从非耕种植物病原菌利用酵母双杂交筛选Unravelling一个细菌效应中的作用

细菌效应蛋白是用于建立成功的感染很重要的。这个协议描述在其天然植物宿主细菌效应蛋白的蛋白质结合配偶的实验鉴定。识别通过酵母双杂交屏幕这些效应的相互作用已成为解开分子致病性策略的一个重要工具。

该程序的总体目标是通过鉴定念珠菌植原体malefactor蛋白与来自malus domestica的宿主蛋白的相互作用来解开毒力策略和宿主病原体系统。这种方法可以帮助回答许多不同生物学研究领域的关键问题，并用于植物研究以阐明苹果增殖病发展的分子机制。该技术的主要优点是可以针对数千个潜在的相互作用子筛选单个病原体效应子，使该方法成为感染研究中容易可行的起点。

首先，识别具有苹果增殖特异性症状的受感染树木，并控制无症状的树木。使用干净的修枝剪，从根系的三个不同部位切下直径为 0.5 1 厘米、长度约为 5 厘米的根样本。将根样品放入贴有适当标签的塑料袋中。

然后将样品放入装有冷藏热袋的冷藏箱中，并储存在 4 摄氏度下直至进一步处理。用水冲洗根部样品以去除污垢。然后将样品转移到无菌培养皿中，并使用消毒的手术刀去除根表皮和皮质。

用干净、不起毛的纸巾擦拭手术刀。然后将仪器浸入 70% 乙醇中，并在明火上加热消毒。用手术刀刮擦韧皮部。

将样品切成小块，将 30-100 毫克小块分装到无菌的 2 毫升反应管中。将样品储存在 80 摄氏度或立即使用它们来分离 DNA，DNA 用作效应基因扩增和随后将效应基因克隆到诱饵载体中的模板。从受感染的树木中分离出植原体多特异性 DNA 后，克隆到诱饵载体中，并根据文本方案测试其自我激活和表达。

Streak plex A ATP 00189 效应子将 NMY51 转化到新鲜的 SD-trp 板上，并在 30 摄氏度下培养 2 至 3 天，直到出现红色菌落。使用琼脂平板上的红色菌落在小摇瓶中接种 3 毫升 SD-trp 培养基，并在 30 摄氏度下以每分钟 120-150 转的速度振荡孵育培养物过夜。第二天，用 1 毫升过夜培养物，在摇瓶中接种 20 毫升 SD-trp，并让它生长 8 小时。

使用 SD-trp 培养基将培养物调节至 OD 600 为 0.2，并用 10 毫升培养物接种两个装有 100 毫升 SD-trp 培养基的烧瓶。将培养物在 30 摄氏度下振荡孵育过夜。接下来，测量培养物的 OD 600 并沉淀 120 个 OD 600 单位。

例如，如果测得 OD 600 为 1.2，则离心 100 毫升样品，弃去上清液，并使用 800 毫升预热的 2xYPAD 将沉淀重悬到两个摇瓶中，并在 30 摄氏度下孵育。在 30 摄氏度和每分钟 120-150 转下孵育酵母培养物。根据文本方案，大约每 1.5 小时测量一次 OD 600 直到达到 OD 600 为 0.6。

根据文本方案制备鲑鱼精子 DNA、Te Lithium OAc 和 PEG Lithium OAc 后，将 800 毫升酵母培养物以 700 x G 离心 5 分钟以沉淀细胞。去除上清液，将沉淀重悬于总共 200 毫升无菌双蒸水中。然后再次沉淀细胞并弃去上清液。

沉淀重悬于 16 ml Te Lithium OAc 混合物中，然后再次离心样品。然后在弃去上清液后，使用 9.6 毫升 Te Lithium OAc 重悬沉淀。在适当大小的反应容器中，制备 12 个小瓶，其中含有 7 μg 峰添加 HAC DNA 文库载体、100 μL 2% 鲑鱼精子 DNA 和 2.5 mL PEG 锂 OAc 混合物。

将 600 微升先前制备的酵母细胞悬液添加到 12 个小瓶中，并剧烈混合 1 分钟。然后将反应物在 30 摄氏度的水浴中孵育 45 分钟，每 15 分钟混合一次。接下来，向每个小瓶中加入 160 μL DMSO 并剧烈混合。

然后将样品瓶在 42 摄氏度下再孵育 20 分钟。沉淀细胞后，弃去上清液，并使用 3 毫升 2xYPAD 重悬每个沉淀。将所有 12 个样品瓶中的细胞混合在一个 100 毫升摇瓶中，并在 30 摄氏度下孵育酵母 90 分钟，每分钟旋转 120 次。

孵育后，在沉淀细胞并弃去上清液后，使用 10 毫升血清移液管和 4.5 毫升无菌 0.9% 氯化钠，小心地上下吹打，彻底重悬沉淀。取出 50 μL 混悬液，使用 0.9% 氯化钠制备 10 倍稀释液，比例为 1：10 至 1：1000。然后将每种稀释液的 100 微升接种在含有 SD-trp-leu 琼脂的 90 毫米培养皿上。

剩余的未稀释的酵母悬浮液涂在直径为 16x150 毫米的培养皿上，加入 SD-trp-leu-His-ade 琼脂。对于 SD-trp-leu 板，将板在 30 摄氏度下孵育 3 天，对于 SD-trp-leu-his-ade 板，将板孵育 4 天。通过在 SD-trp-leu 选择板上计数不同系列稀释液的克隆来确定转染效率。

使用无菌移液器吸头将菌落挑出并划线到新鲜的 SD-trp-leu-his-ade 选择性板上，转移每个克隆。将板在 30 摄氏度下孵育 24 小时。每天重复克隆转移，直到达到总共五代。

为了分析克隆，在无菌罩下，为每个克隆准备一个无菌的 2 毫升反应管，其中含有 1 毫升 SD-trp-leu-his-ade。用热针在每根管子上打一个孔，然后使用透气密封剂盖住孔。用来自一个克隆的新鲜菌落材料接种每个样品瓶，并在 30 摄氏度和每分钟 150 转下孵育样品瓶 24 小时。

沉淀细胞并弃去上清液后，将沉淀重悬于适当的缓冲液中，并将其转移到新的 2 mL 反应管中。向悬浮液中加入 100 微升酸洗玻璃珠，并剧烈混合试管 5 分钟。最后，根据文本方案纯化质粒 DNA。

本表格和图总结了自激活测定的预期结果及其解释。弱的自我激活导致在 trp-leu-his 上生长，但不在 trp-leu-his-ade 耗尽的选择板上生长。而用强效自激活诱饵转化的酵母会在缺乏培养基的 trp-leu-his-ade 上生长。

诱饵和猎物的成功共转化的特征是在缺乏 trp 和 leu 的选择性平板上生长。诱饵和猎物蛋白的相互作用导致 NMY51 的 his 和 ade 氧肥互补，此处显示的是酵母 2 杂交实验中诱饵和猎物之间相互作用的一个例子。鉴定了 malus domestica 宿主相互作用伙伴 MdTCP24 和 MdTCP25，并通过与效应子的 denovo 锥体转化证实了相互作用。

一旦掌握，如果提前准备好所有必要的设备和材料，尤其是酵母，就可以在一天内完成酵母 2 杂交。在尝试此程序时，重要的是要避免污染并始终在无菌条件下工作。在此程序之后，必须执行另一种独立的方法，例如双分子荧光互补，以确认发现的蛋白质-蛋白质相互作用。

这一点尤其重要，因为酵母或杂交种本身相对容易产生假阳性结果。经过开发，这项技术为许多不同研究领域的研究人员铺平了道路，以更好地了解涉及蛋白质-蛋白质相互作用的分子原理，特别是在宿主-病原体相互作用中，以及许多其他生物学研究领域。此外，您将了解在任何设备齐全的分子生物学实验室中执行此方法都很容易实现。

不要忘记，使用某些化学品、手术刀和明火可能非常危险，因此在执行此程序时，您始终必须考虑某些预防措施。这意味着使用您的个人安全设备，如手套和护目镜，并使用一般的实验室安全设备。