Name: 多能干细胞衍生的心肌修复心肌细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: 学习将人多能干细胞分化为心肌细胞、内皮细胞和平滑肌细胞的高效方案，并利用贴片介导的细胞因子递送技术提高移植细胞在心肌修复中的存活率和整合效果。该方法为心脏组织工程和缺血再灌注损伤后的心肌再生研究提供了重要工具。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

本工作获得了美国公共卫生服务基金 NIH RO1 HL67828、HL95077、HL114120 和 UO1 HL100407-项目4（资助对象：JZ）、美国心脏协会科学家发展基金（16SDG30410018）以及阿拉巴马大学伯明翰分校临床与转化科学中心研究代金券奖（资助对象：WZ）的支持。

所有实验操作均按照伯明翰阿拉巴马大学的动物使用指南进行。
1. 将hiPSC分化为hiPSC-CM
<ol>
	<li>在 4 °C 条件下，用预冷的生长因子减少型胶状蛋白混合物包被 6 孔板的孔，包被过夜。使用前吸除胶状蛋白混合物。将 hiPSCs 接种到预先包被的培养板上，并在 mTeSR1 培养基中培养细胞（每孔 1 × 105 个细胞），培养条件为 5% CO2 和 37 °C，培养基中添加 10 µM ROCK 抑制剂。</li>
	<li>每天更换培养基，直至细胞达到 90% 汇合度；然后向培养基中加入生长因子减少型胶状蛋白混合物（每 6 孔板加入 0.5 mg 胶状蛋白混合物，每孔 2 ml 培养基），并在 5% CO2 和 37 °C 条件下继续培养 2 天。
	<ol>
		<li>更换培养基时，通过真空装置轻轻吸出培养皿中的培养基，避免接触细胞，然后使用移液管加入新鲜培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过更换为补充了生长因子减少型胶状蛋白混合物、不含胰岛素的 B27 及 100 ng/ml Activin A 的 RPMI1640 培养基启动分化；在 5% CO2 和 37 °C 条件下培养 24 小时。</li>
	<li>更换为补充了不含胰岛素的 B27、10 ng/ml 骨形态发生蛋白 4（BMP-4）和 10 ng/ml 碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的 RPMI1640 培养基；在 5% CO2 和 37 °C 条件下培养 96 小时。</li>
	<li>更换为补充了 B27 的 RPMI1640 培养基，并继续在 5% CO2 和 37 °C 条件下培养；每 3 天更换一次培养基。</li>
	<li>在启动分化后约 3 天，在显微镜下观察到搏动细胞簇。在首次观察到搏动后约 7 天收集细胞簇，并用 Hanks 平衡盐溶液洗涤。
	<ol>
		<li>将培养板中的细胞簇在含 100 U/ml 胶原酶 IV 的 Hanks 缓冲液中于 37 ºC 轻柔振荡孵育 10 分钟以解离细胞；然后加入含乙二胺四乙酸（EDTA）的 0.25% 胰蛋白酶作用 5 分钟。</li>
		<li>用含 10% 胎牛血清的 RPMI/B27 培养基中和酶溶液，然后将细胞重悬于 RPMI/B27 培养基中。</li>
		<li>使用血细胞计数板计数细胞。将细胞接种于 10 cm 培养皿中，在 5% CO2 和 37 °C 条件下培养至少 3 小时，以使非心肌细胞黏附于培养皿表面。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>收集含有 hiPSC-CMs 的细胞悬液，并将细胞（约每 10 cm 培养皿 1 × 106 个细胞）在包被有胶状蛋白混合物的表面进行培养维持。</li>
</ol>
2. 将hiPSCs分化为hiPSC-ECs
<ol>
	<li>将hiPSC细胞群体与螯合剂在5% CO₂条件下孵育，使其解离为单细胞2 37 °C 下孵育 5 分钟。将细胞转移至含有新鲜 mTeSR1 培养基的 15 ml 离心管中。</li>
	<li>在200 × g下离心细胞5分钟。用添加了10 µM ROCK抑制剂的mTeSR1培养基重悬细胞。使用血细胞计数板测定细胞密度。</li>
	<li>向24孔板的一个孔中加入250 µl浓度为20 NIH单位/ml的凝血酶溶液。</li>
	<li>加入 1 × 106 将hiPSCs加入250 µl浓度为12.5 mg/ml的纤维蛋白原溶液中。将含细胞的250 µl纤维蛋白原溶液加入含凝血酶的孔中。观察混合物在数分钟内凝固，形成含hiPSC的纤维蛋白支架。</li>
	<li>将含有细胞的凝固支架用盖玻片镊子转移至6孔板的孔中，并在5% CO₂条件下，用2 ml EBM2培养基（添加2%不含胰岛素的B27、50 ng/ml activin-A和25 ng/ml BMP-4）培养24小时，以启动分化。2 和 37 °C。
	<ol>
		<li>通过真空抽吸轻轻移除旧培养基，注意不要接触细胞。加入含有B27（不含胰岛素）、血管内皮生长因子（VEGF，50 ng/ml）、促红细胞生成素（EPO，100 ng/ml）和转化生长因子β1（TGFβ1，10 ng/ml）的新鲜EBM2培养基，将支架置于5% CO₂条件下培养。2 37 °C 培养 48 小时。</li>
		<li>更换培养基，并将支架置于5% CO₂条件下继续培养2 并在37 °C下继续培养48小时；然后，向培养基中加入200 U胶原酶IV（100 U/ml），释放支架中的细胞。</li>
		<li>离心收集释放后的细胞。弃去上清，加入2 ml添加有2% B27、VEGF-A（50 ng/ml）和SB-431542（10 µM）的EGM2-MV培养基，每两天更换一次培养基。</li>
		<li>大约10天后（即，于分化开始后约第14天），使用100 U/ml胶原酶IV消化细胞，通过流式细胞术分析内皮细胞特异性标志蛋白的表达，从分化细胞群体中分离hiPSC-ECs例如，CD31，CD1443.</li>
		<li>通过既定方案扩增分离的 hiPSC-ECs3.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 将hiPSCs分化为hiPSC-SMCs
<ol>
	<li>将hiPSCs接种于已包被凝胶状蛋白混合物的培养板中，使用mTeSR1培养基在5% CO2和37 °C条件下培养，每日更换培养基，直至细胞融合（约2天）。</li>
	<li>在RPMI1640培养基中加入CHIR99021（5 µM）和BMP-4（10 ng/ml），并添加2% B27（含胰岛素），诱导细胞向中胚层谱系分化，持续培养3天。</li>
	<li>生成以合成表型为主的hiPSC-SMCs：
	<ol>
		<li>在RPMI1640培养基中加入VEGF-A（25 ng/ml）和成纤维细胞生长因子β（FGFβ，5 ng/ml），并添加2% B27（不含胰岛素），于5% CO2和37 °C条件下培养4天。</li>
		<li>在RPMI1640培养基中加入VEGF-A（25 ng/ml）和FGFβ（5 ng/ml），并添加2% B27（含胰岛素），于5% CO2和37 °C条件下培养2天。</li>
		<li>在RPMI1640培养基中加入血小板源性生长因子β（PDGFβ，10 ng/ml）和TGFβ（3 ng/ml），并添加2% B27（含胰岛素），于5% CO2和37 °C条件下培养4天。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>生成以收缩表型为主的hiPSC-SMCs：
	<ol>
		<li>在RPMI1640培养基中加入VEGF-A（25 ng/ml）和FGFβ（5 ng/ml），并添加2% B27（不含胰岛素），持续培养4天。</li>
		<li>在RPMI1640培养基中加入PDGFβ（5 ng/ml）和TGFβ（2.5 ng/ml），并添加2% B27（含胰岛素），持续培养7天。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用含乳酸（4 mM）的RPMI1640代谢培养基培养细胞约6天，以纯化最终的hiPSC-SMC细胞群体。</li>
</ol>
4. 制备含胰岛素样生长因子的微球
<ol>
	<li>将橄榄油在水浴中加热至 45 °C。</li>
	<li>将 5 ml 10% 明胶溶液加热至 50 °C。</li>
	<li>将明胶加入橄榄油中，搅拌，然后通过向水浴中加入冰块迅速冷却至 5 °C。</li>
	<li>25 分钟后，向橄榄油中加入预冷（4 °C）的丙酮以诱导微球形成。</li>
	<li>在 5 °C 下维持 1 小时；然后收集微球，用预冷的丙酮洗涤 5 次以去除橄榄油，并在 4 °C 下静置风干。</li>
	<li>将微球重悬于含 70% 乙醇和 0.25% 戊二醛的溶液中，在 4 °C 下孵育过夜以诱导交联，然后用 100 mM 甘氨酸中和混合物。</li>
	<li>通过将 5 mg 微球与含有 5 µg IGF 和 0.1% 牛血清白蛋白的 15 µl 蒸馏 H2O 混合 30 分钟，使微球负载 IGF。</li>
</ol>
5. 在损伤部位形成贴片并注射细胞
<ol>
	<li>将hiPSC来源的心肌细胞（200万）、平滑肌细胞（100万）和内皮细胞（100万）共同重悬于1 ml最低必需培养基（MEM）中。</li>
	<li>将5 mg微球悬浮于1 ml纤维蛋白原溶液（25 mg/ml）中。</li>
	<li>用一支注射器吸取含细胞的溶液，另一支注射器吸取纤维蛋白原/微球溶液，第三支注射器吸取1 ml凝血酶溶液（80 NIH单位/ml，加入2 µl 400 mM CaCl₂）2 和 200 mM ε-氨基己酸）。</li>
	<li>通过结扎左前降支冠状动脉，手术诱导猪心肌梗死，方法如前所述2. 
	注意：简言之，对约13 kg、45日龄的约克夏母猪，通过肌内注射泰拉唑/赛拉嗪（4.4 mg/kg）进行镇静，&#160;在异氟烷（0.5–5%）全身麻醉下进行气管插管。A 4th 行肋间开胸术，暴露左前降支冠状动脉。用结扎线阻断冠状动脉60分钟，随后移除结扎线。若发生心室颤动，则立即进行电除颤。</li>
	<li>在猪心脏梗死区域的心外膜上放置一个无菌塑料环（约2.5 cm），随后将微球/纤维蛋白原溶液与凝血酶溶液同时注入该环内。</li>
	<li>让混合物凝固（约30秒），然后将含有细胞的注射器针头穿过已凝固的混合物插入梗死心肌，并注射细胞。根据动物体型，使用3-0或2-0 Monocryl缝线缝合肌肉层、皮下组织和胸壁。&#160;术后前3天，每8小时使用一次0.01–0.02 mg/kg剂量的布托啡诺肌肉注射，以控制疼痛。</li>
	<li>在手术前、手术后一周及手术后四周，采用心脏磁共振成像（MRI）评估心脏功能2,3,4最后一次MRI检查后，处死动物并取其心脏进行组织学和分子分析2,3,4.</li>
</ol>

<ol><li>Qiao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Death+and+proliferation+time+course+of+stem+cells+transplanted+in+the+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Imaging+Biol%22%5BJournal%5D)">Death and proliferation time course of stem cells transplanted in the myocardium.</a> Mol Imaging Biol. 11 (6), 408-414 (2009).</li>
<li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+repair+in+a+porcine+model+of+acute+myocardial+infarction+with+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiovascular+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells.</a> Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).</li>
<li>Zhang, S., Dutton, J. R., Su, L., Zhang, J., Ye, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+a+spatiotemporal+3D+environment+on+endothelial+cell+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The influence of a spatiotemporal 3D environment on endothelial cell differentiation of human induced pluripotent stem cells.</a> Biomaterials. 35 (12), 3786-3793 (2014).</li>
<li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+Human+Induced-Pluripotent+Stem+Cells+into+Smooth-Muscle+Cells%3A+Two+Novel+Protocols%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Differentiation of Human Induced-Pluripotent Stem Cells into Smooth-Muscle Cells: Two Novel Protocols.</a> PLoS One. 11 (1), e0147155(2016).</li>
<li>Rensen, S. S., Doevendans, P. A., van Eys, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+characteristics+of+vascular+smooth+muscle+cell+phenotypic+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Neth+Heart+J%22%5BJournal%5D)">Regulation and characteristics of vascular smooth muscle cell phenotypic diversity.</a> Neth Heart J. 15 (3), 100-108 (2007).</li>
<li>Xu, C., Police, S., Hassanipour, M., Gold, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+bodies%3A+a+novel+culture+method+for+enrichment+of+cardiomyocytes+derived+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Cardiac bodies: a novel culture method for enrichment of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells.</a> Stem Cells Dev. 15 (5), 631-639 (2006).</li>
<li>Anderson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+enrichment+of+cardiomyocytes+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Transgenic enrichment of cardiomyocytes from human embryonic stem cells.</a> Mol Ther. 15 (11), 2027-2036 (2007).</li>
<li>Huber, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+selection+of+cardiomyocytes+during+human+embryonic+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Identification and selection of cardiomyocytes during human embryonic stem cell differentiation.</a> FASEB J. 21 (10), 2551-2563 (2007).</li>
<li>Kita-Matsuo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vectors+and+protocols+for+creation+of+stable+hESC+lines+for+fluorescent+tracking+and+drug+resistance+selection+of+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vectors and protocols for creation of stable hESC lines for fluorescent tracking and drug resistance selection of cardiomyocytes.</a> PLoS One. 4 (4), e5046(2009).</li>
<li>Choi, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+and+endothelial+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic and endothelial differentiation of human induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells. 27 (3), 559-567 (2009).</li>
<li>Woll, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signaling+promotes+hematoendothelial+cell+development+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Wnt signaling promotes hematoendothelial cell development from human embryonic stem cells.</a> Blood. 111 (1), 122-131 (2008).</li>
<li>Li, Z., Hu, S., Ghosh, Z., Han, Z., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+and+expression+profiling+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-+and+embryonic+stem+cell-derived+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Functional characterization and expression profiling of human induced pluripotent stem cell- and embryonic stem cell-derived endothelial cells.</a> Stem Cells Dev. 20 (10), 1701-1710 (2011).</li>
<li>Rufaihah, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+derived+from+human+iPSCS+increase+capillary+density+and+improve+perfusion+in+a+mouse+model+of+peripheral+arterial+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells derived from human iPSCS increase capillary density and improve perfusion in a mouse model of peripheral arterial disease.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (11), e72-e79 (2011).</li>
<li>Beauchamp, J. R., Morgan, J. E., Pagel, C. N., Partridge, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+myoblast+transplantation+reveal+a+discrete+minority+of+precursors+with+stem+cell-like+properties+as+the+myogenic+source%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamics of myoblast transplantation reveal a discrete minority of precursors with stem cell-like properties as the myogenic source.</a> J Cell Biol. 144 (6), 1113-1122 (1999).</li>
<li>Qu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+approaches+to+improve+cell+survival+in+myoblast+transfer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of approaches to improve cell survival in myoblast transfer therapy.</a> J Cell Biol. 142 (5), 1257-1267 (1998).</li>
<li>Tang, X. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracoronary+administration+of+cardiac+progenitor+cells+alleviates+left+ventricular+dysfunction+in+rats+with+a+30-day-old+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Intracoronary administration of cardiac progenitor cells alleviates left ventricular dysfunction in rats with a 30-day-old infarction.</a> Circulation. 121 (2), 293-305 (2010).</li>
<li>Zeng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioenergetic+and+functional+consequences+of+bone+marrow-derived+multipotent+progenitor+cell+transplantation+in+hearts+with+postinfarction+left+ventricular+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Bioenergetic and functional consequences of bone marrow-derived multipotent progenitor cell transplantation in hearts with postinfarction left ventricular remodeling.</a> Circulation. 115 (14), 1866-1875 (2007).</li>
<li>Davis, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+myocardial+insulin-like+growth+factor+1+%28IGF-1%29+delivery+with+biotinylated+peptide+nanofibers+improves+cell+therapy+for+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Local myocardial insulin-like growth factor 1 (IGF-1) delivery with biotinylated peptide nanofibers improves cell therapy for myocardial infarction.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (21), 8155-8160 (2006).</li>
<li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+insulin-like+growth+factor-1+in+mice+protects+from+myocyte+death+after+infarction%2C+attenuating+ventricular+dilation%2C+wall+stress%2C+and+cardiac+hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Overexpression of insulin-like growth factor-1 in mice protects from myocyte death after infarction, attenuating ventricular dilation, wall stress, and cardiac hypertrophy.</a> J Clin Invest. 100 (8), 1991-1999 (1997).</li>
<li>Wang, L., Ma, W., Markovich, R., Chen, J. W., Wang, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+cardiomyocyte+apoptotic+signaling+by+insulin-like+growth+factor+I%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Regulation of cardiomyocyte apoptotic signaling by insulin-like growth factor I.</a> Circ Res. 83 (5), 516-522 (1998).</li>
<li>Chong, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic-stem-cell-derived+cardiomyocytes+regenerate+non-human+primate+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts.</a> Nature. 510 (7504), 273-277 (2014).</li>
</ol>

提高 hiPSC-CMs 的产量/纯度
将人类干细胞分化为心肌细胞（CMs）的传统方案通常受限于产量低和纯度不足；例如，通过Percoll分离和心脏体形成获得的hESC-CMs中，仅有35-66%表达慢速肌球蛋白重链或cTnT6。通过筛选与CM特异性蛋白启动子相连的报告基因表达，可显著提高分化后hiPSC-CM群体的纯度7,8,9，但该技术必须使用基因修饰细胞，而这类细胞在临床研究中应用受限。本方案中，68%的hiPSC-CMs表达cTnT，且通过显微解剖和预铺板操作，在无需基因操作或单细胞筛选的情况下，进一步将纯度提升至&#62;90%。每孔总产量约为300万至500万个hiPSC-CMs。
提高 hiPSC-ECs 的产量/稳定性
两种最常用的hi...

人诱导性多能干细胞（hiPSCs）是再生细胞治疗领域最具前景的细胞类型之一，因其可分化为种类和数量几乎不受限制的细胞，且不会被患者的免疫系统排斥。然而，这类细胞的自我复制和分化能力也可能导致肿瘤形成，因此在临床应用前必须将其完全分化为特定细胞类型，例如心肌细胞（CMs）、内皮细胞（ECs）和血管平滑肌细胞（SMCs）。细胞移植最简单且常用的方法之一是直接心肌内注射，但移植细胞被宿主心肌组织成功植入的比例极低。细胞大量丢失在很大程度上可归因于缺血组织的细胞毒性环境；然而，当将小鼠胚胎干细胞（ESCs）直接注射到未受损心脏的心肌中时，所注射的500万个细胞在3至5小时内仅保留了约40%1，这表明大量注射的细胞离开了注射部位，可能是在心肌收缩产生的高压作用下通过针道被挤压排出所致。
本文介绍了一种新颖且显著更高效的方法，用于生成人诱导多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）2、内皮细胞（hiPSC-ECs）3以及平滑肌细胞（SMCs）4。值得注意的是，该hiPSC-SMC实验方案首次通过引导细胞向以合成型或收缩型为主的平滑肌细胞表型分化，模拟了体细胞平滑肌细胞中观察到的广泛形态学和功能特征5。我们还提供了一种细胞递送方法，通过在注射部位形成含有细胞因子的纤维蛋白贴片，提高注射细胞的植入率。该贴片似乎可通过封闭针道防止细胞从心肌组织中逸出，从而提高细胞滞留率；同时通过持续至少三天释放胰岛素样生长因子（IGF），改善细胞存活率。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;方案第1部分&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1培养基</td><td>干细胞技术</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>生长因子减少型基质胶（Matrigel）</td><td>康宁生命科学</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>干细胞技术</td><td>72304</td><td></td></tr><tr><td>B27补充剂，无血清</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>11875-119</td><td></td></tr><tr><td>激活素A（Activin A）</td><td>R&amp;D</td><td>338-AC-010</td><td></td></tr><tr><td>BMP-4</td><td>R&amp;D</td><td>314-BP-010</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>R&amp;D</td><td>232-FA-025</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶IV（Collagenase IV）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>NC0217889</td><td></td></tr><tr><td>汉克斯平衡盐溶液（含葡萄糖、KCl、KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;、NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;、NaCl、Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;，无水）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>14175079</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>10438018</td><td></td></tr><tr><td>6孔板</td><td>康宁生命科学</td><td>356721</td><td></td></tr><tr><td>10 cm培养皿</td><td>康宁生命科学</td><td>354732</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养箱</td><td>松下</td><td>MCO-18AC</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;方案第2部分&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Versene</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15040066</td><td></td></tr><tr><td>纤维蛋白原</td><td>西格玛-奥德里奇</td><td>F8630-5g</td><td></td></tr><tr><td>凝血酶</td><td>西格玛-奥德里奇</td><td>T7009-1KU</td><td></td></tr><tr><td>EMB2培养基</td><td>龙沙</td><td>CC-3156</td><td></td></tr><tr><td>VEGF</td><td>ProSpec-Tany</td><td>CYT-241</td><td></td></tr><tr><td>EPO</td><td>生命技术公司</td><td>PHC9431</td><td></td></tr><tr><td>TGF-&amp;#946;</td><td>Peprotech</td><td>100-21C</td><td></td></tr><tr><td>EGM2-MV培养基</td><td>龙沙</td><td>CC-4147</td><td></td></tr><tr><td>SB-431542</td><td>Selleckchem</td><td>S1067</td><td></td></tr><tr><td>CD31</td><td>BD生物科学</td><td>BDB555445</td><td></td></tr><tr><td>CD144</td><td>BD生物科学</td><td>560411</td><td></td></tr><tr><td>15 ml离心管</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>12565269</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5702R</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;方案第3部分&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>干细胞技术</td><td>720542</td><td></td></tr><tr><td>PDGF-&amp;#946;</td><td>Prospec</td><td>CYT-501-10ug</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;方案第4部分&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>橄榄油</td><td>西格玛-奥德里奇</td><td>O1514</td><td></td></tr><tr><td>明胶</td><td>西格玛-奥德里奇</td><td>G9391</td><td></td></tr><tr><td>丙酮</td><td>西格玛-奥德里奇</td><td>179124</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>BP2818100</td><td></td></tr><tr><td>戊二醛</td><td>西格玛-奥德里奇</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>西格玛-奥德里奇</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>IGF</td><td>R&amp;D</td><td>291-G1-01M</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15561020</td><td></td></tr><tr><td>加热板</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>SP88850200</td><td></td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15-462-10Q</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;方案第5部分&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>西格玛-奥德里奇</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#949;-氨基己酸</td><td>西格玛-奥德里奇</td><td>A0420000</td><td></td></tr><tr><td>MEM培养基</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>12561-056</td><td></td></tr><tr><td>注射器</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>1482748</td><td></td></tr><tr><td>麻醉呼吸机</td><td>Datex-Ohmeda</td><td>47810</td><td></td></tr><tr><td>麻醉呼吸机</td><td>Ohio Medical</td><td>V5A</td><td></td></tr><tr><td>除颤仪</td><td>Physiol Control</td><td>LIFEPAK 15</td><td></td></tr><tr><td>1.5 T磁共振成像仪（MRI）</td><td>通用电气</td><td>Signa Horizon LX</td><td></td></tr><tr><td>7 T磁共振成像仪（MRI）</td><td>西门子</td><td>10018532</td><td></td></tr><tr><td>钆对比剂（Magnevist）</td><td>Berlex</td><td>50419-188-02</td><td></td></tr><tr><td>2-0丝线缝合线</td><td>Ethilon</td><td>685H</td><td></td></tr><tr><td>3-0丝线缝合线</td><td>Ethilon</td><td>622H</td><td></td></tr><tr><td>3-0单股缝合线</td><td>Ethilon</td><td>627H</td><td></td></tr></tbody></table>

多能干细胞来源的心脏细胞用于心肌修复

Pluripotent Stem Cell Derived Cardiac Cells for Myocardial Repair

人诱导性多能干细胞（hiPSCs）在给药前必须完全分化为特定的细胞类型，但将hiPSCs分化为心肌细胞（hiPSC-CMs）、内皮细胞（hiPSC-ECs）和平滑肌细胞（SMCs）的传统方案通常受限于产量低、纯度不足和/或表型稳定性差。本文介绍了一种生成hiPSC-CMs、-ECs和-SMCs的新型方案，其效率显著高于传统方法，同时还介绍了一种将细胞注射与含细胞因子的贴片联合使用的方法，该贴片被置于给药部位之上。该贴片通过封闭针道防止细胞从心肌中被挤出，从而提高注射细胞的滞留率；同时通过持续释放胰岛素样生长因子（IGF）来改善细胞存活。在猪心肌缺血-再灌注损伤模型中，与未使用贴片的细胞给药相比，联合使用含细胞因子贴片时细胞的植入率提高了两倍以上；并且只有同时使用细胞和贴片的治疗组（而非单独使用细胞）表现出心脏功能和梗死面积的显著改善。

分化后hiPSC-CMs、hiPSC-ECs和hiPSC-SMCs的表征
hiPSCs的分化能力被评估2,3,4流式细胞术分析心肌肌钙蛋白T（cTnT）的表达表明，最终hiPSC-CM群体的纯度可超过90%（图1A, 1B，图B1）。几乎所有细胞均表达慢肌球蛋白重链（图1B，图A1），α-肌节肌动蛋白（图1B，图A2），而约25%表达肌球蛋白轻链的2v亚型（MLC2v）（图1B，图B2），该特征仅存在于心室心肌细胞中4. hiPSC-EC 分化方案的效率（<e...

我们提出了三种新颖且更高效的方案，用于将人诱导性多能干细胞分化为心肌细胞、内皮细胞和平滑肌细胞，并提供了一种递送方法，通过结合细胞注射与补片介导的细胞因子递送，提高移植细胞的定植效率。

人类诱导性多能干细胞（hiPSCs）在给药前必须完全分化为特定细胞类型，但传统的分化方案对于……

本视频的主要目标是介绍一种将人类多能干细胞分化为心肌细胞的技术，并展示这些细胞在研究缺血再灌注损伤后心肌修复中的应用。该方法有助于回答有关利用源自心脏细胞的人诱导多能干细胞构建心脏组织以实现心肌修复的关键科学问题。该技术的主要优势在于，它使科研人员能够获得纯化的心肌细胞、平滑肌细胞和内皮细胞，并利用这些前体细胞生成心脏组织。高玲是张博士在阿拉巴马大学伯明翰分校（UAB）实验室的博士后，Greg Walcott 是 UAB 医院的心脏病学家。Trina 是 UAB 医院的磁共振成像（MRI）专家。将诱导多能干细胞分化为心肌细胞时，首先将六孔板的孔用生长因子减少型明胶蛋白混合物包被，并冷却至 4°C。然后，将培养板在4摄氏度下冷藏过夜。第二天，吸除凝胶状的蛋白质混合物，并在每孔中接种一亿个干细胞。切勿将干细胞在培养箱外放置超过15分钟。此外，务必使用新鲜培养基。在此情况下，使用添加了10微摩尔ROCK抑制剂的mTeSR1培养基。然后，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养细胞，并每天轻轻吸除旧培养基（避免接触细胞），用移液管加入新鲜培养基以更换培养基。将细胞培养至90%汇合。分化过程开始三天后，开始观察是否有成簇的搏动细胞出现。一旦发现搏动现象（可能需要一周左右），立即收集细胞。使用血细胞计数板对收缩细胞进行计数，然后以每毫升一百万个细胞的浓度将细胞接种于10厘米培养皿中进行培养。此外，也可通过干细胞诱导生成内皮细胞和平滑肌细胞。这些过程各不相同，但文本方案中已提供了详细说明。首先，在猪心脏上通过手术诱导心肌梗死。简要进行第四肋间开胸术以暴露左前降支冠状动脉。随后，使用结扎线阻断冠状动脉60分钟。必要时对心脏进行除颤。将5毫克微球悬浮于1毫升纤维蛋白原溶液中，并吸入注射器。第三步，用另一个注射器吸取1毫升凝血酶溶液。一小时后，移除用于制造心肌梗死的结扎线。随后，在梗死区域的心外膜上放置一个塑料环，同时将微球和纤维蛋白原溶液与凝血酶溶液注入该环内。静置约30秒，使混合液凝固。这样就制备好了补片。然后，将含有细胞的注射器针头穿过补片插入梗死的心肌区域，并注射细胞。接着，根据动物的大小，使用30或20的Monocryl缝线缝合肌肉层、皮下组织和胸壁。手术后一周和四周，使用心脏磁共振成像（MRI）评估动物的心脏功能。如首个方案所述，将人多能干细胞分化为心肌细胞。为评估其纯度，通过流式细胞术检测心肌肌钙蛋白T，结果显示超过90%的细胞呈阳性。还观察到了其他标志物。几乎所有细胞均表达慢肌球蛋白重链，且几乎所有细胞均表达α-肌节肌动蛋白。约四分之一的细胞表达肌球蛋白轻链的2v亚型，后者是心室心肌细胞的标志物。在比较干细胞系时发现，与PCBC16iPS细胞系相比，GRiPS细胞系的分化效率显著更高。采用经由贴片介导的细胞移植方案，将包含已分化的心肌细胞、内皮细胞和血管平滑肌细胞的

pluripotent-stem-cell-derived-cardiac-cells-for-myocardial-repair

Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

多能干细胞衍生的心肌修复心肌细胞

我们已建立了一种在特定条件下利用小分子直接从多能性人胚胎干细胞诱导心肌母细胞的方案，该方法能够大量获得用于心血管修复的人心脏前体细胞和功能性心肌细胞。...

高效诱导多能人胚胎干细胞生成人心脏前体细胞和心肌细胞的小分子方法

生成排列整齐的心肌组织是将干细胞生物学的最新进展应用于临床实用目的的关键要求。本文中，我们描述了一种微接触印刷技术，可精确控制细胞形态与功能。利用高度纯化的胚胎干细胞来源的心脏前体细胞，我们进而生成了各向异性的功能性心肌组织。...

通过微接触印刷技术生成取向功能性心肌组织

在心血管疾病（如高血压或心肌梗死）的鼠类模型中，心肌内细胞移植被广泛用于评估不同细胞类型在再生研究中的治疗潜力。因此，对该手术操作进行详细描述并提供清晰的可视化展示，将有助于明确在小型啮齿类动物中开展心血管细胞治疗分析的局限性与优势。...

心肌内细胞递送：小鼠心脏中的观察

本方案将介绍从小鼠和人类胚胎干细胞中诱导获得心肌前体细胞的方法。该方案的主要策略是利用流式细胞术，通过在胚胎干细胞系中构建的荧光报告系统来富集心肌前体细胞。...

从胚胎干细胞中获取心脏前体细胞

本文介绍了一种高效利用年轻来源的人类间充质干细胞的心脏分化潜能以生成具有功能且能够收缩的心肌样细胞的方法。...

体外 人源间充质干细胞向功能性类心肌细胞的分化

本文介绍一种通过过表达GATA4、Hand2、Mef2c、Tbx5、miR-1和miR-133（GHMT2m）并同时抑制TGF-β信号通路，将原代胚胎成纤维细胞重编程为功能性心肌细胞的稳健方法。本方案在转导后最早7天即可生成搏动的心肌细胞，重编程效率高达60%。...

抑制促纤维化信号通路增强因子介导的小鼠胚胎成纤维细胞向诱导型心肌细胞的重编程

本方案描述了一种心脏前体细胞的内皮分化技术，重点介绍血清浓度和细胞接种密度如何影响内皮分化潜能。...

低血清条件下诱导心脏前体细胞向内皮细胞分化

本文详细描述了一种实验方案，用于在干细胞移植前对其DNA完整性进行评估的分析。...

评估用于心脏细胞治疗的干细胞DNA完整性

本方案旨在生成含有源自人诱导性多能干细胞的心血管细胞的网状工程化心肌组织，以用于心脏疾病细胞移植治疗的研究。...

由人iPS细胞衍生的网格状工程化心肌组织制备及其在体内心肌修复中的应用

本文介绍了一种从患者外周血单个核细胞稳健地生成并扩增人心肌细胞的实验方案。...

从患者外周血单个核细胞生成与扩增人心肌细胞

在小鼠心肌梗死部位周围进行超声引导下的细胞递送是一种安全、有效且便捷的细胞移植方法。...

超声引导下诱导多能干细胞来源的心肌细胞在心肌梗死小鼠中的移植

学习将人多能干细胞分化为心肌细胞、内皮细胞和平滑肌细胞的高效方案，并利用贴片介导的细胞因子递送技术提高移植细胞在心肌修复中的存活率和整合效果。该方法为心脏组织工程和缺血再灌注损伤后的心肌再生研究提供了重要工具。

多能干细胞来源的心脏细胞用于心肌修复

探索更多视频