Name: 翻修术中的新诊断: 种植超声和多重聚合酶链反应 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: 了解关节穿刺、多重聚合酶链反应和种植超声在人工关节感染诊断中的应用。这些方法能够快速检测病原体，为骨科医生提供可靠的微生物学结果，实现早期针对性治疗。

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作者感谢Curetis GmbH对本研究的支持。

本研究已获得当地伦理委员会批准（046/09，版本3）。所有纳入患者均签署了知情同意书并提供了数据隐私声明。
1. 关节穿刺术
注意：该操作应在具备同等无菌条件的手术室或介入治疗室内进行。有护士或医生协助较为便利，但并非必需。
<ol>
	<li>将患者仰卧位置于检查床上。确保目标关节无衣物遮挡。使用电动剪刀修剪浓密或过长的体毛，切勿使用剃刀刮除体毛。若需穿刺髋关节，应将X线透视机置于前后位方向。若需穿刺膝关节，则在患者膝下放置膝垫卷，使膝关节处于轻度屈曲状态13。</li>
	<li>准备器械台，放置以下无菌器械：无菌棉签、带孔无菌覆盖巾、一次性无菌手术刀、尖头手术刀片（型号 #11）以及带无菌套管（20号，80 mm）的无菌10 mL注射器。另将酒精皮肤消毒剂、采血管和小儿血培养瓶分别摆放备用。</li>
	<li>穿戴手术衣、头套和口罩，并戴上无菌手套。</li>
	<li>使用皮肤消毒剂彻底清洗穿刺部位的皮肤（例如，膝关节穿刺选择髌上囊14，髋关节穿刺选择前外侧入路区域）。 
	注意：应遵守所用消毒剂所需的接触时间（通常膝关节为90秒，髋关节为120秒，使用酒精类消毒剂时）。</li>
	<li>用带孔无菌覆盖巾覆盖穿刺部位，并确定穿刺点。 
	注：膝关节穿刺的正确位置为髌骨上极上方2 cm、外侧髌面外侧2 cm处。髋关节穿刺时，先找到髂前上棘，然后向尾侧移动至与耻骨联合上缘平齐的位置。确保穿刺点位于股动脉外侧约4 cm处，股动脉始终可触及15。
	<ol>
		<li>在穿刺点使用尖头手术刀片做一皮肤小切口（宽3–4 mm，深3–4 mm）。不要使用局部麻醉药，因其具有抑菌作用，可能导致微生物培养出现假阴性结果。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将套管连接至注射器鲁尔滑动接头。将套管经皮肤切口插入。穿刺膝关节髌上囊时，针尖朝向背侧和内侧呈45°角，指向髌骨上极下方的隐窝，进针深度约为5 cm。通过回抽注射器活塞抽取关节液。
	<ol>
		<li>穿刺髋关节时需在X线透视引导下进行。在穿刺点进针，针尖朝内侧呈60°角。在X线透视图像中，确保针尖指向假体颈部。边抽吸边推进套管至约8 cm深度（肥胖患者可能需要更深），直至抽出关节液。抽吸过程中保持针头位置稳定，避免刮擦假体表面。 
		注：针尖接触假体可确认针头位于关节腔内。通常髋关节抽吸出的液体不超过5 mL，而膝关节可抽出超过10 mL的液体。</li>
		<li>拔出套管后，对皮肤切口处覆盖无菌伤口敷料。为防止血肿形成，应对腿部施加轻度加压包扎。&#160;</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将采集的关节穿刺液转移至样本容器中。整个操作过程须保持无菌操作技术。
	<ol>
		<li>使用穿刺所得关节液接种小儿血培养瓶时，先用酒精消毒剂消毒小儿血培养瓶的膜盖。更换新的无菌套管至注射器上，将1至3 mL关节穿刺液注入血培养瓶中。轻轻振荡或旋转混匀16。</li>
		<li>制备原样关节穿刺液标本时，取下注射器上的套管。打开一支不含添加剂的采血管，将1 mL穿刺液注入该管中。盖上管盖并拧紧，用于PCR检测。 
		注：应立即将样本送往微生物实验室进行PCR分析。同一份样本也可用于常规需氧和厌氧微生物培养17。</li>
		<li>将1至4 mL关节穿刺液转移至含EDTA的采血管中，用于细胞计数和分类2。样本须立即送往生化实验室。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. PCR 诊断
<ol>
	<li>确保所有三台设备（裂解仪、分析仪和操作台；参见材料表）均已正确启动并正常运行。将测试所需的所有耗材（PCR反应管、预混液管、样本管及样本管盖、0 - 200 µL移液器和无菌吸头）放置在工作台上。</li>
	<li>在开始操作前，将预混液管置于室温下解冻。所有一次性耗材（预混液管、反应管和样本管）均已预先贴好条形码标签。</li>
	<li>取下样本管的管盖。使用移液器吸取180 µL采集的样本（关节穿刺液，见第1节；或超声处理液，见第4节），转移至样本管中。用含有蛋白酶K及内参基因的样本管盖封闭样本管，用于整个工作流程的质量控制。</li>
	<li>在操作台上，通过触摸左下角的 &#34;new test&#34; 按钮打开操作软件。通过触摸屏输入患者信息或样本编号。选择样本类型时，首先从下拉菜单中选择 &#34;ITI-Cartridge&#34;，然后选择 &#34;Orthopedics&#34; 作为应用模式，最后选择 &#34;synovial&#160;fluid&#34; 或 &#34;sonication fluid&#34; 作为样本类型。按下启动按钮。</li>
	<li>扫描样本管底部的条形码。将样本管插入裂解仪。 
	注意：裂解过程将自动开始，约需30分钟完成。裂解仪屏幕上的倒计时将提示裂解完成时间。</li>
	<li>在操作台屏幕上选择对应样本，以解锁裂解仪中的样本管。从裂解仪中取出样本管，并关闭裂解仪顶部盖板。将样本管转移至PCR反应管的样本管插槽中。将已解冻的预混液管插入PCR反应管的预混液插槽中。</li>
	<li>按照操作台显示器上的指示，扫描带有预混液和样本管的PCR反应管。</li>
	<li>将PCR反应管插入分析仪指定的反应管插槽中。完成后，分析仪将释放反应管。 
	注意：PCR程序由制造商预设，用户无法更改。更多信息请参阅制造商的应用指南。PCR过程将自动开始，耗时约4小时10分钟。</li>
	<li>取出并丢弃反应管。在操作台触摸屏上，选择左下角的 &#34;current tests&#34;，然后选择正确的样本编号以显示检测结果。将结果保存至仪器内存，并打印或导出（通过U盘）以供后续参考。 
	注意：应立即向外科医生报告PCR结果，包括病原体鉴定和耐药标志物检测结果。检测面板涵盖通常与植入物感染和软组织感染相关的114种细菌和真菌病原体的脱氧核糖核酸（DNA）靶标，以及最常见的抗生素耐药标志物。</li>
</ol>
3. 手术步骤：术中样本采集
注意：翻修关节置换手术需要具备专家级别的技能和经验；如需全面了解手术操作，请参考外科医师专用教科书18。完整而详细的手术步骤描述已超出本文范围。本文重点介绍样本采集及分析前处理的细节。在翻修关节置换手术中，应避免单次注射抗生素预防用药，以免影响术中获取的微生物学样本检测结果。尽管该做法尚存争议19,20，但仍建议遵循此原则。应尽可能采用原有的手术入路进入关节。额外的手术入路可能损伤软组织并增加瘢痕形成。
<ol>
	<li>解剖组织直至充分暴露关节囊。进行关节切开术时应准备好注射器，以便将更多的关节液收集到无菌注射器中，用于后续分析（如上文步骤1.7.1-1.7.3所述）。 
	注意：在取出假体并采集组织样本之前，不得使用任何抗菌冲洗液。</li>
	<li>取出关节假体。取出后立即把假体部件转移至带有气密和水密盖子的无菌塑料容器中。 
	注意：有关假体取出的详细操作说明可参见教科书文献（膝关节，例如：Wirtz et al.，第16.4章21；髋关节，例如：Claes et al.，第14.5.1章22）。根据制造商说明，可能需要使用特定器械。不同假体类型和固定方式的取出技术差异较大。凿子和钻头套装、滑锤以及通用髓内钉取出套装有助于移除骨整合型假体23,24。</li>
	<li>使用无菌锐性刮匙、镊子和咬骨钳，从骨-假体界面清除膜状组织。取具有代表性的组织样本，置于带螺旋盖的无菌塑料容器中，用于微生物学和组织病理学检查。 
	注意：可使用扩髓器清除髓腔内的所有软组织。同时应采集滑膜和关节囊组织样本用于检查，并储存在无菌容器中。总共至少需采集四个样本。</li>
	<li>立即将所有样本和取出的假体部件送至微生物学实验室。 
	注意：此后方可给予抗生素治疗。正确选择抗生素至关重要，必须个体化决策25,26。治疗方案应由外科医生与微生物学家组成的多学科团队预先共同制定。</li>
	<li>彻底清创原假体植入部位，清除所有显示有异物残留（如聚乙烯磨损颗粒、金属或骨水泥碎屑）或感染与坏死迹象（脓性、无血供、纤维蛋白覆盖、膜状或&#34;淤泥样&#34;组织）的组织。清除所有坏死骨或骨炎性骨组织。彻底清除所有异物，如螺钉、钢丝、环扎带、骨水泥碎屑或不可吸收缝线（参见 Claes et al.，第14.5.3章22）。</li>
	<li>使用50 mL注射器，以所选的伤口消毒剂冲洗手术区域。使用脉冲式冲洗系统，以大量林格氏液（至少3 L）进行充分冲洗。必要时可使用间隔物以稳定关节27。</li>
	<li>使用抗菌涂层可吸收缝线缝合深部组织：关节囊或筋膜层采用三氯生涂层编织聚乳酸羟基乙酸共聚物缝线（USP 2），皮下组织采用相同材质缝线（USP 0）。皮肤采用非吸收性间断缝合（单股聚丙烯缝线，USP 0 或 USP 2-0）。</li>
</ol>
4. 超声处理
注意：务必严格进行无菌操作。对移植材料进行后续处理时，应使用 II 级生物安全柜并配合层流空气系统。
<ol>
	<li>在层流工作台内打开来自手术室的含有移除假体的塑料容器（参见步骤 3.2），加入无菌 0.9% 氯化钠溶液，直至覆盖至少 80% 的移除异物（约 500–800 mL）。</li>
	<li>盖紧塑料容器，充分振荡或使用涡旋振荡器以高强度振荡 30 秒。将塑料容器转移至超声浴中，检查超声浴内的液面高度。 
	注意：超声浴中的液面高度必须与塑料容器内的液面高度一致。确保塑料容器不会进水，必要时向超声浴中添加或移除液体。</li>
	<li>以 40 ± 2 kHz 的频率和 0.22 ± 0.04 W/cm2 的功率密度对样本进行 5 分钟超声处理。随后充分振荡或涡旋样本 30 秒。 
	注意：1–5 分钟的超声时间最有利于生物膜的解离，且不会影响细菌的存活能力28。</li>
	<li>在层流工作台内，收集 50 mL 超声液，并转移至一个无菌、密封严密的试管中。</li>
	<li>为制备浓缩的超声液，将试管在 4,200 × g 条件下离心 10 分钟。保留 10 mL 残余体积，用移液器弃去其余上清液。通过移液和涡旋重悬沉淀物。</li>
	<li>分别取 0.5 mL 浓缩超声液接种至合适的培养基（例如 血琼脂、巧克力琼脂、沙保弱琼脂、谢德勒琼脂、卡那霉素-万古霉素琼脂或巯基乙酸盐肉汤）。按上述方法（参见步骤 1.7.1）取 2 mL 接种至儿童血培养瓶。取 1 mL 浓缩超声液转移至不含添加剂的采血管中，用于 PCR 分析。</li>
	<li>将接种后的培养基转移至培养箱（35 °C，5% CO2）中培养 14 天，每天观察是否有微生物生长。</li>
	<li>14 天后，丢弃无生长的培养物并报告为阴性结果。若检测到微生物生长，应立即采用标准鉴定技术进行病原体鉴定及药敏试验，并将结果及时报告给外科医生。 
	注意：本研究中采用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）进行病原体鉴定。抗菌药物敏感性试验使用半自动分析仪完成29,30,31。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

异物感染是骨科和创伤外科中日益突出的问题，其治疗费用高昂，住院时间长，且会导致受累关节功能障碍。鉴别诊断具有挑战性。目前许多研究人员和临床医生正关注这一问题，致力于寻找更精确、更可靠的诊断方法以识别与异物相关的感染。迄今为止，已有多种不同的诊断工具正在被评估，并逐步纳入诊断流程32。
超声处理程序是一种极为重要的方法，其灵敏度优于组织标本的传统培养方法6。在本研究中，我们发现超声液培养的灵敏度为88.9%，特异性为61.5%；而组织标本和关节穿刺液的传统培养灵敏度均为66.7%，特异性分别为82.3%和84.6%。其他研究人员对这些传统微生物学方法也报道了类似的结果6,33,34,35。人们常批评超声处理程序容易受到污染，因此在样本处理过程中必须格外小心。
在组织标本或体液中检测致病病原体DNA的可能性令人关注。与耗时较长的微生物培养方法相比，核酸扩增技术（NAT）是一种快速检测方法，可在数小时内获得结果。毫无疑问，NAT在病原体检测方面具有良好的敏感性，但存在检出污染物的风险，因此特异性较差36。研究表明，特别是在手术前近期或长期接受抗生素治疗的患者中，PCR技术在诊断假体关节感染（PJI）方面具有显著优势7,8。有研究提示，对超声清洗液进行NAT检测可进一步提高敏感性和特异性37。然而，由于该技术操作流程耗时，目前尚未在实验室中常规开展。
PCR 技术总体上存在某些局限性：核酸扩增检测（NAT）能够检测 DNA，但无法区分活菌与非活菌，使得结果解读困难。广谱 PCR 仅能检测核糖体 16S 核糖核酸（16S rRNA），无法区分病原体37。更特异的检测系统通常无法常规检出基因编码的抗生素耐药标志物。因此，在缺乏进一步药敏试验的情况下，靶向抗生素治疗可能受到限制。
本研究中采用的系统克服了其中一些局限性，能够区分特定细菌并鉴定基因编码的耐药标志物。总体而言，核酸扩增检测（NAT）可被视为快速且有用的补充方法，用于确认假体关节感染（PJI）7,8,9,38。
在进行关节穿刺和手术时，必须提前做好规划：样本容器必须无菌并准备就绪，且需确保样本能够及时运送。外科医生应提前向微生物学家通报拟进行的手术操作及预期获取的样本类型。实施关节穿刺时，必须严格维持无菌条件，以防止医源性关节感染。对于脂肪组织较多的患者，关节穿刺可能较为困难，此时可借助透视引导以提高准确性。翻修关节置换手术对技术要求极高，应仅由经验丰富的外科医生实施。取出的植入物材料在手术室内停留的时间应尽可能短，须尽快送至微生物学实验室。本操作规程中一个极为关键的环节是潜在的污染风险。不仅在样本采集过程中，而且在微生物学实验室处理样本时，所有相关人员（骨科医生、护士、技术人员、微生物学家）都必须操作迅速、准确，并接受过相关操作流程的规范培训。
超声处理和核酸扩增技术（NAT）是诊断植入物相关感染的有用工具。然而，其结果始终需要谨慎评估。我们建议由骨科医生、微生物学家、感染病专家和病理学家共同进行多学科会诊，讨论检测结果，以确定个体化的治疗策略。
将该技术应用于PJI的诊断流程中可能具有多个优势。它是一种快速诊断方法，数小时内即可获得结果。由于可分析多个基因编码的耐药标记物，因此可在临床病程的早期阶段即启动针对性的抗生素治疗。作为附加益处，广谱抗生素可被保留用于真正需要的适应证。根据我们的方案，也可对其他类型的样本（例如组织标本、拭子、血肿、等）进行检测。由于PCR检测盒为封闭系统，用户端无需也不可进行任何故障排查。任何对方案的修改必须由制造商实施。制造商持续对软件和硬件（检测盒）进行改进以提升系统性能，但不会公开新版本中具体变更的详细信息。

疼痛性关节成形术在骨科手术中构成诊断挑战。在无菌性松动之后，PJI 是假体失效的第二大原因，也是关节成形术后严重的并发症。PJI 难以治疗且难以诊断。若漏诊 PJI，很可能导致感染复发，造成严重发病率、功能丧失以及生活质量下降。因此，在所有主诉关节成形术后疼痛的患者中，必须在启动任何治疗措施之前排除感染的可能性。
患者病史、临床检查、C反应蛋白和白细胞计数的血液检查，以及受累关节的X线检查或闪烁显像构成了基本的诊断方法1。术前常规还应尽可能在无菌条件下进行关节穿刺。所获取的穿刺液是进一步诊断中极为有价值的材料。
除了关节穿刺液中的细胞计数和细胞分类等已确立的检测方法外2，蛋白质生物标志物的检测可能有助于鉴别诊断3,4,5。传统的微生物培养仍是病原体检测的金标准。由革兰阳性菌和革兰阴性菌引起的生物膜附着于植入物表面，是假体关节感染（PJI）的主要致病因素。因此，2007年，超声振荡技术被引入骨科手术中与异物相关感染的诊断，通过破坏取出植入物表面的生物膜，使病原体得以释放并被检测。该过程可使细菌从静止状态转变为活跃状态，从而再次实现培养检测。对取出的植入物进行超声振荡的检测敏感性高于组织标本培养（78.5% vs. 60.8%）6。
核酸扩增检测（NAT），例如PCR，最近已被临床医生和微生物学家用于诊断假体关节感染（PJI）。特别是在手术前接受过抗生素治疗的患者中，研究表明PCR诊断在识别致病微生物方面具有优势7,8,9。最近推出了一种新型多重PCR系统，专为植入物和组织感染（ITI）设计。该基于 cartridge 的系统提供了多种基因组标记，可用于病原体鉴定以及抗生素耐药标记的检测。其适用范围涵盖多种临床指征（假体关节感染、手术部位感染、心血管相关感染、导管相关感染、糖尿病足感染、深部皮肤和组织感染、植入物感染以及烧伤创面感染），并可使用多种类型的样本材料进行检测（超声清洗液、滑膜液、拭子、组织、脓液、穿刺液/渗出液以及生物膜）10,11,12。
与传统微生物学方法相比，该操作的最大优势在于速度快：可在数小时内鉴定出致病病原体。此外，该PCR系统可检测多种基因编码的耐药标志物，从而能够尽早启动靶向抗生素治疗。借助PCR技术，外科医生可能在诊断流程的早期阶段即能区分感染与非感染患者11。本文中，我们展示了利用多重PCR快速诊断关节穿刺液和超声处理液中假体关节感染（PJI）的实验方案。

<table><tbody><tr><td>无菌塑料容器&amp;nbsp;</td><td>Lock &amp; Lock, Distributor ISI GmbH, Solingen, Germany</td><td>EAN 8803733184403</td><td>植入物运输容器</td></tr><tr><td>Bactosonic 14.2&amp;nbsp;</td><td>Bactosonic, Bandelin, Berlin, Germany</td><td>3290</td><td>&quot;超声震荡仪&quot;</td></tr><tr><td>50 ml Falcon 管</td><td>Becton &amp; Dickinson, Heidelberg, Germany</td><td>352070</td><td>离心</td></tr><tr><td>PEDS 培养基血培养瓶&amp;nbsp;</td><td>Becton &amp; Dickinson, Heidelberg, Germany</td><td>442194</td><td>培养基</td></tr><tr><td>含 5% 绵羊血的哥伦比亚琼脂</td><td>Becton &amp; Dickinson, Heidelberg, Germany</td><td>254071</td><td>培养基</td></tr><tr><td>麦康凯琼脂</td><td>Becton &amp; Dickinson, Heidelberg, Germany</td><td>254078</td><td>培养基</td></tr><tr><td>巧克力琼脂&amp;nbsp;</td><td>Becton &amp; Dickinson, Heidelberg, Germany</td><td>254089</td><td>培养基</td></tr><tr><td>沙保琼脂&amp;nbsp;</td><td>Becton &amp; Dickinson, Heidelberg, Germany</td><td>254096</td><td>培养基</td></tr><tr><td>硫乙醇酸盐肉汤&amp;nbsp;</td><td>Becton &amp; Dickinson, Heidelberg, Germany</td><td>221788</td><td>培养基</td></tr><tr><td>谢德勒琼脂</td><td>Becton &amp; Dickinson, Heidelberg, Germany</td><td>254084</td><td>培养基</td></tr><tr><td>卡那霉素/万古霉素琼脂</td><td>Becton &amp; Dickinson, Heidelberg, Germany</td><td>254077</td><td>培养基</td></tr><tr><td>Bactec FX 血培养系统&amp;nbsp;</td><td>Becton &amp; Dickinson, Heidelberg, Germany</td><td>441386/441385</td><td>培养基</td></tr><tr><td>Unyvero A50 分析仪</td><td>Curetis, Holzgerlingen, Germany</td><td>60001</td><td>PCR 仪</td></tr><tr><td>Unyvero L4 裂解仪</td><td>Curetis, Holzgerlingen, Germany</td><td>60002</td><td>PCR 仪</td></tr><tr><td>Unyvero C8 控制台</td><td>Curetis, Holzgerlingen, Germany</td><td>60003</td><td>PCR 仪</td></tr><tr><td>Unyvero M1 Masterix 管</td><td>Curetis, Holzgerlingen, Germany</td><td>10002</td><td>PCR 耗材</td></tr><tr><td>Unyvero i60 ITI 检测盒</td><td>Curetis, Holzgerlingen, Germany</td><td>10040</td><td>PCR 耗材</td></tr><tr><td>Unyvero 样本管盖</td><td>Curetis, Holzgerlingen, Germany</td><td>10004</td><td>PCR 耗材</td></tr><tr><td>Unyvero 样本管</td><td>Curetis, Holzgerlingen, Germany</td><td>10003</td><td>PCR 耗材</td></tr><tr><td>S-Monovette 2.7 ml</td><td>Sarstedt AG, N&amp;uuml;mbrecht, Germany</td><td>05.1729.001&amp;nbsp;</td><td>运输容器（穿刺液）</td></tr><tr><td>11 号手术刀</td><td>pfm medical, Cologne, Germany</td><td>200130011</td><td>用于穿刺切口的手术刀</td></tr><tr><td>PP 容器 70 mL 55×45 mm</td><td>Sarstedt AG, N&amp;uuml;mbrecht, Germany</td><td>759,922,721</td><td>运输容器（组织标本）</td></tr><tr><td>Vicryl Plus</td><td>Johnson&amp;Johnson Medical GmbH, Ethicon Germany, Norderstedt, Germany</td><td>VCP247H</td><td>外科缝合材料</td></tr><tr><td>Prolene 0</td><td>Johnson&amp;Johnson Medical GmbH, Ethicon Germany, Norderstedt, Germany</td><td>EH7920H</td><td>外科缝合材料</td></tr><tr><td>Prolene 2/0</td><td>Johnson&amp;Johnson Medical GmbH, Ethicon Germany, Norderstedt, Germany</td><td>EH7697H</td><td>外科缝合材料</td></tr><tr><td>Kodan&amp;nbsp; Tinktur forte 无色</td><td>Sch&amp;uuml;lke &amp; Mayr GmbH, Norderstedt, Germany</td><td>104005</td><td>酒精类皮肤消毒剂</td></tr></tbody></table>

翻修关节成形术中的新型诊断技术：假体超声处理与多重聚合酶链式反应

Novel Diagnostics in Revision Arthroplasty: Implant Sonication and Multiplex Polymerase Chain Reaction

在骨科患者中，与异物相关的感染，尤其是假体周围关节感染（PJIs），是关节成形术的一种严重并发症。感染需要复杂的治疗，可能导致长期住院，并带来巨大的医疗费用。这些患者可能需要多次手术翻修，导致功能丧失以及生活质量下降。
常规术前诊断包括C反应蛋白（CRP）及其他生物标志物的血液检测，以及关节穿刺液的细胞计数、分类和培养分析。术中获取组织标本进行组织学和微生物学检查也是标准操作流程。对取出的植入物进行超声处理后的微生物学检查，结合分子生物学技术在微生物学中的应用，是目前用于提高假体关节感染（PJI）鉴别诊断准确性的两项新技术。
本文介绍了使用基于 cartridge 的多重聚合酶链式反应（PCR）系统对关节穿刺液和超声处理液进行分析的逐步操作流程。PCR检测结果与传统培养方法及PJI的共识标准进行了比对。组织活检、关节穿刺液和超声处理液的传统微生物培养的敏感性分别为66.7%、66.7%和88.9%，特异性分别为82.3%、54.6%和61.5%。超声处理液和关节穿刺液的PCR诊断敏感性分别为50.0%和55.6%，特异性均为100.0%。两种PCR诊断方法联合使用时，敏感性为66.7%，特异性为100.0%。因此，多重PCR是一种在诊断PJI时具有中等敏感性但高特异性的快速诊断工具。

根据肌肉骨骼感染学会（Musculoskeletal Infection Society, MSIS）共识会议的定义，当满足一项主要标准或五项次要标准中的至少三项时，即认定为假体关节感染（PJI）成立。主要标准包括存在窦道，或在两次独立的微生物学样本中检出病原体。次要标准包括关节穿刺液中白细胞计数升高（>3,000 个/µL）或细胞分类异常（中性粒细胞比例 >85%）、血液样本中C反应蛋白（CRP）和红细胞沉降率升高、组织样本中病理学检查阳性，或仅在一次微生物学样本中检出病原体19。以MSIS标准作为金标准，计算了核酸扩增检测（nucleic acid amplification test, NAT）的敏感性和特异性。患者详细信息及检出的病原体见表1。
我们自己的研究结果显示，对超声处理液和关节穿刺液进行PCR诊断的敏感性中等（分别为50.0%和55.6%），但特异性极强，达到100%11。在所有PCR检测（总计n = 62次检测）中，当关节穿刺液（n = 31）或超声处理液（n = 31）显示阳性结果时，后续均在同一病例的常规微生物培养中检出相同的病原体。对非感染病例的不同样本进行PCR检测均未出现假阳性结果（见图1）。
PCR 诊断未能检测出一些通过传统微生物培养方法证实存在的病原体。在超声处理液样本中，16 种（37.0%）真实病原体中有 6 种未被 PCR 检测到；在关节液培养中，13 种病原体中有 5 种（38.0%）未被 PCR 检测到。其中，PCR 诊断主要漏检的是凝固酶阴性葡萄球菌（共 11 株中有 8 株漏检）。联合使用两种样本材料（关节穿刺液和超声处理液，“合并 PCR”）的 PCR 检测可正确识别 18 例感染病例中的 12 例（敏感性为 66.7%，95% 可信区间：41.0% 至 86.7%，见 表 2）。
<img alt="PCR检测方法图表；PJI与非PJI病例中假阳性/假阴性分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55147/55147fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 1"> 
图1：NAT结果汇总。 该图显示了所有患者样本的汇总结果。右侧为符合PJI诊断标准的患者组，左侧为不符合该标准的患者组。柱状图代表核酸扩增方法。假阳性和假阴性以占总数的百分比形式用红色标出。<a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55147/55147fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>关节</td>
			<td>修订原因</td>
			<td>是否符合 MSIS 标准？</td>
			<td>既往抗生素治疗？</td>
			<td>超声处理液培养</td>
			<td>关节穿刺液培养</td>
			<td>NAT 超声处理培养</td>
			<td>NAT 关节穿刺液</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>髋关节</td>
			<td>无菌性松动</td>
			<td>无</td>
			<td>无</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>膝关节</td>
			<td>无菌性松动</td>
			<td>无</td>
			<td>无</td>
			<td>金黄色葡萄球菌 
			表皮葡萄球菌</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>膝关节</td>
			<td>无菌性松动</td>
			<td>无</td>
			<td>无</td>
			<td>Dermabacter 
			hominis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>膝关节</td>
			<td>无菌性松动</td>
			<td>无</td>
			<td>无</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>膝关节</td>
			<td>无菌性松动</td>
			<td>无</td>
			<td>无</td>
			<td>Leifsonia 
			水生植物</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>髋部</td>
			<td>无菌性松动</td>
			<td>无</td>
			<td>无</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>膝关节</td>
			<td>无菌性松动</td>
			<td>无</td>
			<td>无</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>膝关节</td>
			<td>不稳定性</td>
			<td>无</td>
			<td>无</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>髋关节</td>
			<td>慢性脱位</td>
			<td>无</td>
			<td>无</td>
			<td>金黄色葡萄球菌 
			haemolyticus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>膝关节</td>
			<td>无菌性松动</td>
			<td>无</td>
			<td>无</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>髋关节</td>
			<td>无菌性松动</td>
			<td>无</td>
			<td>无</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>髋关节</td>
			<td>无菌性松动</td>
			<td>无</td>
			<td>无</td>
			<td>金黄色葡萄球菌 
			表皮葡萄球菌</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>膝关节</td>
			<td>不稳定性</td>
			<td>无</td>
			<td>无</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>膝关节</td>
			<td>急性感染</td>
			<td>是</td>
			<td>是</td>
			<td>铜绿假单胞菌</td>
			<td>铜绿假单胞菌</td>
			<td></td>
			<td>假单胞菌 
			aeruginosa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>膝关节</td>
			<td>急性感染</td>
			<td>是</td>
			<td>无</td>
			<td>大肠杆菌 
			coli</td>
			<td>大肠杆菌 
			coli</td>
			<td>大肠杆菌 
			coli</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>髋关节</td>
			<td>慢性感染</td>
			<td>是</td>
			<td>无</td>
			<td>棒状杆菌 
			种（spp.）</td>
			<td>金黄色葡萄球菌 
			表皮葡萄球菌</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>膝关节</td>
			<td>急性感染</td>
			<td>是</td>
			<td>无</td>
			<td>Staphylococcus aureus</td>
			<td>Staphylococcus aureus</td>
			<td>Staphylococcus aureus</td>
			<td>金黄色葡萄球菌 
			aureus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>膝关节</td>
			<td>慢性感染</td>
			<td>是</td>
			<td>无</td>
			<td>链球菌 
			agalacticae</td>
			<td>链球菌 
			agalacticae</td>
			<td>链球菌 
			agalacticae</td>
			<td>链球菌 
			agalacticae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>髋部</td>
			<td>慢性感染</td>
			<td>是</td>
			<td>是</td>
			<td></td>
			<td>Staphylococcus aureus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>膝关节</td>
			<td>慢性感染</td>
			<td>是</td>
			<td>无</td>
			<td>金黄色葡萄球菌 
			表皮葡萄球菌</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>膝关节</td>
			<td>慢性感染</td>
			<td>是</td>
			<td>是</td>
			<td>金黄色葡萄球菌 
			 表皮葡萄球菌</td>
			<td>金黄色葡萄球菌 
			表皮葡萄球菌</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>髋部</td>
			<td>慢性感染</td>
			<td>是</td>
			<td>无</td>
			<td>金黄色葡萄球菌 
			表皮葡萄球菌</td>
			<td>金黄色葡萄球菌 
			表皮葡萄球菌</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>膝关节</td>
			<td>慢性感染</td>
			<td>是</td>
			<td>无</td>
			<td>金黄色葡萄球菌 
			表皮葡萄球菌</td>
			<td></td>
			<td>凝固酶阴性 
			葡萄球菌</td>
			<td>凝固酶阴性 
			葡萄球菌</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>髋关节</td>
			<td>慢性感染</td>
			<td>是</td>
			<td>无</td>
			<td>Staphylococcus aureus</td>
			<td></td>
			<td>Staphylococcus aureus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>膝关节</td>
			<td>急性感染</td>
			<td>是</td>
			<td>无</td>
			<td>金黄色葡萄球菌 
			表皮葡萄球菌</td>
			<td>金黄色葡萄球菌 
			表皮葡萄球菌</td>
			<td>凝固酶阴性 
			葡萄球菌</td>
			<td>凝固酶阴性 
			葡萄球菌</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>髋部</td>
			<td>急性感染</td>
			<td>是</td>
			<td>无</td>
			<td></td>
			<td>金黄色葡萄球菌 
			表皮葡萄球菌</td>
			<td></td>
			<td>凝固酶阴性 
			葡萄球菌</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>髋部</td>
			<td>慢性感染</td>
			<td>是</td>
			<td>无</td>
			<td>金黄色葡萄球菌 
			表皮葡萄球菌</td>
			<td>金黄色葡萄球菌 
			表皮葡萄球菌</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>髋关节</td>
			<td>急性感染</td>
			<td>是</td>
			<td>无</td>
			<td></td>
			<td>金黄色葡萄球菌 
			表皮葡萄球菌</td>
			<td>凝固酶阴性 
			葡萄球菌</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>膝关节</td>
			<td>慢性感染</td>
			<td>是</td>
			<td>无</td>
			<td>Staphylococcus aureus</td>
			<td>Staphylococcus aureus</td>
			<td></td>
			<td>金黄色葡萄球菌 
			aureus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>髋关节</td>
			<td>慢性感染</td>
			<td>是</td>
			<td>无</td>
			<td>肠球菌 
			faecialis</td>
			<td>肠球菌 
			faecialis</td>
			<td>肠球菌 
			种（spp.）</td>
			<td>肠球菌 
			种（spp.）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>膝关节</td>
			<td>慢性感染</td>
			<td>是</td>
			<td>是</td>
			<td>肠球菌 
			faecalis</td>
			<td>肠球菌 
			faecalis</td>
			<td>肠球菌 
			种（spp.）</td>
			<td>肠球菌 
			种（spp.）</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：患者信息及检出病原体。 患者信息的表格结果，包括翻修手术原因、符合MSIS标准情况，以及传统微生物学和核酸扩增检测（NAAT）分析中检出的病原体。
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>标准</td>
			<td>PCR 超声处理</td>
			<td>PCR 抽吸</td>
			<td>混合 PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P 值</td>
			<td>0.0036</td>
			<td>0.0013</td>
			<td>0.0001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>灵敏度</td>
			<td>50.0%</td>
			<td>55.6%</td>
			<td>66.7%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>特异性</td>
			<td>100.0%</td>
			<td>100.0%</td>
			<td>100.0%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>阳性预测值</td>
			<td>100.0%</td>
			<td>100.0%</td>
			<td>100.0%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>阴性预测值</td>
			<td>59.1%</td>
			<td>61.9%</td>
			<td>68.4%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：微生物学方法的结果。 超声液、关节穿刺液及混合PCR的PCR诊断评估结果以表格形式展示。穿刺液和超声液分别为31份样本（N = 31），混合PCR数据为62份样本（n = 62）。

疼痛性关节假体的鉴别诊断对治疗成功至关重要。术前常规进行关节穿刺。本文介绍了一种利用多重聚合酶链式反应对关节穿刺液及超声振荡液进行快速病原体检测的可行方法。

在骨科患者中，与异物相关的感染，尤其是假体周围关节感染（PJIs），是……的一种灾难性并发症。

本方案旨在通过关节穿刺、多重聚合酶链式反应以及超声处理等操作，为骨科医生在疑似假体周围关节感染病例中提供快速且可靠的微生物学检测结果。该方法有助于回答假体周围关节感染诊断与治疗中的关键问题，例如病原体的早期发现，从而实现早期靶向治疗。这些技术的主要优势在于能够快速提供检测结果。这可以加快疑似假体周围关节感染病例的鉴别诊断速度。将患者仰卧位安置在检查床上。若需穿刺膝关节，则在患者膝下放置一个膝垫卷，使膝关节处于轻度屈曲位。使用电动剪毛器修剪浓密或过长的体毛。然后根据文本方案准备手术器械台并进行手术着装。接着使用皮肤消毒剂彻底清洗患者穿刺部位的皮肤。用无菌有孔洞巾覆盖穿刺部位，然后透过洞巾确定穿刺点。使用尖头手术刀片，在穿刺点处通过皮肤做一小的穿刺切口。将套管连接至注射器的鲁尔滑动接头，随后通过穿刺切口插入套管。在膝关节的上方隐窝处，将套管以45度角朝向背侧和内侧的隐窝方向推进，位于髌骨上极下方，插入深度约为5 cm。通过拉动注射器活塞抽取关节液。为防止血肿形成，对穿刺切口处先进行敷料覆盖，再包扎绷带。使用酒精类消毒剂对小儿血培养瓶的膜进行消毒。然后将新的套管针安装到注射器上，将抽吸出的1至3 mL关节液注入烧瓶中。通过轻轻振荡或旋转混合。如需制备天然关节穿刺液标本，需将套管针从注射器上取下。然后打开一支不含添加剂的采血管，将1 mL抽吸液注入采血管中。盖上并拧紧管盖，用于PCR分析。取1至4 mL关节抽吸液，转移至含有EDTA的采血管中，用于细胞计数和分类。将主混合液管置于室温下解冻。取180 μL采集的样本转移至样本管中。使用含有蛋白酶K和内参基因的样本管盖封闭样本管，用于整个工作流程的质量控制。在操作台处，通过触摸左下角的“New Test”按钮打开操作软件。使用触摸屏输入患者数据或样本编号。从下拉菜单中选择标本类型时，首先选择 ITI Cartridge，然后选择 Orthopedics 作为应用模式，最后选择 Synovial Fluid 或 Sonication Fluid 作为样本类型。然后按下“Start”按钮。扫描样本管底部的条形码，然后将样本管插入裂解仪中。接着在操作界面屏幕上选择该样本，以从裂解仪中解锁样本管。然后将样本管从裂解仪中取出，并关闭裂解仪的上盖。将样本管转移至PCR卡匣的样本管插槽中。接着将已解冻的预混液管插入PCR卡匣的预混液插槽中。按照驾驶舱显示器上的说明，扫描含有主混合液和样本管的PCR反应板。将PCR反应板插入分析仪指定的卡槽中。在驾驶舱触摸屏的左下角，选择“正在运行的检测”，然后选择正确的样本编号以查看检测结果。将结果保存在仪器的内存中，并打印或导出以供后续参考。与您的微生物学家沟通，向其简要说明病例详情，以便其能够及时准备分析样本。在超净工作台内，打开来自手术室的含有取出假体的塑料容器，加入无菌0.9%氯化钠溶液，使取出的异物至少有80%被覆盖，然后关闭塑料容器。然后彻底摇动或振荡塑料容器30秒。将塑料容器放入超声浴中。随后检查超声浴的液位。将样本以40 ± 2千赫兹的频率和0.22 ± 0.04瓦特/平方厘米的功率密度超声处理5分钟。然后将样本振荡或充分涡旋30秒。在超净工作台内，收集50 mL超声液并转移至无菌管中，随后 tightly 密封该管。为制备浓缩的超声处理液，将离心管在4200 × g条件下离心10分钟，保留10 mL残余体积，用移液器弃去剩余上清液。通过移液和涡旋振荡重悬沉淀。向每瓶合适的培养基中接种0.5 mL浓缩超声处理液。将2 mL浓缩超声处理液接种至儿童血培养瓶中，操作方法如本视频前面所示。然后取1 mL浓缩超声处理液转移至不含添加剂的无菌试管中，用于PCR分析。将接种后的培养基转移至培养箱中。将培养物孵育14天，并每天检查生长情况。当存在一项主要标准或五项次要标准中的至少三项时，即可认定为假体周围关节感染。主要标准包括存在瘘管或在两份独立的微生物样本中检测到病原体。次要标准包括关节穿刺液中检出阳性细胞计数或阳性细胞分化，血液样本中C反应蛋白（CRP）和血沉呈阳性，组织样本中组织学检查呈阳性，或仅在一个微生物样本中检出病原体。本研究结果显示，对超声处理液和关节穿刺液进行PCR检测的敏感性中等，但特异性极高，达到100%；每当PCR在关节穿刺液或超声处理液中显示阳性结果时，后续均在同一病例的常规微生物培养中检出相同病原体。对非感染病例不同样本进行PCR检测未出现假阳性结果。在超声处理液样本的16种真正致病菌中，以及关节液培养的13种病原体中的5种，PCR检测未能检出。联合使用关节穿刺液和超声处理液进行PCR检测，可正确识别18例感染病例中的12例。观看本视频后，您应能充分了解如何优化假体周围关节感染的诊断路径。可以看出，微生物学家与骨科外科医生必须紧密合作，以不断改进鉴别诊断的可能性。若操作得当，关节穿刺后仅需五小时即可获得基于 cartridge 的多重 PCR 所提供的具有临床价值的结果。在实施该操作过程中，必须始终牢记在整个流程中严格保持无菌操作。请勿忘记，处理人体组织样本或微生物样本可能具有极高的危险性。在进行本操作时，应始终采取所有预防措施，例如佩戴个人防护装备。

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