Name: 在子宫内电途径研究神经元亚群的兴奋性和单细胞连接 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: 学习利用子宫内电穿孔技术研究皮层神经元的结构连接性与兴奋性。该方法可标记稀疏神经元群体，结合组织学与全细胞记录技术，为发育神经生物学和认知障碍研究提供单细胞水平的定量分析手段。

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我们感谢 R. Gutiérrez 和 A. Morales 提供出色的技术支持，感谢 L. A. Weiss 进行编辑工作。C.G.B. 由西班牙科学与创新部（MICINN）资助，项目编号 FPI-BES-2012-056011。本研究工作由 BBVA 基金会和 MINECO 的 SAF2014-58598-JIN 项目资助 M. Navarrete，以及由拉蒙·阿雷塞斯基金会（Ramón Areces Foundation）和 MINECO 的 SAF2014-52119-R 与 BFU2014-55738-REDT 项目资助 M. Nieto。

所有动物实验程序均经马德里自治区动物护理与使用委员会批准，符合国家及欧洲法律法规（PROEX 118/14；PROEX 331/15）。操作过程中须保持无菌条件。
1. 子宫内 电穿孔
注意：本电穿孔实验（IUE）方案改编自先前已发表的其他方案5,6,7。本文描述了一种针对E15.5胚胎进行IUE的实验方案，并对报告基因策略进行了改进，可在单独实验中利用标准的GFP报告质粒研究单个神经元的形态8及其电生理特性。
<ol>
	<li>准备DNA
	<ol>
		<li>按照制造商的说明，使用无内毒素质粒提取试剂盒制备DNA质粒，并用1×磷酸盐缓冲液（PBS）稀释。
		<ol>
			<li>对于单细胞标记，每台手术准备10 µL DNA混合物（每个胚胎1 µL），包含以下质粒及终浓度：编码荧光蛋白报告基因的质粒（例如 CAG-DsRed29），1 µg/µL，作为电穿孔效率的对照；待检测的实验质粒，通常为1 µg/µL；LoxP-stop-LoxP-荧光蛋白质粒（CALNL-GFP10），1 µg/µL；以及编码Cre10的质粒，1 - 4 ng/µL。加入1 µL 0.1% Fast Green水溶液（质量/体积）以可视化注射的DNA。 
			注：GFP构建体的Cre重组仅发生在少数神经元中，从而可对单个轴突投射进行可视化和重建（图1A）。</li>
			<li>对于标准膜片钳实验，每台手术准备10 µL DNA混合物（每个胚胎1 µL），包含以下质粒：编码荧光蛋白的质粒（例如 CAG-GFP11），1 µg/µL，作为报告基因对照；实验质粒，通常为1 µg/µL；以及1 µL 0.1% Fast Green水溶液（质量/体积）。 
			注：这些是标准电穿孔条件，用于分析急性脑片中目标皮层层内大量标记的兴奋性神经元。若需在单细胞中进行膜片钳记录，请按照步骤1.1.1.1中的方法制备DNA。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 手术准备
<ol>
	<li>采用无菌操作技术进行存活手术。确保无菌条件，包括口罩、手套、器械和手术区域的无菌性。对手术器械（手术刀、Adson镊子、硬化精细剪刀、弯剪、Dumont镊子和持针器）进行灭菌处理。</li>
	<li>选用外径/内径为1/0.58 mm的硼硅酸盐玻璃毛细管。进行毛细管拉制3，拉制后目标尖端长度约为1 cm。使用精细镊子以约30°角剪开针尖（图1B）。</li>
	<li>配制500 mL无菌等渗溶液（1×PBS或Hank's平衡盐溶液（HBSS））。加入青霉素-链霉素至终浓度为1:100，并将溶液预热至37 °C。手术后可将溶液保存于4 °C。</li>
	<li>术前皮下注射镇痛药（例如，卡洛芬，5 mg/kg体重）。</li>
	<li>将动物置于加热垫上以维持术中体温。术后恢复期间，将清洁笼盒预热至37 °C。</li>
</ol>
3. 手术
<ol>
	<li>用异氟烷麻醉一只 C57BL/6 E15.5 孕鼠。首先，将密闭室以 0.8 L/min 的氧气流速通入 3% 异氟烷，将小鼠置于其中直至其入睡。将小鼠转移至加热垫上，并将其口鼻置于面罩内以持续输送异氟烷。在手术过程中逐渐将麻醉浓度通过面罩降低至 1.5%。通过观察足底反射（脚趾夹捏）消失确认麻醉效果。理想操作时间约为 20 分钟，不超过 45 分钟。</li>
	<li>涂抹眼膏以防止手术过程中眼睛干燥。</li>
	<li>使用电动剃刀或脱毛膏去除腹部约 3 cm 区域的毛发。先用浸有 70% 乙醇的棉签擦拭手术区域，再用含碘棉签擦拭。重复三次。</li>
	<li>用无菌纱布覆盖手术区域以防止感染。</li>
	<li>使用手术刀沿腹中线平行方向做一条长约 2 cm 的纵向切口。用钝头弯剪分离腹壁的皮肤和肌肉。用镊子夹住肌肉，沿腹白线剪开以暴露腹腔。</li>
	<li>借助镊子定位胚胎。取两根无菌棉签，用步骤 2.3 中配制的无菌生理盐水润湿，用于操作一个易于接触的胚胎。将棉签置于胚胎周围，轻柔地将两侧子宫角从腹腔中取出。在整个操作过程中，持续用温热的生理盐水保持胚胎和开放的腹腔湿润，以防干燥。</li>
</ol>
4. DNA 注射与电穿孔
<ol>
	<li>用手指轻轻操作胚胎，定位端脑（可通过肉眼清晰观察到，为脑部两个更靠前的脑泡）。将制备好的硼硅酸盐毛细管插入口吸管中。将针尖穿过子宫，避开血管，直至进入一个侧脑室。缓慢注入约 1 µL 的快绿染色的 DNA 溶液，直至观察到一个较大的蓝色斑点。</li>
	<li>将 7 mm 铂电极置于胚胎头部两侧（图 1C）。 
	注意：DNA 带负电荷；因此，当在铂电极之间施加电压时，DNA 会向正极移动。通过改变电极的位置，可靶向大脑的不同区域。</li>
	<li>通过铂电极施加电压（对于 E15.5 胚胎：5 次脉冲，38 V，脉冲间隔周期为 50 ms，间歇时间为 950 ms。这些条件根据发育阶段的不同而有所变化）12。 
	注意：不同胚胎阶段的电压条件和电极参数详见表 1。</li>
	<li>对每个胚胎重复步骤 4.1 至 4.3。</li>
</ol>
5. 手术结束与术后处理
<ol>
	<li>使用棉签将子宫复位至母体体内。向腹腔内注入温热的生理盐水溶液（约加入 2 mL）。</li>
	<li>采用单纯间断缝合或连续缝合方式缝合肌肉层。使用 #6-0 缝线。</li>
	<li>使用钉皮钉闭合皮肤外部伤口。钉合前注意将皮肤与肌肉层分离。移除鼻罩。</li>
	<li>将小鼠置于加热的清洁笼中恢复 30 分钟，之后再转移至动物饲养室。在动物未恢复足够意识以维持胸卧位之前，不得使其无人看管。接受手术的动物在完全恢复前，不得与其他动物同笼饲养。</li>
	<li>术后数日内需对动物进行监护。皮下注射镇痛药（卡洛芬，5 mg/kg 体重），每 12 小时一次，持续 2 天，或依照动物管理法规执行。幼崽无需额外的术后护理。</li>
</ol>
6. 样品的制备与分析
<ol>
	<li>可选步骤：在出生后第2天（P2），使用荧光显微镜检测电穿孔幼鼠中荧光表达情况；当宫内电穿孔（IUE）成功时，可在幼鼠头部清晰观察到荧光13标记或分离出成功电穿孔的小鼠，用于后续步骤。将母鼠和仔鼠置于标准动物饲养条件下。</li>
	<li>在所需的研究阶段，对小鼠进行经心脏灌注。通常，树突和轴突生长最活跃的阶段对应于出生后的前三周2,14,15.
	<ol>
		<li>每只小鼠准备 30 mL 冰上预冷的 4% 多聚甲醛（PFA）PBS 溶液（1x PBS 配制）。 
		警告：PFA 是一种已知的过敏原和致癌物，具有毒性。请佩戴适当的个人防护装备。 
		注意：所需 PFA 的量取决于小鼠的年龄（例如，对于P16，灌注需要20 mL，后固定需要10 mL。</li>
		<li>按1:1:8的体积比配制氯胺酮-赛拉嗪混合麻醉剂，即100 µg/mL氯胺酮 : 100 µg/mL赛拉嗪 : PBS（每只小鼠约需0.2 mL）。</li>
		<li>通过腹腔注射步骤6.2.2中配制的混合液0.2 mL，使小鼠麻醉。</li>
		<li>将麻醉后的小鼠仰卧放置。使用手术刀在胸腔上方做一横向切口。用精细剪刀剪开肌肉和膈肌，直至可见心脏。
		<ol>
			<li>用精细剪刀在右心房做一切口。用25号针头在左心室缓慢注入20 mL PBS，以清除血液。注入20 mL PFA（步骤6.2.1），直至小鼠身体变僵硬且器官变白。</li>
			<li>立即去除头部，并从颈部至颅骨沿中线切开皮肤。用弯头镊子小心剥离颅骨并取出脑组织。在去除颅骨过程中需特别注意，避免刺破或损伤脑组织。将脑组织置于10 mL 4%多聚甲醛（PFA）溶液中，4 °C条件下固定过夜。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在4 °C条件下，用10 mL含30%蔗糖的PBS溶液对经冷冻保护固定的脑组织进行浸渍处理1–2天，直至组织沉底。准备1 cm3 铝箔小盒。将OCT填充至小盒2/3处，放入脑组织，通过将小盒置于干冰上冷冻。将冷冻后的脑组织于-80 °C保存。</li>
	<li>在样本盘表面滴加一滴OCT，撕去组织学包埋盒的铝箔，将包埋盒置于液态OCT上方，并调整至相对于样本盘所需的方向。施加适当压力，使其固定。将样本盘插入冷冻切片机的样本头中。调整样本方向（将其移动至相对于刀片的有利位置）。
	<ol>
		<li>在冷冻切片机上对脑组织进行切片，选取50–100 µm厚的漂浮冷冻切片16 使用细毛刷将其转移至 PBS 中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>如需要，可进行染色。 
	注意：对于轴突形态学的研究，强烈推荐使用GFP抗体进行染色2.
	<ol>
		<li>室温下用含0.5% Triton-X 100的PBS配制的5%胎牛血清（封闭液）封闭切片1小时。随后在4 °C下与1:500稀释的一抗孵育过夜。例如， 兔抗GFP抗体，用封闭液稀释。</li>
		<li>用 PBS 清洗切片三次。加入 1:500 的二抗（例如， 山羊抗兔 Alexa Fluor 488）用封闭液稀释后，室温孵育1小时。用PBS洗涤切片三次。</li>
		<li>用含0.5% Triton-X 100的PBS稀释DAPI（1:10,000）对组织切片进行复染，孵育10分钟。用PBS冲洗切片。将切片封片于水性封片剂中。16.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 成像与分析
<ol>
	<li>荧光或共聚焦显微镜
	<ol>
		<li>为重建完整的神经元，需使用高倍率（至少40倍）和高分辨率（最低1,024 x 1,024）采集图像。在采集软件中选择&#34;Tile scan&#34;或等效选项，以覆盖所有树突和轴突结构所在的感兴趣区域。在z轴上采集足够数量的图像层，避免信息丢失。 
		注意：通常显微镜软件具有&#34;Optimized stack&#34;选项；若无此功能，则需手动测试，确定图像之间所需的重叠步数，以准确分辨各个投影。两个关键参数是针孔和物镜；需考虑&#34;倍率越高，分辨率越高，所需的z轴步数越多&#34;。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分析 
	注意：尽管可分析多个参数，但步骤7.2.1仅聚焦于两个参数：树突形态和轴突分支。请下载Fiji（<a href="http://fiji.sc/" target="_blank">http://fiji.sc/</a>）。
	<ol>
		<li>打开图像，从菜单中选择&#34;Segmented line&#34;选项。沿神经元结构绘制线条（通过滚动鼠标在z轴上下切换图像层面）。然后进入&#34;Analyze, Tools, ROI Manager, Add&#34;（或按快捷键&#34;t&#34;）以保存该线条。对所分析神经元的每一条轴突或树突重复此过程2。</li>
		<li>在ROI Manager菜单中点击&#34;Measure&#34;按钮，获取长度（或其他参数）。将测量结果导出至文本文件或电子表格中进行后续分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. 电生理学
注意：本实验方案的目的是从经GFP电穿孔的小鼠脑组织中，通过GFP表达在视觉上识别出的II/III层锥体神经元，获取全细胞电流钳记录（也可适用于此前已电穿孔表达其他任何荧光蛋白的情况）。本方案改编自已发表的方法17,18。利用本方案，可研究通过子宫内电穿孔（IUE）引入的遗传修饰对神经元电生理特性的影响。特定放电模式的获得是一个渐进的分化过程，涉及多种离子通道的动态表达，并在出生后晚期阶段之前表现出短暂的放电模式。例如，在出生后16天（P16）之前，小鼠体感皮层II/III层中尚未观察到成熟的电生理反应2,19。
<ol>
	<li>急性切片的制备前提
	<ol>
		<li>准备无菌手术器械以取出小鼠脑组织：使用断头器切除头部；小剪刀用于剪开颅骨；镊子用于分离颅骨与组织；解剖刀用于精细地将脑组织从颅腔中取出；金属切片器用于将皮层切成两个相等的半球；巴斯德吸管用于将振动切片机上的脑片转移至含人工脑脊液（ACSF）的溶液中进行检查，随后将脑片从 ACSF 转移至孵育保存区域。</li>
		<li>使用高纯度水（双蒸水）配制 1 L ACSF，其中包含 119 mM NaCl、26 mM NaHCO₃3，11 mM 葡萄糖，2.5 mM KCl，1.2 mM MgCl2，2.5 mM CaCl2，以及 1 mM NaH2PO4用 HCl 或 NaOH 将 pH 滴定至 7.3 - 7.4。调节渗透压至 290 mOsm。</li>
		<li>用碳合气（95% O₂，5% CO₂）饱和人工脑脊液2/5% CO₂2使用聚四氟乙烯管（约 1 mm）孵育 15 - 20 分钟，使 pH 稳定在 7.3 - 7.4。</li>
		<li>将200 mL用碳合气饱和的ACSF溶液置于-80 °C冷冻10–15分钟，制成冰沙状解剖液。将100 mm × 20 mm的组织培养皿置于冰上，用于脑组织切片。</li>
		<li>实验开始前，配制100 mL 1%低熔点琼脂糖溶液。待溶液冷却后，切取一块1 × 1 × 0.5 mm的方形琼脂糖，用瞬干胶将其粘附于切片平台背面紧靠脑组织切片位置的后方（琼脂糖凝胶可在切片过程中为脑组织提供支撑）。确保其前缘尽可能平整。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>获取急性脑片
	<ol>
		<li>固定小鼠并用 2% 异氟烷麻醉。将小鼠头部置于断头器开口中并迅速断头。使用骨钳或精细镊子尽快去除颅骨。将脑组织置于预冷的 ACSF 中。 
		注意：执行此步骤时务必迅速。</li>
		<li>将脑组织放入预冷的培养皿中，用小剪刀剪除小脑。</li>
		<li>用解剖刀铲起脑组织，在纸巾上吸干。</li>
		<li>将脑组织的腹尾侧平面粘附在振动切片机的样品托上。将样品托置于盛有冰冻人工脑脊液（ACSF）的振动切片机中。</li>
		<li>通过切割300-µm冠状切片获取急性脑片（确保整个过程中持续通入碳合气）， 例如， 将一个鼓泡器（1 mm 聚四氟乙烯管）放入振动切片机腔室中，使用以下振动切片机参数：0.06 mm 振幅，0.08–0.10 mm/s 切割速度。将进样速度设为最慢档（约每遍 22 秒）。必要时可根据不同仪器实际情况，对上述最佳参数进行调整，通过实验确定各设备的最佳条件。</li>
		<li>将急性脑片在添加了3 mM的ACSF中孵育至少60分钟 myo-肌醇，0.4 mM 抗坏血酸，2 mM 丙酮酸钠，同时通入95% O₂2/5% CO₂2 气体。保持温度在 25 °C。</li>
		<li>切片操作应在15分钟内完成。如有需要，切片可在转移至记录室使用前保存1至7小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>全细胞记录的先决条件
	<ol>
		<li>确保电生理实验台配备有记录室、灌流系统、显微镜、电极（记录电极、刺激电极和接地电极）、宏/微操纵器、坚固的防震台面和法拉第笼、刺激器、放大器和模数（A/D）转换器、装有采集软件的计算机，以及用于分析基因修饰神经元的GFP（或其他荧光染料）滤光片18 (图2A).</li>
		<li>配制细胞内液，其中含有 115 mM 葡萄糖酸钾、2 mM MgCl₂、20 mM KCl、10 mM HEPES、0.3 mM Na-GTP 和 4 mM Mg-ATP，用 KOH 调节 pH 至 7.2–7.42，10 mM HEPES，20 mM KCl，4 mM Na2ATP 和 0.3 mM Na3GTP，用KOH调节pH至7.2，用KCl调节渗透压至290 mOsm。</li>
		<li>使用硼硅酸盐玻璃毛细管拉制膜片钳电极。采用微电极拉制仪制备膜片钳电极，所用硼硅酸盐毛细管规格为：外径1.5 mm，内径0.86 mm，长度10 cm。制备的膜片钳电极在充灌细胞内液后电阻应为3–10 MΩ。</li>
		<li>以2 mL/min的流速向记录室灌注ACSF，将室温维持在约33 °C。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>全细胞记录
	<ol>
		<li>使用移液管（剪去细长的尖端）或小毛刷将脑片转移至记录室中。用网格固定器压住脑片。以每分钟2毫升的速度持续用人工脑脊液（ACSF）灌流脑片。</li>
		<li>对GFP阳性神经元进行膜片钳记录。
		<ol>
			<li>将切片放入记录舱中，通过显微镜在低倍镜（10X）下找到目标区域。然后使用60倍物镜寻找一个GFP阳性细胞进行膜片钳记录。</li>
			<li>用细胞内液填充记录电极。使用连接至滤器（4 mm 滤器）的注射器和微量加样头，将细胞内液注入记录电极中。</li>
			<li>将玻璃移液管放入移液管固定器中。将移液管尖端置于浴液中，并对准尖端聚焦。移液管进入浴液后，通过背压控制系统施加正压。</li>
			<li>对荧光标记的神经元进行膜片钳记录（图2B).
			<ol>
				<li>在显微视觉引导下接近目标细胞，同时在移液管中保持回压。当细胞表面出现微小凹陷时，释放压力。此时可能形成紧密封接（电阻大于1 GΩ）；若未形成，可施加轻微负压（吸力）以促进封接。</li>
				<li>在形成封接的同时，将钳制电压调至 -60 mV。一旦形成吉欧姆（GΩ）封接，施加短暂的负压脉冲以破裂移液管下方的细胞膜，进入全细胞记录模式。参见参考文献20 详情请见。</li>
			</ol>
			</li>
			<li>使用电流钳制条件记录活动21进入全细胞记录模式后，切换至电流钳模式并开始记录。例如，为记录细胞兴奋性，施加持续时间为500 ms的去极化电流刺激（100 - 400 pA）。
			<ol>
				<li>通过绘制动作电位数量随输入电流增加的变化来计算放电频率。 
				注意：静息膜电位、输入电阻和膜电容也可通过记录数据计算得出21.</li>
			</ol>
			</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无利益冲突。

本方案详细描述了如何标记C75BL/6小鼠体感皮层的神经元，以分析其连接性及兴奋性。与现有方法相比，该技术能够可视化连接性的鉴别特征，例如每个神经元的轴突分支数量、其精确的拓扑结构以及解剖学位置。通过调整电极的位置，还可靶向其他神经元群体，例如扣带皮层（保持电极与脑组织之间的相同角度，但改变电极极性的方向）或海马体5，并根据所需策略对单个神经元或更广泛的细胞群体进行类似的标记实验。然而，该方法存在一定局限性，并非所有神经元群体都具有相同的可及性或可被同等选择性地标记。例如，在海马体中，可以选择性地标记CA1区晚期出生的神经元，但早期电穿孔则会标记出内层和外层锥体细胞的异质性群体。在大脑皮层中，神经元按顺序生成，因此子宫内电穿孔（IUE）时的妊娠天数决定了受影响的皮层层级。较早进行IUE可靶向更深层的神经元（例如，E14天进行IUE可标记第四层神经元）22。
为了成功进行宫内电转染（IUE），建议考虑以下几点。首先，手术时间应控制在30分钟以内，以减少对母体的应激，并提高...

树突和轴突结构的发育是神经系统回路调控的重要方面，包括大脑皮层中的回路调控。它在不同神经元亚群的选择性连接过程中发挥着关键作用。近年来多项研究表明，除了连接性之外，神经元的分子多样性还体现在其获得高度特异性的放电模式上。然而，在发育过程中决定不同神经元亚型的兴奋性和连接性的机制，以及这些特性在多大程度上协调一致，目前仍知之甚少1,2。
体内功能缺失与功能获得分析可用于研究特定基因表达水平与其在神经环路发育中作用之间的关系。子宫内电穿孔（IUE）是一种广泛用于研究目的基因在特定神经元群体中的功能以及其整体连接模式的技术。然而，要确定活体小鼠大脑皮层各层中轴突和树突的形态学特征，必须对神经元进行稀疏标记。将Cre重组系统与IUE结合使用，可实现对神经元群体的稀疏标记，标记密度足够低，从而能够清晰分辨出特定皮层分层中单个细胞发出的投射纤维。该方法可在每个皮层中标记足够数量的神经元，使得在分析适量的电穿孔脑组织后即可获得定量数据（图1）。本文介绍了一种用于此类精细连接性分析的方法。同时，本文还介绍了一种类似策略，用于在独立实验中通过急性皮层脑片上的电流钳记录技术，分析经绿色荧光蛋白（GFP）电穿孔标记的神经元的电生理特性。这些实验方案具有良好的通用性，可应用于研究野生型和转基因动物神经元的兴奋性与连接性，也可用于研究在IUE过程中通过额外质粒引入基因功能缺失或功能获得的神经元特性。
尽管本实验方案描述的是在胚胎第15.5天（E15.5）对小鼠进行电穿孔操作，但该技术可在胚胎第9.5天（E9.5）3 至出生后第2天（P2）4 之间的任意时间点进行。早期阶段的电穿孔主要靶向丘脑神经元及其前体细胞以及大脑皮层的深层细胞，而较晚期的电穿孔则标记更表层的细胞（例如，E15.5天的体内电穿孔可靶向第II-III层神经元）。总之，将体内电穿孔（IUE）与单细胞形态学分析及电生理学技术相结合，是揭示神经系统中神经元巨大结构与功能多样性的分子机制的有力工具。

<table><tbody><tr><td>pCAG-Cre</td><td>Addgene</td><td>13775</td><td></td></tr><tr><td>pCALNL-GFP</td><td>Addgene</td><td>13770</td><td></td></tr><tr><td>pCAG-DsRed2</td><td>Addgene</td><td>15777</td><td></td></tr><tr><td>pCAG-GFP</td><td>Addgene</td><td>11150</td><td></td></tr><tr><td>快绿</td><td>卡尔·罗斯（Carl Roth）</td><td>301.1</td><td></td></tr><tr><td>EndoFree 质粒大提试剂盒</td><td>QIAGEN</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>卡洛芬（Rimadyl）</td><td>Pfizer GmbH</td><td>1615 ESP</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷（IsoFlo）</td><td>Abbott (Esteve)</td><td>1385 ESP</td><td></td></tr><tr><td>氯胺酮（Imalgene）</td><td>Merial</td><td>2528-ESP</td><td></td></tr><tr><td>赛拉嗪（Xilagesic）</td><td>Calier</td><td>0682-ESP</td><td></td></tr><tr><td>聚维酮碘</td><td>梅达</td><td>694109.6</td><td></td></tr><tr><td>眼膏（Lipolac）</td><td>安杰利尼</td><td>65.277</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' 平衡盐溶液 (HBSS)</td><td>Gibco（生命技术公司）</td><td>24020-091</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>手术刀柄 #3 - 12 厘米</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>手术刀片 #10</td><td>精细科学工具</td><td>10010-00</td><td></td></tr><tr><td>Adson镊子-带齿 - 直型 12 cm</td><td>精细科学工具</td><td>1106-12</td><td></td></tr><tr><td>硬化精细剪刀 - 直型 11 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-11</td><td></td></tr><tr><td>梅泽鲍姆-尼尔森弯剪 L=14.5 cm</td><td>Teleflex</td><td>PO143281</td><td></td></tr><tr><td>细弯头 - 7 型杜莫克丝尔</td><td>杜蒙特</td><td>0303-7-PO</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 镊子-Inox</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>马蒂厄持针器 - 带齿</td><td>精细科学工具</td><td>12010-14</td><td></td></tr><tr><td>AutoClip施夹器</td><td>Braintree Scientific, Inc</td><td>美国化学会&amp;nbsp;APL</td><td></td></tr><tr><td>9 mm 自动夹子</td><td>MikRon Precision, Inc.</td><td>205016</td><td></td></tr><tr><td>缝合线 - Polysorb 6-0</td><td>Covidien</td><td>UL-101</td><td></td></tr><tr><td>电动剃须刀&amp;nbsp;</td><td>松下</td><td>ER 240</td><td></td></tr><tr><td>硼硅酸盐玻璃毛细管（100 毫米，1.0/0.58 外径/内径）</td><td>World Precision Instrument Inc.</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>校准微毛细管移液器用吸管管组件</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5177-5EA</td><td></td></tr><tr><td>纱布（Aposan）</td><td>Laboratorios Indas, S.A.U.</td><td>C.N. 482232.8</td><td></td></tr><tr><td>棉签（Star Cott）</td><td>阿尔巴萨</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>25 G 针头（BD Microlance 3）</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>300600</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>OCT包埋剂</td><td>樱花</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>组织培养皿 100 × 20 mm</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>GFP标签多克隆抗体</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A-11122</td><td></td></tr><tr><td>二抗，Alexa Fluor 488 标记</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>10270106&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>电穿孔仪 ECM 830&amp;nbsp;</td><td>BTX Harvard Apparatus</td><td>45-0002</td><td></td></tr><tr><td>铂电极 650P 7 mm</td><td>Nepagene</td><td>CUY650P7</td><td></td></tr><tr><td>显微镜&amp;nbsp;用于荧光成像 - MZ10F</td><td>Leica</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>VIP 3000 异氟烷蒸发器</td><td>Matrx</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>TCS-SP5 激光扫描系统</td><td>Leica</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Axiovert 200 显微镜</td><td>Zeiss</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>冷冻切片机 - CM 1950</td><td>Leica</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>P-97 微电极拉制仪</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>膜片钳分析软件（p-Clamp Clampfit 10.3）</td><td>Molecular Devices</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>采集软件（MultiClamp 700B 放大器）</td><td>Molecular Devices</td><td>DD1440A</td><td></td></tr><tr><td>电动显微操作器 + 旋转底座&amp;nbsp;</td><td>Sutter Instrument</td><td>MP-225</td><td></td></tr><tr><td>气浮台</td><td>纽波特</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>微型蠕动泵</td><td>WPI</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

子宫内 研究神经元亚群兴奋性及单细胞连接性的电穿孔技术

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

神经系统由大量不同类型的神经元组成。这些神经元亚群的特征包括独特的树突形态、特定的轴突连接模式以及选择性的放电反应等。在发育过程中，负责这些分化特征的分子与细胞机制目前仍知之甚少。
本文描述了用于标记和表征皮层神经元结构连接性与兴奋性的联合实验方案。在体电穿孔（IUE）技术的改进使得能够标记稀疏分布的神经元群体，从而可识别并追踪单个神经元的树突和轴突，精确定位轴突投射的皮层层级位置，并进行形态计量学分析。此外，将IUE与电穿孔后脑组织急性切片的全细胞记录技术相结合，可用于研究野生型（WT）或基因修饰神经元兴奋性的变化。这两种技术的结合有助于深入理解结构连接性与功能连接性之间的耦合关系，以及发育过程中调控神经元多样性的分子机制。这些发育过程对轴突布线、神经元功能多样性以及认知障碍的生物学基础具有重要意义。

为了详细且全面地表征神经元在发育过程中的形态学变化，必须对神经元进行稀疏标记。利用稀释的 Cre 重组酶系统，可使目的基因在少量神经元中表达，从而仅使含有该酶的神经元表达 GFP（图 1A）。采用该策略，在 E15.5 时期通过子宫内电穿孔（IUE）靶向并标记第二至第三层神经元。同时共电穿孔浓度为 1 µg/µL 的 CAG-DsRed2，作为对照，并用于在活体动物中识别成功电穿孔的脑组织。重要的是，经抗 GFP 抗体染色后，信号强度足以清晰显示神经元的树突形态和轴突（图 1D 和 E）。
在宫内电穿孔（IUE）和电生理实验后，通过全细胞记录获得的参数可用于比较不同条件下电穿孔细胞的放电反应和兴奋性。可获取多个参数，应根据具体研究需求，使用特定的膜片钳分析软件对参数进行调整。图2C展示了从E15.5电穿孔的野生型II-...

本文提供了使用以下方案 在子宫内 电穿孔（IUE）用于在单细胞水平上描述神经元的结构连接性以及荧光标记神经元的兴奋性。通过组织学方法表征树突和轴突投射。利用急性脑片进行全细胞记录以研究神经元兴奋性。

神经系统由大量不同类型的神经元组成。这些神经元亚群的特征包括……

在体电穿孔技术的总体目标是在正常和实验条件下表征皮层神经元的结构连接性和兴奋性。该方法有助于解答发育神经生物学中的关键问题，例如解析大脑的结构与功能连接性以及认知障碍的生物学机制。该技术的主要优势在于能够标记稀疏的神经元群体，并可清晰显示树突形态，从而能够对单个神经元进行访问，实现更高效、更接近真实情况的定量分析。注射前，为每台手术准备用于单细胞标记或标准膜片钳研究的十微升 DNA 混合物。然后，用手指轻轻操作胚胎以定位端脑。接着，将一根预置的硼硅酸盐毛细管插入嘴控移液管中。将针尖穿过子宫，避开血管，直至到达侧脑室。随后，缓慢注射约一微升的快绿染色DNA溶液，直至观察到一个较大的蓝色斑点。该操作中的关键步骤是DNA的注射。此操作应尽可能轻柔地进行。现在，将七毫米的铂电极横向放置在胚胎头部，并通过铂电极施加电压。在此步骤中，将固定后的脑组织置于含有10毫升30%蔗糖的PBS溶液中，在4°C条件下冷冻保护1至2天，直至组织完全沉底。然后准备1立方厘米的铝箔盒，并用OCT填充至盒子的2/3处。随后，将脑组织放入盒中，并在干冰上冷冻。最后将冷冻的脑组织于-80摄氏度保存。在冷冻切片机中切片脑组织时，先在样本盘表面滴加一滴OCT包埋剂。撕去组织包埋块的铝箔，将包埋块以所需方向置于液态OCT上。施加适当压力，直至组织包埋块固定。 然后将样品片插入冷冻切片机的样品头中，并调整样品方向以进行切片。接着切取50-100 µm厚的切片，用细刷将漂浮的冷冻切片转移至PBS中。随后，在含有0.5%Triton X-100的PBS中加入5%胎牛血清，在室温下封闭切片1小时。接着，将切片与用封闭液按1:500稀释的一抗在4摄氏度下孵育过夜。次日，用PBS洗涤切片三次。加入用封闭液按1:500稀释的二抗，在室温下孵育切片1小时。然后用 PBS 清洗切片三次。随后，将切片置于含有 0.5% Triton X-100 的 PBS 中，用 dapE 复染 10 分钟。用 PBS 冲洗切片后，使用封片剂封片。为了重建神经元，需使用高倍率和高分辨率对脑切片进行成像。接下来，在采集软件中选择拼图扫描（Tile Scan）模式，以覆盖所有树突和轴突投射所在的感兴趣区域。在Z轴上采集足够数量的光学切片，以避免信息丢失。然后，打开图像，从菜单中选择“分段线”选项。沿神经元的结构绘制一条线。接着，进入“分析”菜单，选择“工具”，然后选择“ROI 管理器”，点击“添加”以保存该线条。对所分析神经元的每根轴突或树突重复此过程。在“感兴趣区域管理器”（ROI Manager）菜单中，点击“测量”（Measure）以获取长度。将测量结果导出至文本文件或电子表格中进行分析。为了记录经GFP电穿孔小鼠中表达GFP的神经元，将脑组织置于冰冷的培养皿中。用小剪刀剪除小脑，然后用解剖铲挑起脑组织，并在纸巾上轻轻吸干。将脑组织的腹侧尾部平面粘附在振动切片机（Vibratome）的持样架上。将持样架置于装有冰冻人工脑脊液（ACSF）的振动切片机中，并确保切片室持续通入碳合气（carbogen）。随后，在15分钟内完成切割，获得300微米厚的冠状急性脑片。接下来，将急性脑片置于持续通入碳合气的任氏液（ACSF）中，在25摄氏度下孵育至少60分钟。60分钟后，使用巴斯德移液管或小毛刷将一片脑片转移至记录舱中。用网格状固定器（harp）固定脑片，并以每分钟2毫升的流速持续灌注任氏液（ACSF）。为了记录GFP阳性神经元，首先在10倍物镜下通过显微镜找到目标区域，然后使用60倍物镜定位一个GFP阳性细胞。接下来，用细胞内液填充记录电极。随后，将玻璃移液管放入移液管架中。然后，将移液管尖端置于浴液中，并对准尖端聚焦。移液管进入浴液后，通过背压控制系统施加正压。在显微视觉引导下接近目标细胞，同时在移液管中保持回压。当细胞表面出现微小凹陷时，释放压力。此时可形成电阻大于1 GΩ的紧密封接。否则，施加轻微的负压以促进封接。在封接形成过程中，将钳制电压调至60毫伏。一旦形成吉欧姆封接，施加一次吸力脉冲以破裂细胞膜，进入全细胞记录模式。进入全细胞模式后，切换至电流钳模式并开始记录。这些图像显示了在胚胎第15.5天通过子宫内电穿孔将载体递送至第2/3层神经元，冠状切片于出生后第16天制备。CAG DsRed2载体作为对照共转染。只有那些同时导入了cre的神经元才会表达GFP，从而实现CALNL GFP载体中LoxP位点的重组。这是一张另一株稀疏标记的GFP神经元树突树的高倍共聚焦图像。该神经元为锥体神经元，通过电穿孔导入GFP，并在明场和绿色荧光条件下进行观察。这是皮层第2/3层经CAG-GFP电穿孔的对照神经元典型的规则放电反应。一旦掌握，该技术可在30分钟内完成子宫内电穿孔操作，若操作得当，膜片钳记录则需半天时间。在进行该实验时，需牢记应尽快完成手术操作，以减少母体应激，并提高仔鼠存活率。完成此操作后，还可进行其他方法，例如基因表达分析，以回答更多问题，例如特定基因的表达与其在宿主发育过程中作用之间的关系。该技术建立后，为发育神经科学领域的研究人员探索小鼠神经元的连接性与形态提供了重要途径。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用胎内操作技术，在单细胞水平上描述神经元的结构与连接性，以及荧光标记神经元的兴奋性。

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在子宫内电途径研究神经元亚群的兴奋性和单细胞连接

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在子宫内 电穿孔联合原代神经元培养用于研究皮层神经元亚群中的基因功能

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小鼠 在子宫内 电穿孔：可控时空基因转染

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皮层中间神经元亚型选择性电穿孔

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Ex Utero 电穿孔及胚胎小鼠脑组织切片培养用于迁移性GABA能中间神经元的活体成像

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双子宫内电穿孔技术用于时空分离的细胞群体靶向

学习利用子宫内电穿孔技术研究皮层神经元的结构连接性与兴奋性。该方法可标记稀疏神经元群体，结合组织学与全细胞记录技术，为发育神经生物学和认知障碍研究提供单细胞水平的定量分析手段。

子宫内研究神经元亚群兴奋性及单细胞连接性的电穿孔技术

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