利用酵母双杂交筛选解析不可培养植物病原菌效应子的功能

本实验的总体目标是通过鉴定一种‘候选属植物菌原体致病蛋白’与苹果（Malus domestica）宿主蛋白之间的相互作用，揭示病原体的致病策略及宿主与病原体之间的互作系统。该方法可用于解答多个不同生物学研究领域的关键科学问题，本文中将其应用于植物研究，以阐明苹果增生病发生发展的分子机制。该技术的主要优势在于，可针对单一病原效应蛋白同时筛选数千种潜在的互作蛋白，使该方法成为感染机制研究中简便可行的起点。

首先，识别具有苹果增生病特异性症状的感病植株，以及无症状的健康对照植株。使用洁净的修枝剪，从根系三个不同部位截取根样，根样直径为 0.5–1 cm，长度约 5 cm。将根样放入标记清楚的塑料袋中。

然后将样品放入装有预冷冰袋的冷藏箱中，并在4 °C下保存直至进一步处理。用清水冲洗根部样品以去除土壤。随后将样品转移至无菌培养皿中，使用灭菌的解剖刀去除根表皮和皮层。

使用洁净无绒的擦拭纸擦拭手术刀，然后将其浸入70%乙醇中，并在明火上进行灼烧灭菌。用手术刀刮擦韧皮部。

将样品切成小块，取30-100毫克样品分装至无菌的2毫升离心管中。将样品保存在-80摄氏度条件下，或立即用于提取DNA，该DNA将作为效应基因扩增及后续将效应基因克隆至诱饵载体的模板。从感染植株中提取植原体多特异性DNA后，按照文本方案将其克隆至诱饵载体，并检测其自激活活性和表达情况。

将转化了Streak plex A ATP 00189效应子的NMY51菌株划线接种至新鲜的SD-trp平板上，在30摄氏度培养两到三天，直至出现红色菌落。挑取琼脂平板上的一个红色菌落，接种于装有3毫升SD-trp培养基的小型摇瓶中，于30摄氏度、120-150转/分钟振荡条件下过夜培养。次日，取1毫升过夜培养物接种至装有20毫升SD-trp培养基的摇瓶中，继续振荡培养8小时。

使用 SD-trp 培养基将菌液浓度调节至 OD600 为 0.2，取十毫升该菌液接种于两个各装有 100 毫升 SD-trp 培养基的锥形瓶中。在 30 摄氏度条件下振荡培养过夜。随后，测定菌液的 OD600 并收集 120 OD600 单位的菌体沉淀。

例如，若测得 OD600 为 1.2，则离心 100 毫升样品，弃去上清液，加入 800 毫升预热的 2xYPAD 培养基重悬菌体，分装至两个摇瓶中，在 30 摄氏度条件下培养。将酵母培养物置于 30 摄氏度、120–150 转/分钟的摇床中孵育。根据文本所述方案，每隔约 1.5 小时测定一次 OD600，直至 OD600 达到 0.6。

按照文本方案制备鲑鱼精子DNA、醋酸锂（Te Lithium OAc）和聚乙二醇醋酸锂（PEG Lithium OAc）后，将800毫升酵母培养物在700 × g离心5分钟以沉淀细胞。弃去上清液，并将沉淀物重悬于总共200毫升无菌双蒸水中。再次离心收集细胞沉淀，并弃去上清液。

将沉淀物重悬于16毫升Te Lithium OAc混合液中，再次离心样品。弃去上清液后，用9.6毫升Te Lithium OAc重悬沉淀物。在合适大小的反应容器中，准备十二个样品管，每管中含有7微克峰值Add HAC DNA文库载体、100微升2%鲑精DNA和2.5毫升PEG Lithium OAc混合液。

向十二个离心管中每个加入 600 微升先前制备的酵母细胞悬液，并剧烈混匀一分钟。然后将反应体系置于 30 摄氏度水浴中孵育 45 分钟，每 15 分钟混匀一次。接着向每个离心管中加入 160 微升二甲基亚砜（DMSO），并剧烈混匀。

然后在42摄氏度下将小管额外孵育20分钟。离心收集细胞后，弃去上清液，并用3毫升2xYPAD培养基重悬每个沉淀。将全部十二个小管中的细胞合并至一个100毫升的摇瓶中，在30摄氏度、120转/分钟的条件下孵育酵母90分钟。

孵育结束后，离心收集细胞并弃去上清液，使用10毫升血清移液管和4.5毫升无菌0.9%氯化钠溶液，通过轻柔吹打充分重悬沉淀。取50微升悬液，用0.9%氯化钠溶液进行10倍系列稀释，稀释梯度从1:10至1:1000。然后取每种稀释液各100微升，接种于含有SD-trp-leu琼脂的90毫米培养皿中。

将剩余的未稀释酵母悬液涂布于含有SD-trp-leu-His-ade琼脂的16x150毫米直径培养皿中。将SD-trp-leu培养皿在30°C下孵育三天，SD-trp-leu-His-ade培养皿孵育四天。通过计数SD-trp-leu选择培养皿上不同梯度稀释液的菌落数量来确定转染效率。

使用无菌移液器吸头挑取单克隆，并将其划线接种至新鲜的 SD-trp-leu-his-ade 选择性平板上，每个克隆均需如此操作。将平板置于 30°C 培养 24 小时。每天重复传代操作，直至完成总共五次传代。

为分析克隆，在无菌操作台中，为每个克隆准备一个含有1毫升SD-trp-leu-his-ade的无菌2毫升反应管。用灼热的接种针在每根试管上打一个小孔，并用透气封膜覆盖小孔。用来自单个克隆的新鲜菌落材料接种每个试管，并在30°C、150转/分钟的条件下振荡培养24小时。

离心收集细胞并弃去上清液后，将沉淀物重悬于适当的缓冲液中，并转移至新的2毫升反应管中。向悬液中加入100微升经酸洗的玻璃珠，剧烈振荡混匀5分钟。最后，根据文本方案纯化质粒DNA。

本表和图提供了自激活实验预期结果及其解释的总结。弱自激活会导致酵母在 trp-leu-his 缺陷选择培养基上生长，但在 trp-leu-his-ade 缺陷选择培养基上不生长。而携带强自激活诱饵的酵母则能够在缺乏 trp-leu-his-ade 的培养基上生长。

成功的诱饵与猎物共转化表现为在缺乏色氨酸（trp）和亮氨酸（leu）的选择性平板上生长。诱饵蛋白与猎物蛋白的相互作用可导致NMY51菌株的组氨酸（his）和腺嘌呤（ade）营养缺陷型表型得到互补。图中展示的是酵母双杂交实验中诱饵与猎物之间相互作用的一个示例。苹果（Malus domestica）的宿主互作蛋白MdTCP24与MdTCP25被鉴定出来，并通过与效应因子进行从头圆环转化实验验证了其相互作用。

一旦掌握，如果所有必要的仪器和材料（尤其是酵母）均已提前准备妥当，酵母双杂交实验可在一天内完成。在进行该实验时，必须避免污染，并始终在无菌条件下操作。在完成本实验后，还需采用另一种独立的方法（例如双分子荧光互补实验）来验证所发现的蛋白质-蛋白质相互作用。

这一点尤为重要，因为酵母双杂交系统本身相对容易产生假阳性结果。该技术问世后，为许多不同研究领域的科研人员深入理解涉及蛋白质-蛋白质相互作用的分子机制铺平了道路，特别是在宿主-病原体相互作用以及其他众多生物学研究领域中。此外，您将了解到，在任何一个设备较为完善的分子生物学实验室中，开展这一方法都是切实可行的。

请务必注意，操作某些化学品、手术刀和明火可能具有极高危险性，因此在进行此操作时，必须始终采取必要的安全预防措施。这意味着要使用个人防护装备，如手套和护目镜，并使用实验室通用的安全设备。