Name: 从非耕种植物病原菌利用酵母双杂交筛选Unravelling一个细菌效应中的作用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: 了解利用酵母双杂交筛选技术鉴定苹果中细菌效应蛋白与宿主蛋白相互作用的方法。该方案为研究苹果增生病的分子机制提供了高效可靠的实验框架。

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感谢Laimburg研究中心的Christine Kerschbamer、Thomas Letschka、Sabine Oettl、Margot Raffeiner和Florian Senoner，以及Dualsystems Biotech AG的Mirelle Borges Dias Schnetzer提供的技术支持，感谢Julia Strobl对稿件的校对。本工作作为APPL2.0项目的一部分完成，并得到了意大利博尔扎诺自治省和南蒂罗尔苹果协会的部分资助。

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

在酵母双杂交（Y2H）筛选中，将潜在的效应蛋白与不同的假定相互作用蛋白共同表达（步骤7）。每个生长的酵母克隆均含有诱饵，但可能含有不同的相互作用蛋白。这些相互作用蛋白由克隆至猎物质粒中的cDNA文库编码。诱饵质粒和猎物质粒各自共转录编码酵母转录因子的一部分。当诱饵（效应蛋白）与猎物质粒编码的相互作用蛋白发生物理相互作用时，转录因子的两个部分（DNA结合域和激活域）得以结合，从而诱导报告基因的表达。酵母因此能够在缺乏组氨酸和腺嘌呤的SD选择培养基上生长。猎物cDNA文库的类型取决于被筛选的效应蛋白，需据此合理选择。猎物与诱饵载体以及酵母菌株之间必须相互兼容。本实验中采用LexA DNA结合域和Gal4激活域作为相容的酵母转录因子元件。cDNA文库可自行构建、定制或商业获取。cDNA猎物文库的制备不属于本实验方案的内容。本方案中使用的cDNA文库为基于中国台湾地区感染植原体的木本寄主植物RNA自行构建的均一化cDNA文库 Malus x domestica 叶片被使用并克隆至pGAD-HA中41将表达效应子（诱饵）的酵母菌株与猎物文库共转化，并在缺乏组氨酸和腺嘌呤的SD选择培养板上筛选克隆。为从酵母菌落中提取质粒DNA，建议使用基于柱式的细菌质粒小提试剂盒，并结合使用玻璃珠进行机械破碎以提高酵母细胞裂解效率（步骤8）。在此质粒纯化过程中，诱饵载体和猎物载体将同时被纯化，浓度相对较低。然而，所获得的质粒DNA量足以通过测序直接鉴定相互作用蛋白，无需预先扩增质粒（步骤8.4）。作为替代方案，步骤8.4中纯化的DNA可转入感受态 E. coli 并利用猎物载体介导的抗生素抗性进行筛选（例如， 氨苄青霉素（若使用pGAD-HA载体） E. coli 菌落仅携带 pGAD-HA 文库质粒，可利用这些克隆进行高产量质粒纯化。
成功转化pLexA-N和pGAD-HA载体可弥补NMY51菌株的色氨酸和亮氨酸营养缺陷型。效应子与一种蛋白质（由pGAD-HA编码）之间的相互作用会激活NMY51菌株中的报告系统。在自激活的情况下，将表达效应子的pLexA-N载体与空文库载体pGAD-HA共转化至NMY51中，会因NMY51报告系统的非预期激活而在缺乏trp-leu-his-ade的筛选培养基上生长40。自激活可能较弱，仅在缺乏trp-leu-his的条件下出现；也可能较强，表现为在trp-leu-his-ade平板上的明显生长41。自激活会在实际的酵母双杂交（Y2H）筛选中导致大量假阳性克隆背景。为避免此问题，必须对诱饵进行自激活检测，即将表达效应子的载体与空文库载体共转化。在此实验条件下，不应诱导报告基因的表达。若在检测中观察到自激活（即在选择性平板上出现生长），可在培养基中添加不同浓度的3-氨基-1,2,4-三唑45（3-AT）。3-AT是咪唑甘油磷酸脱水酶（HIS3）的抑制剂，而HIS3是组氨酸生物合成过程中的关键酶46。添加3-AT可减弱Y2H筛选中的弱自激活效应47,48。应测试不同浓度的3-AT，在本方案中使用了1–40 mM的3-AT。后续Y2H筛选应采用能够抑制自激活的最低3-AT浓度。自激活检测的选择性平板只有在共转化的SD-trp-leu平板上含有足够数量的克隆时方可评估。一般而言，每90 mm（直径）培养皿中不少于500个菌落即为充足。为准确测定转染效率，建议对共转化的酵母细胞进行系列稀释，并涂布于SD-trp-leu平板上。
为了降低自激活效应，可将效应子克隆至pLexA-C载体中，这是一种诱饵表达载体，可将LexA标签融合至目标蛋白的C末端。LexA标签的朝向可能减弱自激活效应24。然而，并非在所有情况下都能成功降低或消除自激活。出现红色或红褐色菌落表明可能存在微弱或假阳性相互作用。NMY51菌株中的ade2报告基因仅在发生蛋白-蛋白相互作用时被激活，从而阻止该酵母菌株中红色色素的积累40。在无相互作用的情况下，NMY51菌落呈红褐色，而携带强相互作用蛋白的菌落则为白色。因此，在筛选平板上观察菌落颜色可为进一步判断相应菌落是否为真阳性或假阳性相互作用提供重要依据。
最终需要根据诱饵蛋白的性质及相互作用特征，对某些检测条件进行调整或改变。目前，针对常见的酵母双杂交系统，已建立多种改进方法和衍生技术，可用于在不同宿主系统中分析较难处理的蛋白质相互作用。Stynen et al.49 的综述详细讨论并描述了酵母双杂交技术的不同方面、其改进与适应性优化，为如何选择合适的相互作用检测方法提供了有益的信息。
Y2H 筛选及其衍生技术已广泛应用于需要鉴定二元蛋白质相互作用的各个研究领域。即使进行了关键性对照实验，例如诱饵的自激活检测以及对鉴定出的相互作用蛋白进行一对一的重新转化验证，Y2H 仍容易产生假阳性或假阴性结果26,50,51。酵母作为模型系统并不适用于所有类型的相互作用研究。酵母细胞环境不一定能够支持所有蛋白质的正确翻译后修饰和正确折叠24。此外，在 Y2H 实验中，蛋白质处于过表达状态，其表达不受天然启动子调控。Y2H 将蛋白质相互作用伙伴强制定位至细胞核内，而该位置未必是其天然的亚细胞定位。因此，酵母系统可能无法真实反映蛋白质在原生细胞环境中的相互作用情况，从而导致假阴性或假阳性结果。大多数 Y2H 实验基于酵母营养缺陷型互补作为筛选原理。这种营养选择具有高灵敏度，但与其它检测方法（例如，显色报告基因检测）相比，选择性较低49。若某个效应子存在无法消除的自激活现象（见上文）或其他限制因素，则 Y2H 并非合适的检测手段25。表 1 和 图 1 展示了自激活测试的预期结果。真实相互作用的缺失（即 假阴性）可能由蛋白毒性、翻译后加工异常、相互作用的空间位阻、猎物文库中特定互作蛋白丰度过低、诱饵蛋白定位于膜结构，或缺乏相互作用所必需的辅助因子等原因引起24。
建议从 cDNA 中从头扩增已鉴定的相互作用蛋白的全长基因，将其亚克隆至 pGAD-HA 载体中，并将构建好的 pGAD-HA 质粒转化至表达诱饵蛋白的 NMY51 菌株，以进行一对一相互作用检测。这是必要的，因为猎物文库中发现的相互作用蛋白可能仅为完整蛋白的一个片段。然而，仅当存在充足的基因组和转录组序列数据时，才可获得相应全长基因的信息。此处所述自激活检测的转化方案同样适用于此类一对一检测，且诱饵蛋白与相互作用蛋白之间的相互作用必须可重复验证。
酵母双杂交筛选中鉴定出的相互作用必须始终通过另一种独立的技术加以验证。该独立技术应更接近实际蛋白质-蛋白质相互作用的天然环境。对于植原体效应子ATP_00189而言，其与TCP转录因子之间的相互作用 Malus x domestica 已验证 在植物体内 双分子荧光互补（BiFC）实验中 Nicotiana benthamiana 原生质体28 （非本实验方案内容）。效应蛋白ATP_00189来源于植物病原菌P. mali。 在植物体内 因此选择BiFC来验证ATP_00189与目标蛋白的相互作用 Malus x domestica 转录因子 此前在酵母双杂交（Y2H）中已鉴定28BiFC 是一种蛋白质-蛋白质相互作用检测方法，其报告系统无需相互作用的蛋白质发生向细胞核的亚细胞转位即可被激活52此外， 在植物体内 表达与修饰机制模拟了植物细菌效应子在其植物宿主中自然相互作用的环境。然而，使用BiFC进行全局筛选并不可行。
本方案中有多个步骤必须仔细处理。在扩增目的基因时（步骤4），必须排除引物与植物DNA发生结合的可能性，因此需以未感染植株的DNA作为阴性对照。目的基因序列中不得含有用于定向克隆的EcoRI和SalI限制性酶切位点；若序列中包含这些位点，则必须选择其他限制性内切酶进行克隆。酵母转化是本方案中的核心方法，其转染效率取决于酵母细胞的感受态、活力、生长状态以及转染试剂的质量53,54。建议在进行转化操作时，使用新鲜平板培养的酵母，平板存放时间不应超过两周（4 °C保存）。若使用陈旧琼脂平板上的菌落接种选择性液体培养基，常会导致转化后酵母生长延迟。此外，建议使用液体预培养物作为实际实验的接种物，而非直接从平板取用酵母。当将猎物质粒转入表达诱饵蛋白的酵母细胞时，若转染效率过低，可能导致某些猎物蛋白（潜在互作蛋白）在文库中丰度不足，从而影响整个筛选结果的代表性。在本方案中，酵母转染效率达到约150,000 cfu/µg转染DNA时，Y2H筛选效果良好。
了解酵母双杂交（Y2H）技术的缺陷与局限性，并以批判性和恰当的方式解读实验结果，对于得出正确结论至关重要。Y2H实验及其衍生技术已应用多年，针对不同诱饵蛋白的特性、相互作用的亚细胞定位、预期的结合伙伴以及其他可能影响相互作用的因素，该技术已历经诸多改进与优化（参见Y3H55,56,57）。近年来，已开发出基于阵列的Y2H筛选方法，可实现对大量诱饵蛋白与数百万猎物蛋白的自动化、高通量分析58。未来该技术的发展方向很可能是走向自动化和高通量，以促进不同研究领域中复杂信号通路和相互作用组的解析。

酵母双杂交筛选（Y2H）技术大约在27年前被开发出来1，并自此广泛应用于多个领域，以确定特定的蛋白质-蛋白质相互作用2,3,4,5,6,7,8,9,10,11。细菌效应子与宿主靶蛋白之间的物理相互作用通常是该靶蛋白功能被调控的前提条件。分析这类相互作用已成为感染生物学多个研究领域的重点12,13,14,15,16,17,18。Y2H筛选的基本原理是：两个蛋白质的相互作用导致功能性转录因子的重建，从而驱动报告基因的表达。已知的效应子（“诱饵”）在翻译水平上与转录因子的DNA结合域（DBD）融合，而潜在的相互作用蛋白（“猎物”）则与相应转录因子的激活域（AD）融合。由于相互作用的蛋白未知，需将一个潜在互作蛋白的文库克隆至所谓的“猎物文库”中。通常，该文库通过将cDNA克隆到适当的猎物载体表达质粒中构建而成，该质粒编码与诱饵载体所编码DBD相容的AD。当发生相互作用时，重建的转录因子将诱导报告基因的表达，这些基因通常可实现酵母的生长筛选。通过使用质粒特异性引物对猎物质粒进行测序，即可鉴定出相互作用蛋白。
细菌已进化出多种策略，以操控和利用宿主的代谢过程，或逃避宿主的防御机制，并通过不同的细菌分泌系统分泌效应分子19,20,21。因此，确定这些细菌效应分子的结合靶标是识别宿主中被操控通路的第一步，有助于更深入地理解特定的致病机制。
Y2H 筛选用于鉴定植原体病害过程中细菌效应子的相互作用，该方法通常是植原体研究中进一步表征分子致病机制的关键初步实验22,23。然而，大多数文献中对该方法的描述较为简略，且这些技术常被外包给生物技术公司。为了突出该方法的可行性，本实验方案提供了在自然宿主中鉴定细菌效应子分子相互作用伙伴的逐步操作指南。
尽管酵母双杂交（Y2H）筛选技术应用广泛且具有快速推进研究的优势，但必须注意的是，某些相互作用在酵母系统中可能无法发生。这是由于酵母细胞被用作一种 &#34;在体内 反应容器&#34; 存在一定的生物学局限性。多位作者已探讨了酵母双杂交技术及其衍生方法的优缺点。11,24,25,26,27需要考虑的一般因素包括，酵母细胞可能无法为所研究的特定蛋白质提供适当的基因表达、（翻译后）翻译或转运条件。这可能导致筛选中出现假阴性结果。相反，阳性相互作用可能是人为假象，在自然情况下可能并不发生。即， 在效应子与其合适宿主的情况下，必须利用更接近的生物系统中的独立相互作用实验，验证来自异源酵母表达系统的相互作用结果。
本研究鉴定了不可培养的植物病原体Candidatus Phytoplasma mali（P. mali）的效应子ATP_00189的结合伴侣。研究结果为苹果增生病症发生背后的分子机制提供了重要见解28，该病害在欧洲受感染的苹果种植区造成严重的经济损失29。

<table><tbody><tr><td>十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）</td><td>Applichem</td><td>A6284</td><td>用于 DNA 制备</td></tr><tr><td>三羟甲基氨基甲烷（Tris）</td><td>Applichem</td><td>A2264</td><td>用于培养基和缓冲液</td></tr><tr><td>氯化钠（NaCl）</td><td>Applichem</td><td>A2942</td><td>用于培养基和缓冲液</td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸二钠盐（NaEDTA）</td><td>Applichem</td><td>A2937</td><td>用于培养基和缓冲液</td></tr><tr><td>N-月桂酰基肌氨酸钠盐</td><td>Applichem</td><td>A7402</td><td>用于 DNA 提取</td></tr><tr><td>乙酸铵&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich（Fluka）</td><td>9688</td><td>用于 DNA 提取</td></tr><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>Applichem</td><td>A1108</td><td>用于 DNA 提取</td></tr><tr><td>异丙醇（2-丙醇）</td><td>Applichem</td><td>A3928</td><td>用于 DNA 提取</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Sigma-Aldrich（Fluka）</td><td>51976</td><td>用于 DNA 提取</td></tr><tr><td>RNA酶</td><td>Applichem</td><td>A2760</td><td>用于DNA制备</td></tr><tr><td>氯仿:异戊醇 24:1</td><td>Applichem</td><td>A1935</td><td>用于 DNA 提取</td></tr><tr><td>校读聚合酶（&lt;em&gt;例如&lt;/em&gt; iProof</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>203433</td><td>用于 PCR</td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>Thermo Scientific</td><td>ER0271</td><td>用于克隆</td></tr><tr><td>SalI</td><td>Thermo Scientific</td><td>ER0641</td><td>用于克隆</td></tr><tr><td>基于柱的DNA纯化试剂盒（&lt;em&gt;例如&lt;/em&gt; QIAquick</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>用于克隆</td></tr><tr><td>硫酸卡那霉素</td><td>Applichem</td><td>A1493</td><td>用于微生物学筛选</td></tr><tr><td>3-氨基-1,2,4-三唑（3-AT）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8056</td><td>用于自激活检测</td></tr><tr><td>L-精氨酸单盐酸盐&amp;nbsp;</td><td>Applichem</td><td>A3680</td><td>用于酵母培养</td></tr><tr><td>L-异亮氨酸&amp;nbsp;</td><td>Applichem</td><td>A3642</td><td>用于酵母培养</td></tr><tr><td>L-赖氨酸一水合物&amp;nbsp;</td><td>Applichem</td><td>A3448</td><td>用于酵母培养</td></tr><tr><td>L-甲硫氨酸&amp;nbsp;</td><td>Applichem</td><td>A3897</td><td>用于酵母培养</td></tr><tr><td>L-苯丙氨酸&amp;nbsp;</td><td>Applichem</td><td>A3464</td><td>用于酵母培养</td></tr><tr><td>L-苏氨酸&amp;nbsp;</td><td>Applichem</td><td>A3946</td><td>用于酵母培养</td></tr><tr><td>L-酪氨酸&amp;nbsp;</td><td>Applichem</td><td>A3401</td><td>用于酵母培养</td></tr><tr><td>L-尿嘧啶</td><td>Applichem</td><td>A0667</td><td>用于酵母培养</td></tr><tr><td>L-缬氨酸&amp;nbsp;</td><td>Applichem</td><td>A3406</td><td>用于酵母培养</td></tr><tr><td>L-腺嘌呤半硫酸盐&amp;nbsp;</td><td>Applichem</td><td>A1596</td><td>用于酵母培养</td></tr><tr><td>0.22 &amp;micro;m 微孔滤膜</td><td>赛多利斯</td><td>16541</td><td>用于无菌过滤</td></tr><tr><td>L-组氨酸单盐酸盐</td><td>Applichem</td><td>A3719</td><td>用于酵母培养</td></tr><tr><td>L-亮氨酸&amp;nbsp;</td><td>Applichem</td><td>A3496</td><td>用于酵母培养</td></tr><tr><td>L-色氨酸&amp;nbsp;</td><td>Applichem</td><td>A3410</td><td>用于酵母培养</td></tr><tr><td>酵母氮源基础培养基&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>51483</td><td>用于酵母培养</td></tr><tr><td>D-葡萄糖一水合物&amp;nbsp;</td><td>Applichem</td><td>A1349</td><td>用于酵母培养</td></tr><tr><td>琼脂</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2641-1</td><td>用于酵母和细菌培养</td></tr><tr><td>蛋白胨</td><td>Applichem</td><td>A2208</td><td>用于酵母培养</td></tr><tr><td>聚乙二醇 4000（PEG）</td><td>Applichem</td><td>A1249</td><td>用于酵母转化</td></tr><tr><td>乙酸锂二水合物（LiOAc）</td><td>Applichem</td><td>A3478</td><td>用于酵母转化</td></tr><tr><td>鲑鱼精子DNA&amp;nbsp;</td><td>Applichem</td><td>A2159</td><td>用于酵母转化</td></tr><tr><td>Lex-A 标签抗体（&lt;em&gt;例如&lt;/em&gt; 抗LexA DNA结合区</td><td>Millipore</td><td>06-719</td><td>用于蛋白质印迹检测</td></tr><tr><td>质粒小提试剂盒（&lt;em&gt;例如&lt;/em&gt; GenElute 质粒小提试剂盒</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PLN350</td><td>用于从酵母和细菌中进行质粒纯化</td></tr><tr><td>酸洗玻璃珠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8772</td><td>用于从酵母中进行质粒纯化</td></tr><tr><td>氨苄青霉素钠盐</td><td>Applichem</td><td>A0839</td><td>用于微生物学筛选</td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>Applichem</td><td>A1552</td><td>用于酵母培养</td></tr><tr><td>真空浓缩离心机&lt;em&gt;例如&lt;/em&gt; 浓缩仪 5301</td><td>Eppendorf</td><td>Z368245 (Sigma)</td><td>用于 DNA 提取</td></tr><tr><td>诱饵载体（&lt;em&gt;例如&lt;/em&gt; pLexA-N</td><td>Dualsystems</td><td>P01004</td><td>用于酵母双杂交实验</td></tr><tr><td>猎物载体（&lt;em&gt;例如&lt;/em&gt; pGAD-HA</td><td>Dualsystems</td><td>P01004</td><td>用于酵母双杂交实验</td></tr><tr><td>对照猎物载体&lt;em&gt;例如&lt;/em&gt; pLexA-p53</td><td>Dualsystems</td><td>P01004</td><td>用于酵母双杂交实验</td></tr><tr><td>对照诱饵载体（&lt;em&gt;例如&lt;/em&gt; pACT-largeT</td><td>Dualsystems</td><td>P01004</td><td>用于酵母双杂交实验</td></tr><tr><td>电转感受态 &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; (&lt;em&gt;例如&lt;/em&gt; MegaX DH10B T1R 电转感受态细胞</td><td>Invitrogen</td><td>C640003</td><td>用于克隆</td></tr><tr><td>酵母报告菌株（NMY51：MATa his3）&amp;Delta;200 trp1-901 leu2-3,112 ade2 LYS2::(lexAop)4-HIS3 ura3::(lexAop)8-lacZ ade2::(lexAop)8-ADE2 GAL4 &lt;em&gt;例如&lt;/em&gt; NMY51</td><td>Dualsystems</td><td>P01004</td><td>用于酵母双杂交实验</td></tr><tr><td>塑料石蜡膜（&lt;em&gt;例如&lt;/em&gt; Parafilm M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7793-1EA</td><td>用于酵母和细菌培养</td></tr><tr><td>透气封膜&lt;em&gt;例如&lt;/em&gt; BREATHseal</td><td>格赖纳</td><td>676 051</td><td>用于酵母培养</td></tr><tr><td>PCR 扩增仪&lt;em&gt;例如&lt;/em&gt; T100 Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad</td><td>1861096</td><td>用于 PCR</td></tr><tr><td>定量PCR仪&lt;em&gt;例如&lt;/em&gt; CFX96 Touch 实时荧光定量 PCR 检测系统</td><td>Bio-Rad</td><td>1855195</td><td>用于定量 PCR</td></tr><tr><td>微型离心机（&lt;em&gt;例如&lt;/em&gt; Centrifuge 5417 R</td><td>Eppendorf</td><td>5417 R</td><td>通用实验设备</td></tr><tr><td>离心机&lt;em&gt;例如&lt;/em&gt; Centrifuge 5804 R</td><td>Eppendorf</td><td>5804 R</td><td>通用实验设备</td></tr><tr><td>无核酸酶水（DNA酶-free，RNA酶-free，蛋白酶-free）</td><td>5端</td><td>2500010</td><td>用于 PCR 和 DNA 操作</td></tr><tr><td>刀片</td><td>Swann-Morton</td><td>0301</td><td>用于 DNA 提取</td></tr><tr><td>无菌滤器（0.22 &amp;micro;m；聚醚砜</td><td>VWR-International</td><td>514-0073（欧洲目录编号）</td><td>用于酵母和细菌培养</td></tr><tr><td>培养皿 &amp;Oslash; 90 mm&amp;nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>633180</td><td>用于酵母和细菌培养</td></tr><tr><td>培养皿 &amp;Oslash; 150 mm&amp;nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>639161</td><td>用于酵母培养</td></tr><tr><td>分光光度计（&lt;em&gt;例如&lt;/em&gt; BioPhotometer</td><td>Eppendorf</td><td>550507804</td><td>用于酵母培养</td></tr><tr><td>分光光度计比色皿</td><td>JoVE</td><td>759015</td><td>用于酵母培养</td></tr><tr><td>水浴锅（&lt;em&gt;例如&lt;/em&gt; 水浴锅 Memmert WB7</td><td>Memmert</td><td>WB7</td><td>用于酵母转化</td></tr><tr><td>Western Blot 仪器设备</td><td>Bio-Rad</td><td>多样的</td><td>用于蛋白质检测</td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>5端</td><td>2201210</td><td>用于克隆</td></tr><tr><td>锥形瓶（100 mL；1,000 mL；2,000 mL）及透气棉塞&lt;em&gt;例如&lt;/em&gt; 杜伦氏锥形瓶（Erlenmeyer 窄口烧瓶）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z232793, Z232858, Z232866</td><td>用于酵母和细菌培养</td></tr><tr><td>摇床培养箱&lt;em&gt;例如&lt;/em&gt; GFL 3031</td><td>GFL</td><td>3031</td><td>用于酵母和细菌培养</td></tr><tr><td>培养箱</td><td>结合蛋白</td><td>KB 53（E3.1）</td><td>用于酵母和细菌培养</td></tr><tr><td>制冰机（&lt;em&gt;例如&lt;/em&gt; 冰机 IF 825</td><td>Omniwash</td><td>IF 825</td><td>通用实验设备</td></tr><tr><td>0.2 mL、1.5 mL 和 2.0 mL 反应管（聚丙烯）</td><td>Eppendorf</td><td>0030.124.332（0.2 ml）；0030.123.328（1.5 ml）；0030.123.344（2.0 ml）</td><td>通用实验设备</td></tr><tr><td>移液器和一次性移液器吸头（不同体积：10 - 1,000） &amp;micro;L)</td><td>Eppendorf</td><td>多样的</td><td>通用实验设备</td></tr><tr><td>传播者</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SPR-L-S01</td><td>用于酵母和细菌培养</td></tr><tr><td>涡旋振荡器（&lt;em&gt;例如&lt;/em&gt; MS 3 Minishaker</td><td>IKA</td><td>3617000</td><td>通用实验设备</td></tr><tr><td>T4连接酶</td><td>Thermo Fisher</td><td>EL0011</td><td>用于克隆</td></tr><tr><td>冰箱（4 &amp;deg;C) (&lt;em&gt;例如&lt;/em&gt; Liebherr Medline FKEX 5000</td><td>Liebherr</td><td>81.767.580.4</td><td>通用实验设备</td></tr><tr><td>冷冻柜（-20 &amp;deg;C) (&lt;em&gt;例如&lt;/em&gt; Liebherr Comfort Professional G5216</td><td>Liebherr</td><td>G5216</td><td>通用实验设备</td></tr><tr><td>量筒（&lt;em&gt;例如&lt;/em&gt; 品牌</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z327352；Z327417；Z327441&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>通用实验设备</td></tr><tr><td>血清移液管&lt;em&gt;例如&lt;/em&gt; Fisherbrand</td><td>Thermo Fisher</td><td>S55701</td><td>用于酵母和细菌培养</td></tr><tr><td>移液器（机械式）&lt;em&gt;例如&lt;/em&gt; Pipetboy acu 2</td><td>Integra-Biosciences</td><td>155000</td><td>通用实验设备</td></tr><tr><td>电穿孔比色皿（1 mm）</td><td>分子生物产品</td><td>5510-11</td><td>用于细菌转化</td></tr><tr><td>电穿孔仪（&lt;em&gt;例如&lt;/em&gt; Eporator</td><td>Eppendorf</td><td>4309000019</td><td>用于细菌转化</td></tr><tr><td>凝胶与印迹成像系统（&lt;em&gt;例如&lt;/em&gt; ChemiDoc MP 系统</td><td>Bio-Rad</td><td>1708280</td><td>通用实验设备</td></tr><tr><td>锥形离心管（聚丙烯）（50 mL）</td><td>VWR-International&amp;nbsp;</td><td>525-0403（欧洲目录编号）</td><td>通用实验设备</td></tr><tr><td>锥形离心管（聚丙烯）（13 mL）</td><td>BD Falcon</td><td>352096</td><td>通用实验设备</td></tr><tr><td>二硫苏糖醇（DTT；1 M）</td><td>Thermo Scientific</td><td>P2325</td><td>用于连接</td></tr><tr><td>三磷酸腺苷（ATP， &lt;em&gt;例如&lt;/em&gt; ATP溶液（10 mM）</td><td>Ambion&amp;nbsp;</td><td>AM8110G（由 Thermo Scientific 分销）</td><td>用于连接</td></tr><tr><td>不含组氨酸、亮氨酸、色氨酸和腺嘌呤的脱落混合物（DO, &lt;em&gt;例如&lt;/em&gt; 酵母合成缺陷型培养基补充剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y2021 Sigma&amp;nbsp;</td><td>用于酵母培养（现成混合液）</td></tr></tbody></table>

利用酵母双杂交筛选解析不可培养植物病原菌效应子的功能

Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen

揭示疾病表型的分子机制对于理解植物科学中的病理过程和症状发展至关重要。细菌已进化出多种策略，以操控其宿主的代谢过程，从而利于自身生存。这种细菌介导的操控通常伴随着严重症状的出现，甚至导致受感染植物的死亡。确定负责操控宿主的特定细菌分子已成为微生物学研究的重要领域。在鉴定出这些被称为“效应子”（effectors）的细菌分子后，阐明其功能显得尤为关键。确定效应子功能的一种直接方法是通过酵母双杂交（Y2H）筛选，鉴定其在天然宿主中的蛋白质结合伴侣。通常情况下，宿主含有大量潜在的结合伴侣，而这些伴侣无法通过任何in silico算法充分预测。因此，最理想的方法是利用假设的效应子对表达宿主蛋白的完整文库进行筛选。当病原体为难以培养的生物（如植原体）时，这一过程尤为具有挑战性。本实验方案提供了从植原体感染的木本宿主植物中提取DNA、扩增潜在效应子基因，以及随后通过Y2H筛选鉴定植物分子互作伴侣的逐步操作指南。尽管Y2H筛选技术已被广泛使用，但目前存在将其外包给提供有偿Y2H服务的生物技术公司的趋势。本方案旨在指导如何在任何具备基本条件的分子生物学实验室中，利用常规实验技术自主完成Y2H筛选。

在进行实际的酵母双杂交筛选之前，必须先检测诱饵蛋白是否存在自激活作用。这一步通过将诱饵表达载体与空的猎物文库载体共同转化酵母细胞，并检测其在选择性培养板上的生长情况来实现。
为了分析植原体蛋白ATP_00189是否具有自激活能力，按照第5节所述进行自激活检测。诱饵质粒可互补S. cerevisiae NMY51的色氨酸（trp）营养缺陷型，而猎物质粒可互补其亮氨酸（leu）营养缺陷型40。因此，成功的共转化表现为酵母在缺乏色氨酸和亮氨酸的筛选平板上生长。若诱饵蛋白与猎物蛋白之间发生相互作用，则可实现对NMY51组氨酸（his）和腺嘌呤（ade）营养缺陷型的互补。如果诱饵蛋白在无相互作用的情况下出现自激活，则酵母可在缺乏组氨酸和腺嘌呤的筛选平板上生长。自激活可分为强自激活和弱自激活两种情况：强自激活表现为共转化酵母在缺乏trp、leu、his和ade的筛选平板上生长；弱自激活则表现为酵母在缺乏trp、leu和his的平板上生长，但在缺乏trp、leu、his和ade的平板上不生长。适当的阳性对照对于正确解读自激活实验结果至关重要。自激活实验的预期结果及其解释总结于表1，并展示于图1中。
<img alt="酵母双杂交实验结果；培养基平板上的生长模式表明蛋白质相互作用。" src="/files/ftp_upload/55150/55150fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1： 在进行酵母双杂交筛选前诱饵自激活检测的示例. S. cerevisiae 将NMY51与相互作用的诱饵质粒（pLEX-p53）和猎物质粒（pACT-largeT）共转化作为阳性对照（左侧面板：a-c），一个微弱自激活的诱饵载体和一个空的猎物文库载体（中图：d-f）以及一个非自激活的诱饵与空猎物文库载体（右侧面板：g-i）。共转化的酵母在缺乏色氨酸和亮氨酸的SD平板上培养（上图：a，d，g）、trp、leu 和 his（中间面板：b，e，h）以及 trp、leu、his 和 ade（下图：c，f，i）。在缺乏色氨酸（trp）和亮氨酸（leu）的培养基上筛选是共转化成功的阳性对照，因为诱饵载体可弥补NMY51菌株的色氨酸营养缺陷，而猎物载体可弥补其亮氨酸营养缺陷（在SD-trp-leu培养基上生长）。当诱饵与猎物之间存在相互作用，或诱饵发生自激活时，NMY51的报告基因表达被激活，从而弥补组氨酸（his）和腺嘌呤（ade）的营养缺陷（在SD-trp-leu-his-ade培养基上生长）。弱自激活表现为在SD-trp-leu-his培养基上生长中图，d-f）。在进行酵母双杂交筛选前，必须先减弱诱饵蛋白的弱自激活作用， 例如 通过向选择性培养基中添加3-AT实现。氨基酸缺失在相应培养基名称中以“-”表示。 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55150/55150fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>pLexA-N-atp00189</td>
			<td>无</td>
			<td>菌落</td>
			<td>无生长</td>
			<td>无生长</td>
			<td>无生长</td>
			<td>无生长</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>无</td>
			<td>pGAD-HA</td>
			<td>无生长</td>
			<td>菌落</td>
			<td>无生长</td>
			<td>无生长</td>
			<td>无生长</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLexA-N</td>
			<td>无</td>
			<td>菌落</td>
			<td>无生长</td>
			<td>无生长</td>
			<td>无生长</td>
			<td>无生长</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLexA-N</td>
			<td>pGAD-HA</td>
			<td>菌落</td>
			<td>菌落</td>
			<td>菌落</td>
			<td>无生长</td>
			<td>无生长</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLexA-p53</td>
			<td>pACT-largeT</td>
			<td>菌落</td>
			<td>菌落</td>
			<td>菌落</td>
			<td>菌落</td>
			<td>菌落</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLexA-N-atp00189</td>
			<td>pGAD-HA</td>
			<td>菌落</td>
			<td>菌落</td>
			<td>菌落</td>
			<td>无生长</td>
			<td>无生长</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：诱饵自激活实验的预期结果。 将不同特性的诱饵和猎物共转化至S. cerevisiae NMY51菌株后，在选择性培养基上表现出差异性生长。在30 °C下培养72小时后，评估不同载体组合（a-f）转化后的生长情况。弱自激活表现为酵母在SD-trp-leu-his培养基上生长，强自激活则表现为在无互作伙伴存在时，酵母在SD-trp-leu-his-ade选择性培养基上生长。由pLexA-N编码的植原体效应子ATP_00189不表现出自激活特性，即当诱饵载体转化NMY51后，在缺乏组氨酸和腺嘌呤的条件下无法生长。
根据诱饵的不同，酵母双杂交筛选可能获得大量在选择性平板上生长的酵母克隆。所有克隆都必须进行分析，并检查是否存在可能的冗余。即使使用了均一化的cDNA文库，一个互作蛋白仍很可能在多个不同的克隆中出现。根据文库构建的克隆技术，某些猎物载体中可能仅插入了完整基因的部分片段。因此，建议从cDNA出发重新扩增（de novo）并亚克隆互作蛋白的全长基因，并在一对一酵母双杂交分析中验证该相互作用（图2）。
<img alt="酵母双杂交实验结果。BD-ATP_00189 与 AD-MdTCP 蛋白的相互作用。" src="/files/ftp_upload/55150/55150fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
图2： 酵母双杂交实验中诱饵与猎物相互作用的示例 酵母双杂交（Y2H）筛选实验完成后，提取阳性互作克隆中的质粒。对捕获载体进行测序，并对 Malus x domestica 鉴定出与宿主相互作用的蛋白伙伴MdTCP24和MdTCP25。作为阴性对照，同时对酵母双杂交文库筛选中未发现互作蛋白的MdTCP34进行亚克隆。从苹果cDNA中扩增获得全长基因，亚克隆至捕食载体（共顺反子表达激活结构域AD）中 从头合成 与表达细菌效应子ATP_00189与DNA结合域（BD）融合的诱饵载体共转化。该图来自 28. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55150/55150fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

细菌效应蛋白对于成功建立感染至关重要。本实验方案描述了在细菌效应蛋白的天然植物宿主中，鉴定其蛋白质类结合伴侣的方法。鉴定这些效应蛋白的相互作用 通过 酵母双杂交筛选已成为揭示分子致病策略的重要工具。

揭示疾病表型的分子机制对于理解植物科学中的病理过程和症状发展至关重要。细菌已进化出多种策略，以操纵其宿主的代谢过程，从而利于自身生存。这种细菌介导的宿主操控通常伴随着严重症状的出现或受感染植物的死亡。确定负责宿主操控的特定细菌分子已成为微生物学研究的重要领域。在鉴定出这些被称为“效应子（effectors）”的细菌分子后，阐明其功能显得尤为关键。确定效应子功能的一种直接方法是通过酵母双杂交（Y2H）筛选，鉴定其在天然宿主中的蛋白质结合伴侣。通常情况下，宿主中含有大量潜在的结合伴侣，而这些互作关系无法通过任何计算机算法充分预测。因此，最佳策略是利用假定的效应子对表达宿主蛋白的完整文库进行筛选。当病原体为难以培养的生物（如植原体）时，这一过程尤为具有挑战性。本实验方案提供了从植原体感染的木本宿主植物中提取DNA、扩增潜在效应子基因，以及随后通过酵母双杂交筛选鉴定植物中分子互作伴侣的逐步操作指南。尽管酵母双杂交筛选技术已被广泛应用，但目前存在将其外包给提供Y2H服务的生物技术公司的趋势。本方案旨在指导如何在配备基本设备的分子生物学实验室中，利用常规实验技术自主完成酵母双杂交实验。

本实验的总体目标是通过鉴定一种‘候选属植物菌原体致病蛋白’与苹果（Malus domestica）宿主蛋白之间的相互作用，揭示病原体的致病策略及宿主与病原体之间的互作系统。该方法可用于解答多个不同生物学研究领域的关键科学问题，本文中将其应用于植物研究，以阐明苹果增生病发生发展的分子机制。该技术的主要优势在于，可针对单一病原效应蛋白同时筛选数千种潜在的互作蛋白，使该方法成为感染机制研究中简便可行的起点。首先，识别具有苹果增生病特异性症状的感病植株，以及无症状的健康对照植株。使用洁净的修枝剪，从根系三个不同部位截取根样，根样直径为 0.5–1 cm，长度约 5 cm。将根样放入标记清楚的塑料袋中。然后将样品放入装有预冷冰袋的冷藏箱中，并在4 °C下保存直至进一步处理。用清水冲洗根部样品以去除土壤。随后将样品转移至无菌培养皿中，使用灭菌的解剖刀去除根表皮和皮层。使用洁净无绒的擦拭纸擦拭手术刀，然后将其浸入70%乙醇中，并在明火上进行灼烧灭菌。用手术刀刮擦韧皮部。将样品切成小块，取30-100毫克样品分装至无菌的2毫升离心管中。将样品保存在-80摄氏度条件下，或立即用于提取DNA，该DNA将作为效应基因扩增及后续将效应基因克隆至诱饵载体的模板。从感染植株中提取植原体多特异性DNA后，按照文本方案将其克隆至诱饵载体，并检测其自激活活性和表达情况。将转化了Streak plex A ATP 00189效应子的NMY51菌株划线接种至新鲜的SD-trp平板上，在30摄氏度培养两到三天，直至出现红色菌落。挑取琼脂平板上的一个红色菌落，接种于装有3毫升SD-trp培养基的小型摇瓶中，于30摄氏度、120-150转/分钟振荡条件下过夜培养。次日，取1毫升过夜培养物接种至装有20毫升SD-trp培养基的摇瓶中，继续振荡培养8小时。使用 SD-trp 培养基将菌液浓度调节至 OD600 为 0.2，取十毫升该菌液接种于两个各装有 100 毫升 SD-trp 培养基的锥形瓶中。在 30 摄氏度条件下振荡培养过夜。随后，测定菌液的 OD600 并收集 120 OD600 单位的菌体沉淀。例如，若测得 OD600 为 1.2，则离心 100 毫升样品，弃去上清液，加入 800 毫升预热的 2xYPAD 培养基重悬菌体，分装至两个摇瓶中，在 30 摄氏度条件下培养。将酵母培养物置于 30 摄氏度、120–150 转/分钟的摇床中孵育。根据文本所述方案，每隔约 1.5 小时测定一次 OD600，直至 OD600 达到 0.6。按照文本方案制备鲑鱼精子DNA、醋酸锂（Te Lithium OAc）和聚乙二醇醋酸锂（PEG Lithium OAc）后，将800毫升酵母培养物在700 × g离心5分钟以沉淀细胞。弃去上清液，并将沉淀物重悬于总共200毫升无菌双蒸水中。再次离心收集细胞沉淀，并弃去上清液。将沉淀物重悬于16毫升Te Lithium OAc混合液中，再次离心样品。弃去上清液后，用9.6毫升Te Lithium OAc重悬沉淀物。在合适大小的反应容器中，准备十二个样品管，每管中含有7微克峰值Add HAC DNA文库载体、100微升2%鲑精DNA和2.5毫升PEG Lithium OAc混合液。向十二个离心管中每个加入 600 微升先前制备的酵母细胞悬液，并剧烈混匀一分钟。然后将反应体系置于 30 摄氏度水浴中孵育 45 分钟，每 15 分钟混匀一次。接着向每个离心管中加入 160 微升二甲基亚砜（DMSO），并剧烈混匀。然后在42摄氏度下将小管额外孵育20分钟。离心收集细胞后，弃去上清液，并用3毫升2xYPAD培养基重悬每个沉淀。将全部十二个小管中的细胞合并至一个100毫升的摇瓶中，在30摄氏度、120转/分钟的条件下孵育酵母90分钟。孵育结束后，离心收集细胞并弃去上清液，使用10毫升血清移液管和4.5毫升无菌0.9%氯化钠溶液，通过轻柔吹打充分重悬沉淀。取50微升悬液，用0.9%氯化钠溶液进行10倍系列稀释，稀释梯度从1:10至1:1000。然后取每种稀释液各100微升，接种于含有SD-trp-leu琼脂的90毫米培养皿中。将剩余的未稀释酵母悬液涂布于含有SD-trp-leu-His-ade琼脂的16x150毫米直径培养皿中。将SD-trp-leu培养皿在30°C下孵育三天，SD-trp-leu-His-ade培养皿孵育四天。通过计数SD-trp-leu选择培养皿上不同梯度稀释液的菌落数量来确定转染效率。使用无菌移液器吸头挑取单克隆，并将其划线接种至新鲜的 SD-trp-leu-his-ade 选择性平板上，每个克隆均需如此操作。将平板置于 30°C 培养 24 小时。每天重复传代操作，直至完成总共五次传代。为分析克隆，在无菌操作台中，为每个克隆准备一个含有1毫升SD-trp-leu-his-ade的无菌2毫升反应管。用灼热的接种针在每根试管上打一个小孔，并用透气封膜覆盖小孔。用来自单个克隆的新鲜菌落材料接种每个试管，并在30°C、150转/分钟的条件下振荡培养24小时。离心收集细胞并弃去上清液后，将沉淀物重悬于适当的缓冲液中，并转移至新的2毫升反应管中。向悬液中加入100微升经酸洗的玻璃珠，剧烈振荡混匀5分钟。最后，根据文本方案纯化质粒DNA。本表和图提供了自激活实验预期结果及其解释的总结。弱自激活会导致酵母在 trp-leu-his 缺陷选择培养基上生长，但在 trp-leu-his-ade 缺陷选择培养基上不生长。而携带强自激活诱饵的酵母则能够在缺乏 trp-leu-his-ade 的培养基上生长。成功的诱饵与猎物共转化表现为在缺乏色氨酸（trp）和亮氨酸（leu）的选择性平板上生长。诱饵蛋白与猎物蛋白的相互作用可导致NMY51菌株的组氨酸（his）和腺嘌呤（ade）营养缺陷型表型得到互补。图中展示的是酵母双杂交实验中诱饵与猎物之间相互作用的一个示例。苹果（Malus domestica）的宿主互作蛋白MdTCP24与MdTCP25被鉴定出来，并通过与效应因子进行从头圆环转化实验验证了其相互作用。一旦掌握，如果所有必要的仪器和材料（尤其是酵母）均已提前准备妥当，酵母双杂交实验可在一天内完成。在进行该实验时，必须避免污染，并始终在无菌条件下操作。在完成本实验后，还需采用另一种独立的方法（例如双分子荧光互补实验）来验证所发现的蛋白质-蛋白质相互作用。这一点尤为重要，因为酵母双杂交系统本身相对容易产生假阳性结果。该技术问世后，为许多不同研究领域的科研人员深入理解涉及蛋白质-蛋白质相互作用的分子机制铺平了道路，特别是在宿主-病原体相互作用以及其他众多生物学研究领域中。此外，您将了解到，在任何一个设备较为完善的分子生物学实验室中，开展这一方法都是切实可行的。请务必注意，操作某些化学品、手术刀和明火可能具有极高危险性，因此在进行此操作时，必须始终采取必要的安全预防措施。这意味着要使用个人防护装备，如手套和护目镜，并使用实验室通用的安全设备。

unravelling-function-bacterial-effector-from-non-cultivable-plant

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

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在本视频中，我们介绍了一种在酵母中表达细菌III型效应子并鉴定效应子诱导的生长抑制表型的方法。此类表型可进一步用于阐明效应子的功能及其作用靶点。...

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本文所述方法用于在特定步骤诱导凋亡信号级联反应，以解析抗凋亡细菌效应蛋白的活性。该方法也可用于诱导表达促凋亡或毒性蛋白，或用于研究对其他信号通路的干扰作用。...

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