑的结构和功能连接以及认知障碍的生物学。该技术的主要优点是它允许标记稀疏的神经元群，并允许您整理树突并访问单个神经元，从而实现更高效、更精细的定量分析。

注射前，每次手术准备 10 μL DNA 混合物，用于单细胞标记或标准膜片钳研究。然后，用手指轻轻作胚胎以定位端脑。接下来，将准备好的硼硅酸盐毛细管放入口腔移液器中。

将针尖穿过子宫，避开血管，直到到达侧脑室。之后，缓慢注入大约 1 μL Fast Green 色 DNA 溶液，直到观察到一个大的蓝色点。该程序的一个关键步骤是 DNA 的注射。

这应该尽可能轻柔地进行。现在，将 7 毫米铂电极横向放在胚胎头部，并通过铂电极施加电压。在此过程中，在 4 摄氏度的 PBS 中用 10 毫升 30% 蔗糖冷冻保护固定的大脑 1 到 2 天，直到它们下沉。

然后准备一个切块的厘米铝箔块，将立方体装满 2/3 或用 OCT 填充。然后，将大脑放入立方体中并在干冰上冷冻。随后将冷冻的大脑储存在 80 摄氏度。

要在低温恒温器中对大脑进行切片，请在标本盘表面滴一滴 OCT。从组织学块上剥下铝箔，并将块以所需的方向放置在液体 OCT 的顶部。用力按压直到组织学块固定。

然后将标本盘插入低温恒温器的标本头，并确定标本的方向以进行切片。然后切片 50-100 微米厚的切片，并使用细刷将浮动冷冻切片转移到 PBS 中。随后，在室温下用含有 0.5% Triton X-100 的 5% 胎牛血清的 PBS 溶液封闭切片 1 小时。

接下来，将它们在 4 摄氏度下用 1：500 的一抗（在封闭溶液中稀释）孵育过夜。第二天，在 PBS 中洗涤切片 3 次。加入用封闭溶液稀释的 1：500 二抗，并在室温下孵育切片 1 小时。

然后在 PBS 中洗涤切片 3 次。然后，在含有 0.5% Triton X-100 的 PBS 中用 dapE 对切片进行复染 10 分钟。用 PBS 冲洗切片并用封固剂封固。

为了重建神经元，以高放大倍率和高分辨率获取大脑切片的图像。接下来，在采集软件中选择 Tile Scan 以覆盖感兴趣的区域，跨越所有树突和轴突过程。在 Z 轴上获取足够数量的堆栈以避免信息丢失。

之后，打开图像并从菜单中选择 segmented line 选项。沿着神经元的结构画一条线。随后，转到 分析， 工具，然后是 ROI 管理器，然后 添加 保存线路。

对分析神经元的每个轴突或树突重复此过程。在 ROI Manager 菜单中，按 Measure 获取长度。将测量结果导出到文本文件或电子表格进行分析。

为了记录来自 GFP 电穿孔小鼠的 GFP 表达的神经元，请将大脑置于冷藏的培养皿中。用小剪刀剪掉小脑。然后用抹刀捡起大脑，用纸巾吸干。

将大脑的腹侧尾平面粘在振动切片机支架上。将支架放在装满冰冷 ACSF 的振动切片机上，并确保振动切片机腔室连续碳化。然后，通过在 15 分钟内切割 300 微米的冠状切片来获得急性切片。

接下来，将急性切片在 25 摄氏度下在 ACSF 中孵育至少 60 分钟，同时用碳水化合物鼓泡。60 分钟后，使用巴斯德移液器或小刷子将切片转移到记录室中。用竖琴压住切片，然后以每分钟 2 毫升的速度用 ACSF 搅拌。

要修补 GFP 阳性神经元，请通过显微镜以 10 倍定位感兴趣区域。然后使用 60 倍物镜找到一个 GFP 阳性细胞。接下来，用细胞内溶液填充记录电极。

随后，将玻璃移液器放入移液器架中。然后，将移液器吸头放入浴中并聚焦在吸头上。移液器放入浴槽后，通过背压控制系统施加正压。

在视觉引导下接近感兴趣的细胞，同时保持移液器中的背压。当细胞表面出现一个小酒窝时，释放压力。此时，可能会形成电阻大于 1 千兆欧姆的紧密密封。

否则，施加轻微的负压以促进它。在形成密封时，将保持电压夹调至 60 毫伏。一旦形成千兆欧姆密封，施加吸力脉冲以破坏细胞膜并进入整个细胞模式。

进入整节电池模式后，从电压钳切换到电流钳模式并开始记录。这些图像显示了在胚胎第 15.5 天通过子宫内电穿孔将载体递送到第 2/3 层神经元，并且在出生后第 16 天制备冠状切片。将 CAG DsRed2 载体作为对照共转染。

GFP 仅在那些也掺入 cre 的神经元中表达，从而允许 CALNL GFP 载体中的 LoxP 位点重组。这是另一个稀疏标记的 GFP 神经元的树突状乔木的高放大共聚焦图像。这是一个用 GFP 电穿孔的锥体神经元，在明场和绿色荧光条件下观察到。

这是 CAG-GFP 电穿孔对照神经元在第 2/3 层的典型、规则的尖峰反应。一旦掌握，如果作得当，这项技术可以在 30 分钟内完成宫内电穿孔，半天即可完成膜片钳记录。在尝试此程序时，重要的是要记住尽快进行手术，以减轻母亲的压力并增加幼崽的生存机会。

按照此程序，可以执行其他方法（如表达）来回答其他问题，例如特定基因的表达与其在替代基因发育中的影响之间的关系。开发后，这项技术为发育神经科学领域的研究人员探索小鼠神经元的连接和形态铺平了道路。看完这个视频，你应该对如何使用宫内手术来描述单细胞水平神经元的结构和连接性以及荧光标记神经元的兴奋性有一个很好的了解。