Name: 实验室规模的生产和治疗性抗体的纯化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: 学习利用HEK-293细胞在无血清培养基中稳定表达治疗性抗体的完整实验流程，包括细胞转染、适应性培养和亲和层析纯化等关键步骤，为实验室规模抗体生产提供可靠方法。

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本研究由悉尼大学资助。pVITRO1-曲妥珠单抗-IgG1/κ 质粒由 Andrew Beavil 惠赠（Addgene 质粒 # 61883）。我们感谢 Tihomir S. Dodev 就 pVITRO1-曲妥珠单抗-IgG1/κ 相关问题提供的有益讨论。

注意：本实验方案必须使用合适的哺乳动物表达载体。此处使用包含两个表达盒的单个构建体（即 重链和轻链的表达由不同的启动子驱动。曲妥珠单抗的重链和轻链此前已被克隆至该载体中。该载体由Andrew Beavil惠赠，通过非营利性质粒库获得 13.
1. 载体DNA的回收与扩增
注意：载体 DNA 以大肠杆菌（Escherichia coli）XL-1 Blue 菌株的软琼脂穿刺培养物形式提供；该载体带有潮霉素抗性基因。
<ol>
	<li>将无菌接种针或接种环插入半固体琼脂斜面培养物中，随后在含有75 µg/ml潮霉素的Luria Bertani（LB）琼脂平板上划线以获得单菌落。于37 °C培养18–24小时。</li>
	<li>挑取单菌落接种于5 ml含75 µg/ml潮霉素的TB培养基（Terrific broth）中，37 °C、225 rpm振荡培养18–24小时。</li>
	<li>将800 µl过夜培养物与200 µl 80%甘油在冻存管中轻轻混匀，制备质粒DNA的甘油保存液，于-80 °C冻存。
	<ol>
		<li>将100 µl过夜培养物加入含75 µg/ml潮霉素的100 ml TB培养基中，置于带挡板的摇瓶内即 1/1,000 稀释度）。在 37 °C、225 rpm 振荡条件下培养 18–24 小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>过夜培养后，按照中量/大量质粒提取试剂盒的说明书提取和纯化DNA，但以下步骤除外：在最后一步中，使用水（pH 7.0–8.5）洗脱或重悬DNA。</li>
	<li>通过在260和280 nm处的吸光度读数检测DNA的浓度和纯度，然后将DNA储存在-20 °C。 
	注意：可选（强烈推荐）：使用载体特异性引物对DNA进行测序，以确认其身份。</li>
</ol>
2. HEK-293 细胞的稳定转染
<ol>
	<li>按照标准方案，在添加了0.1%非离子表面活性剂的无血清培养基中，于锥形瓶内培养和维持HEK-293细胞（悬浮细胞）。维持细胞密度为2 × 105 个细胞/ml，每四天传代一次。在37 °C、5% CO2 及120 rpm振荡条件下培养细胞。 
	注意：转染前，细胞培养时间应不少于4天且不超过4周。使用含血清培养基中贴壁生长的HEK-293细胞也可用于本实验。</li>
	<li>转染前一天，将HEK-293细胞以3 × 105 个细胞/ml的密度接种于12孔板中，每孔加入2 ml添加了10%热灭活胎牛血清（FBS）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）。转染当天，检查细胞融合度是否达到80–90%。</li>
	<li>将DNA和聚乙烯亚胺（PEI）分别用转染培养基稀释，然后混合。
	<ol>
		<li>每孔加入1.25 µg质粒DNA（12孔共15 µg）至300 µl转染培养基中稀释。室温孵育5分钟。</li>
		<li>将2.5 µl浓度为1 mg/ml的PEI溶液（12孔共30 µl；即 DNA与PEI质量比为1:2）加入300 µl转染培养基中稀释。室温孵育5分钟。</li>
		<li>将稀释后的DNA加入稀释后的PEI中，轻轻混匀，室温孵育15分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将50 µl DNA/PEI混合物逐滴加入12孔板的每孔中。轻轻摇动培养板使转染混合物分布均匀，随后将培养板置于37 °C、5% CO2 条件下孵育24小时。</li>
	<li>每孔加入50 µg/ml潮霉素B，将培养板放回37 °C、5% CO2 环境中继续培养10天。 
	注意：至第10天时，未转染的细胞将死亡并从培养板表面脱落，而稳定转染的细胞仍保持存活并贴附于培养板表面。</li>
	<li>将每孔培养基更换为1/4体积的无血清培养基和3/4体积的添加了10% FBS的DMEM（即 0.5 ml无血清培养基 + 1.5 ml DMEM = 最终血清浓度为7.5%），继续孵育4天。</li>
	<li>将每孔培养基更换为1/2体积的无血清培养基和1/2体积的添加了10% FBS的DMEM（即 1 ml无血清培养基 + 1 ml DMEM = 最终血清浓度为5%），继续孵育4天。</li>
	<li>将每孔培养基更换为3/4体积的无血清培养基和1/4体积的添加了10% FBS的DMEM（即 1.5 ml无血清培养基 + 0.5 ml DMEM = 最终血清浓度为2.5%），继续孵育4天。</li>
	<li>将每孔培养基更换为2 ml添加了0.1%非离子表面活性剂的无血清培养基（即最终血清浓度为0%），继续孵育4天。 
	注意：在无血清适应过程中，需持续施加50 µg/ml潮霉素B的选择压力。适应无血清培养基的细胞会从孔板表面脱落，可能以悬浮状态聚集生长。参见步骤2.1中的培养条件，并额外添加50 µg/ml潮霉素B。</li>
	<li>使用移液器轻轻混匀12孔板中的悬浮培养物，并将细胞收集至一个单独的离心管中。
	<ol>
		<li>使用血细胞计数板对收集的细胞进行计数，并以2 × 105 个细胞/ml的密度接种于30 ml无血清培养基中，置于锥形瓶内。在37 °C、5% CO2 及120 rpm振荡条件下培养细胞。每四天传代并扩增一次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>继续扩大培养规模，直至达到所需细胞密度，以获得10管、每管1 × 107 个细胞的细胞悬液，用于液氮冷冻保存。将细胞冻存在含10%二甲基亚砜（DMSO）的无血清培养基中。 
	注意：可在每次传代时收集含抗体的条件培养基，用于确认蛋白表达情况或优化纯化条件。如需收集条件培养基并继续维持细胞传代，可将培养物在300 × g离心5分钟，随后用0.22 µm滤器过滤上清液以实现无菌。过滤后的上清液可在4 °C保存1–2周，或在-20 °C长期保存。</li>
</ol>
3. 从批量过量培养中进行大规模抗体生产
注意：抗体生产可从步骤 2.11 开始进行，此时根据拟建立的批量过量培养体积，将现有细胞扩增至所需的细胞密度。否则，从冷冻保存中解冻的细胞在扩增至适当的细胞密度和体积后，也从此阶段开始。可使用多种培养补充剂以优化抗体生产；本方案中展示了使用酪蛋白胨提高抗体产量的方法。
<ol>
	<li>在两个锥形瓶中，将细胞以 2 × 105 个细胞/ml 的密度接种于 100 ml 无血清培养基中（用于比较未添加营养补充物与添加营养补充物的培养体系中的抗体产量）。在 37 °C、5% CO2 及 120 rpm 条件下进行培养。</li>
	<li>接种 24 小时后，向营养补充物培养组中加入胰蛋白胨，使其终浓度为 0.5%。向未补充营养的培养组中加入无血清培养基，以平衡体积。</li>
	<li>从第 8 天开始，使用血细胞计数板每天对培养物进行细胞计数，以监测细胞活力。当细胞活力低于 80% 时，收集培养上清液。
	<ol>
		<li>通过在 3,000 × g 离心 15 分钟收集上清液，然后使用 0.22 µm 滤器对上清液（含抗体）进行过滤除菌。将上清液储存在 4 °C（短期）或 -20 °C（长期）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 使用自动化快速蛋白液相色谱（FPLC）系统通过亲和层析法纯化抗体
注意：以下步骤通常适用于大多数自动化系统。纯化可在室温或 4 °C 下进行（如果 FPLC 系统置于低温房间内）。可进行一系列预实验以确定最佳纯化条件，包括合适的层析柱基质、结合缓冲液、洗脱缓冲液和 pH 值，以确保从条件培养基中最大程度回收纯化的抗体（参见结果部分）。最佳条件取决于待纯化的抗体或蛋白质。本实验在自动化 FPLC 系统上进行，使用 5 ml Protein A 柱，在室温下完成纯化。
<ol>
	<li>使用超纯水配制以下缓冲液，并调节至推荐的pH值，然后通过0.22 µm滤膜过滤。
	<ol>
		<li>通过混合以下成分配制1 L磷酸盐缓冲盐水（PBS）pH 7.4（结合缓冲液）：0.14 M NaCl、0.0027 M KCl、0.01 M Na2HPO4 和 0.001 M KH2PO4。过滤缓冲液前，如有必要，调节pH值。</li>
		<li>配制500 ml 0.1 M甘氨酸-盐酸pH 2.7（洗脱缓冲液）。在过滤缓冲液前调节pH值。</li>
		<li>配制50 ml 1 M Tris pH 9.0（中和缓冲液）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>确保所有系统电源和与计算机的通信连接均已正确连接。设备应在软件的“系统控制”模块中可见。确保紫外检测器设定在280 nm波长。可选：若已连接并计划使用pH计，请对其进行校准。</li>
	<li>将A、B及样品泵的进样管浸入超纯水中以清洗系统。若管路中存在气泡或怀疑系统中有空气，使用注射器对泵进行排气。通过系统控制器手动操作或采用自动化方法，用水清洗系统。观察压力、电导率、UV280信号和pH值是否稳定，并确保压力未超过色谱柱制造商规定的最大限值。 
	注意：异常情况可能表明系统中存在空气或堵塞，应在继续操作前予以排除。</li>
	<li>在系统控制器模块中，通过泵A以1 ml/min的流速开始运行，选择加载（旁路样品环）或注入（通过样品环）模式，开始连接色谱柱。断开色谱柱入口处的系统管路，并移除连接在色谱柱入口的堵头。
	<ol>
		<li>让水从系统管路缓慢滴加至色谱柱顶部，然后将系统管路连接到色谱柱。确保色谱柱入口及接头处有水滴持续溢出，以保证连接过程中无气泡产生。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>连接色谱柱出口至下游出口，并检查所有接头是否已牢固拧紧。色谱柱连接至系统后，不得超过色谱柱规格中规定的最大压力和流速限制。</li>
	<li>用5个柱体积（CV）的水清洗色谱柱。如有必要，持续清洗直至UV280信号稳定。</li>
	<li>将A泵的进样管浸入结合缓冲液，B泵的进样管浸入洗脱缓冲液，样品泵的进样管浸入结合缓冲液，以使用正确的缓冲液平衡系统。通过手动操作PumpWash功能，用缓冲液填充进样管。</li>
	<li>在软件的“方法编辑器”模块中，使用方法向导为拟使用的色谱柱设置亲和层析方法。 
	注意：自动FPLC系统通常预置了推荐参数（即流速和压力限值）的方法，运行步骤根据所选色谱柱（制造商、基质和尺寸）自动配置。
	<ol>
		<li>蛋白A亲和层析使用以下运行步骤：
		<ol>
			<li>用5 CV结合缓冲液平衡系统，并将穿流液收集至废液容器中。</li>
			<li>将样品上样至色谱柱（上样体积在方法中手动指定），并将穿流液收集至单独容器中。</li>
			<li>用5 CV结合缓冲液清洗系统，并将穿流液收集至单独容器中。</li>
			<li>使用洗脱缓冲液进行5 CV等度洗脱，通过馏分收集器将纯化的抗体样品以馏分形式收集。</li>
			<li>用5 CV结合缓冲液重新平衡系统，并将穿流液收集至废液容器中。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>方法设置完成后，指定需上样至色谱柱的条件培养基体积，并保存该方法。 
	注意：方法中指定的体积应比实际体积少5–10 ml，以避免在样品运行过程中引入空气。本方案中使用的指定体积为90–120 ml。</li>
	<li>将样品泵管路浸入含有条件培养基的容器中。</li>
	<li>准备一个单独的容器，通过指定的出口管路收集样品穿流液。 
	注意：在运行过程中若发生错误，或色谱柱结合能力超载，需重新上样穿流液或重复纯化，因此收集穿流液至关重要。</li>
	<li>在馏分收集器中准备好收集管。每1 ml馏分体积加入100 µl中和缓冲液。FPLC系统将自动将馏分洗脱至收集管中。</li>
	<li>在软件的“系统控制”模块中，打开待运行的方法。 
	注意：方法运行将通过一系列页面启动，包括检查方法变量、设置馏分收集器，以及定义结果文件名和存储位置。</li>
	<li>点击“开始”以启动运行。可在“系统控制”模块中监控运行过程。</li>
	<li>纯化运行完成后，在系统软件的“评估”模块中查看所得色谱图。</li>
	<li>将所有含蛋白的馏分合并至一个单独的离心管中，使用截留分子量为30 kDa的离心过滤装置在PBS中进行缓冲液置换并浓缩。离心操作步骤请参照制造商说明书进行。</li>
	<li>根据制造商说明书，使用二辛可宁酸法（BCA）测定抗体浓度。</li>
	<li>若需进行另一次纯化运行，先用结合缓冲液对样品泵管路进行预处理，并重复步骤4.9–4.14。</li>
	<li>所有纯化运行完成后，将A、B及样品泵的进样管浸入超纯水中，按照步骤3的方法清洗系统和色谱柱。</li>
	<li>将A、B及样品泵管路浸入20%乙醇中，重复清洗程序，用于系统和色谱柱的储存。</li>
	<li>从下游出口断开色谱柱，盖上柱堵头；再从入口断开色谱柱，盖上堵头，将管路重新连接至系统。将色谱柱于4 °C保存。</li>
</ol>

<ol><li>Nelson, A. L., Reichert, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+trends+for+therapeutic+antibody+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Development trends for therapeutic antibody fragments.</a> Nat Biotechnol. 27 (4), 331-337 (2009).</li>
<li>Drake, P. M., Rabuka, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+emerging+playbook+for+antibody-drug+conjugates%3A+lessons+from+the+laboratory+and+clinic+suggest+a+strategy+for+improving+efficacy+and+safety%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">An emerging playbook for antibody-drug conjugates: lessons from the laboratory and clinic suggest a strategy for improving efficacy and safety.</a> Curr Opin Chem Biol. 28, 174-180 (2015).</li>
<li>Kontermann, R. E., Brinkmann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bispecific+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today%22%5BJournal%5D)">Bispecific antibodies.</a> Drug Discov Today. 20 (7), 838-847 (2015).</li>
<li>Beck, A., Wurch, T., Bailly, C., Corvaia, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+and+challenges+for+the+next+generation+of+therapeutic+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Strategies and challenges for the next generation of therapeutic antibodies.</a> Nat Rev Immunol. 10 (5), 345-352 (2010).</li>
<li>Food and Drug Administration. 22, Food and Drug Administration. eds U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research (CDER), & Center for Biologics Evaluation and Research (CBER) (2015).</li>
<li>European Medicines Agency. 13, European Medicines Agency. eds European Medicines Agency (EMA) & Committee for Medicinal Products for Human Use (CHMP) (2014).</li>
<li>Lopez-Morales, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physicochemical+and+biological+characterization+of+a+biosimilar+trastuzumab%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Physicochemical and biological characterization of a biosimilar trastuzumab.</a> Biomed Res Int. 2015, 427235(2015).</li>
<li>Jung, S. K., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25517302">Physicochemical characterization of Remsima.</a> MAbs. 6 (5), 1163-1177 (2014).</li>
<li>Visser, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physicochemical+and+functional+comparability+between+the+proposed+biosimilar+rituximab+GP2013+and+originator+rituximab%5BTitle%5D)+AND+%22BioDrugs%22%5BJournal%5D)">Physicochemical and functional comparability between the proposed biosimilar rituximab GP2013 and originator rituximab.</a> BioDrugs. 27 (5), 495-507 (2013).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+of+different+vector+designs+for+the+mammalian+expression+of+recombinant+IgG+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A comparative study of different vector designs for the mammalian expression of recombinant IgG antibodies.</a> J Immunol Methods. 318 (1-2), 113-124 (2007).</li>
<li>Fitzgerald, K. D., Semler, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bridging+IRES+elements+in+mRNAs+to+the+eukaryotic+translation+apparatus%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Bridging IRES elements in mRNAs to the eukaryotic translation apparatus.</a> Biochim Biophys Acta. 1789 (9-10), 518-528 (2009).</li>
<li>Ho, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IRES-mediated+Tricistronic+vectors+for+enhancing+generation+of+high+monoclonal+antibody+expressing+CHO+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">IRES-mediated Tricistronic vectors for enhancing generation of high monoclonal antibody expressing CHO cell lines.</a> J Biotechnol. 157 (1), 130-139 (2012).</li>
<li>Dodev, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tool+kit+for+rapid+cloning+and+expression+of+recombinant+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A tool kit for rapid cloning and expression of recombinant antibodies.</a> Sci Rep. 4, 5885(2014).</li>
<li>Walsh, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+modifications+of+protein+biopharmaceuticals%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today%22%5BJournal%5D)">Post-translational modifications of protein biopharmaceuticals.</a> Drug Discov Today. 15 (17-18), 773-780 (2010).</li>
<li>Backliwal, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+vector+design+and+multi-pathway+modulation+of+HEK+293E+cells+yield+recombinant+antibody+titers+exceeding+1+g%2Fl+by+transient+transfection+under+serum-free+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Rational vector design and multi-pathway modulation of HEK 293E cells yield recombinant antibody titers exceeding 1 g/l by transient transfection under serum-free conditions.</a> Nucleic Acids Res. 36 (15), 96(2008).</li>
<li>Bebbington, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-level+expression+of+a+recombinant+antibody+from+myeloma+cells+using+a+glutamine+synthetase+gene+as+an+amplifiable+selectable+marker%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+%28N+Y%29%22%5BJournal%5D)">High-level expression of a recombinant antibody from myeloma cells using a glutamine synthetase gene as an amplifiable selectable marker.</a> Biotechnology (N Y). 10 (2), 169-175 (1992).</li>
<li>Kaufman, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coamplification+and+coexpression+of+human+tissue-type+plasminogen+activator+and+murine+dihydrofolate+reductase+sequences+in+Chinese+hamster+ovary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Coamplification and coexpression of human tissue-type plasminogen activator and murine dihydrofolate reductase sequences in Chinese hamster ovary cells.</a> Mol Cell Biol. 5 (7), 1750-1759 (1985).</li>
<li>Dalton, A. C., Barton, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Over-expression+of+secreted+proteins+from+mammalian+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Over-expression of secreted proteins from mammalian cell lines.</a> Protein Sci. 23 (5), 517-525 (2014).</li>
<li>Pham, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+gene+expression+in+HEK293+cells%3A+peptone+addition+posttransfection+improves+recombinant+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Transient gene expression in HEK293 cells: peptone addition posttransfection improves recombinant protein synthesis.</a> Biotechnol Bioeng. 90 (3), 332-344 (2005).</li>
<li>Pham, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+transient+transfection+of+serum-free+suspension-growing+HEK293+EBNA1+cells%3A+peptone+additives+improve+cell+growth+and+transfection+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Large-scale transient transfection of serum-free suspension-growing HEK293 EBNA1 cells: peptone additives improve cell growth and transfection efficiency.</a> Biotechnol Bioeng. 84 (3), 332-342 (2003).</li>
<li>Yang, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addition+of+valproic+acid+to+CHO+cell+fed-batch+cultures+improves+monoclonal+antibody+titers%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Addition of valproic acid to CHO cell fed-batch cultures improves monoclonal antibody titers.</a> Molecular Biotechnology. 56 (5), 421-428 (2014).</li>
<li>Backliwal, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Valproic+acid%3A+a+viable+alternative+to+sodium+butyrate+for+enhancing+protein+expression+in+mammalian+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Valproic acid: a viable alternative to sodium butyrate for enhancing protein expression in mammalian cell cultures.</a> Biotechnol Bioeng. 101 (1), 182-189 (2008).</li>
<li>Jiang, Z., Sharfstein, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+butyrate+stimulates+monoclonal+antibody+over-expression+in+CHO+cells+by+improving+gene+accessibility%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Sodium butyrate stimulates monoclonal antibody over-expression in CHO cells by improving gene accessibility.</a> Biotechnol Bioeng. 100 (1), 189-194 (2008).</li>
<li>Jordan, M., Wurm, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+of+adherent+and+suspended+cells+by+calcium+phosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Transfection of adherent and suspended cells by calcium phosphate.</a> Methods. 33 (2), 136-143 (2004).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

本方案详细介绍了在HEK-293细胞中进行治疗性抗体转染、稳定表达及纯化的步骤。抗体基因的稳定表达是构建抗体生产细胞系、进而开发和生产治疗性抗体的首要步骤。尽管中国仓鼠卵巢（CHO）细胞仍是治疗性蛋白表达的首选平台，但随着研究发现，HEK-293细胞所表达的蛋白在翻译后修饰和功能方面更接近天然的人源蛋白，其应用正日益受到重视14,15。
哺乳动物细胞系，包括CHO（例如，CHO-DG44和CHO-K1）以及不分泌免疫球蛋白的小鼠B细胞系NS0和SP2/0，主要被用于生物制药生产。基于这些细胞系的表达系统依赖于筛选过程，通过逐步添加特定的选择性药物来诱导并筛选出高表达克隆16,17。因此，获得稳定克隆的筛选过程可能十分繁琐且耗时。与这些现有方法相比，HEK-293细胞系具有高效的转染能力，筛选过程更简便，并且极易适应无血清悬浮培养，使...

治疗性抗体的成功持续推动着抗体研发领域的大量投入，新一代治疗药物的浪潮已经开始。抗体市场预计将由抗体片段1、抗体-药物偶联物2、双特异性抗体3以及具有优良特性的工程化抗体4重塑。另一类日益受到制药行业关注的是生物类似药。生物类似抗体是指与已获监管批准的治疗性抗体“高度相似”的复制产品。拟议的生物类似药必须在结构、功能、动物毒性、临床安全性与有效性、人体药代动力学（PK）、药效动力学（PD）及免疫原性等方面与原始抗体具有可比性5,6。
由于对产品最终质量有严格要求，生物类似抗体的获批速度较为缓慢。具体的生产工艺，例如特定的细胞系、培养条件以及最终的加工步骤，通常属于专有技术而未被公开。此外，抗体的生产本身具有一定程度的变异性，这进一步增加了开发高度相似产品的难度。尽管全面的理化和生物物理表征与比对十分困难，但目前已有越来越多的研究在文献中报道了生物类似抗体的特性7,8,9。
治疗性抗体的制备始于将携带相应抗体基因的载体转染至哺乳动物宿主细胞。载体设计、细胞系及培养条件是构建表达系统时的关键考虑因素。
抗体的DNA序列可来源于Drug Bank（www.drugbank.ca）、IMGT（www.imgt.org）或包括专利在内的科研文献。例如，曲妥珠单抗的序列可通过Drug Bank获取（DB ID: DB00072）。可变区的氨基酸序列可进行基因设计和优化，以便在目标宿主物种中合成。对于生物类似药抗体而言，确保氨基酸序列不发生任何修饰至关重要。基因合成后，可将抗体基因亚克隆至合适的载体中。
人IgG抗体由两条相同的重链和两条相同的轻链组成。在哺乳动物细胞中高效表达异源IgG蛋白，必须严格调控两条链的表达10。在蛋白质生物合成过程中，需要形成链内和链间二硫键，并引入多种翻译后修饰。目前已开发出多种专门用于表达抗体基因的载体（参见材料表）。这些抗体特异性载体通常已包含重链和轻链的恒定区序列，因此只需克隆每条链的可变区即可。
利用两种独立的载体对细胞进行转染（共转染），是递送编码抗体重链和轻链基因的最常用方法。即每个基因由各自的启动子驱动，在内质网中组装前，分别转录为独立的抗体链。另一方面，多顺反子载体中包含内部核糖体进入位点（IRES）元件，可使多个基因作为单个mRNA转录本表达，并允许核糖体从mRNA内部区域启动翻译11。在此情况下，编码重链和轻链的基因以特定排列方式连接，以实现两种抗体链的共表达10,12。
尽管瞬时转染的细胞能够产生足够用于有限数量实验的蛋白质，但经过基因组整合筛选的稳定转染细胞系可提供更高的蛋白产量。较高的蛋白质产量有助于开展与之相关的检测方法开发 体外 表征可为下游应用（如克隆细胞系和候选分子筛选）中的抗体质量提供参考依据。
本文的目的是描述在哺乳动物表达系统中生产的治疗性抗体的稳定表达与纯化方法。该方法同样适用于生物类似药抗体的表达。在进入筛选适合大规模生产的理想克隆这一关键但耗时的步骤之前，可利用本方法对抗体进行初步表征。此外，该方法也可用于表达其他蛋白质，而不仅限于抗体。
以下详细方案描述了治疗性抗体曲妥珠单抗的表达过程。该过程包括载体DNA的制备，随后在HEK-293细胞系中进行稳定转染，以及通过自动化色谱方法对抗体蛋白进行纯化。

<table><tbody><tr><td>pFUSE 载体系列</td><td>InvivoGen</td><td>N/A</td><td>重链和轻链抗体基因分别在两个独立载体中表达，需共转染。</td></tr><tr><td>mAbXpress 载体系列</td><td>ACYTE Biotech Pty Ltd.</td><td></td><td>重链和轻链抗体基因分别在两个独立载体中表达，需共转染。参考文献：Jones, M. L. 等. 一种快速、无需连接的重组单克隆抗体重构建方法. J Immunol Methods. 354 (1-2), 85-90, doi:10.1016/j.jim.2010.02.001, (2010)。</td></tr><tr><td>pVITRO1 载体</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>单个载体中，重链和轻链抗体基因分别由独立启动子驱动。&amp;nbsp; 参考文献：Dodev, T. S. &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; 一种用于快速克隆和表达重组抗体的工具包. Sci Rep. 4 5885, doi:10.1038/srep05885, (2014)。</td></tr><tr><td>GS 载体系列</td><td>Lonza</td><td></td><td>多顺反子载体，重链和轻链抗体基因在同一转录本中共表达并翻译。</td></tr><tr><td>多顺反子载体系列 1</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>多顺反子载体，重链和轻链抗体基因在同一转录本中共表达并翻译。参考文献：Li, J. &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; 不同载体设计在哺乳动物细胞中表达重组 IgG 抗体的比较研究. J Immunol Methods. 318 (1-2), 113-124, doi:10.1016/j.jim.2006.10.010, (2007)。</td></tr><tr><td>多顺反子载体系列 2</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>多顺反子载体，重链和轻链抗体基因在同一转录本中共表达并翻译。参考文献：Ho, S. C. &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; 通过 IRES 介导的三顺反子载体增强高表达单克隆抗体的 CHO 细胞系的构建. J Biotechnol. 157 (1), 130-139, doi:10.1016/j.jbiotec.2011.09.023, (2012)。</td></tr><tr><td>pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/&amp;kappa;</td><td>Addgene</td><td>61883</td><td>含有曲妥珠单抗抗体基因和潮霉素抗性基因的哺乳动物表达载体；pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/&amp;kappa; 由 Andrew Beavil 惠赠。</td></tr><tr><td>Fast-Media Hygro 琼脂</td><td>Jomar Life Research</td><td>fas-hg-s</td><td>用于制备含 75 &amp;micro;g/ml 潮霉素的低盐 LB 琼脂。</td></tr><tr><td>Fast-Media Hygro TB</td><td>Jomar Life Research</td><td>fas-hg-l</td><td>用于制备含 75 &amp;micro;g/ml 潮霉素的低盐 TB 培养基。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>甘油，BioXtra，&amp;ge;99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6279</td><td>用水配制成 80% 溶液并高压灭菌。室温保存。</td></tr><tr><td>Jestar 2.0/LFU 质粒大提试剂盒</td><td>Astral Scientific</td><td>G221020</td><td>质粒大提试剂盒；用去离子水（pH 7.0–8.5）洗脱或重悬 DNA。</td></tr><tr><td>FreeStyle 293-F 细胞</td><td>Life Technologies</td><td>R790-07</td><td>适应于无血清培养基中悬浮培养的 HEK-293 细胞系。</td></tr><tr><td>FreeStyle 293 表达培养基</td><td>Life Technologies</td><td>12338-018</td><td>专为维持 293-F 细胞系生长和高效蛋白表达而配制的无血清培养基。</td></tr><tr><td>Kolliphor P188</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K4894</td><td>非离子型表面活性剂；即 Pluronic F-68；用水配制成 10% 溶液，使用 0.22 &amp;mu;m 滤膜过滤除菌。4 &amp;deg;C 保存。</td></tr><tr><td>DMEM，高糖&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>热灭活胎牛血清</td><td>Life Technologies</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯亚胺，线性，分子量 25,000&amp;nbsp;</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>23966</td><td>用水配制成 1 mg/ml 溶液。用 1 M HCl 调节 pH 至 7.0（溶液变澄清），使用 0.22 &amp;mu;m 滤膜过滤除菌。使用前于 -80 &amp;deg;C 保存。</td></tr><tr><td>OptiPro SFM</td><td>Life Technologies</td><td>12309-050</td><td>用于转染的无血清培养基</td></tr><tr><td>潮霉素 B 溶液</td><td>Jomar Life Research</td><td>ant-hg-1</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AJA2225</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨（酪蛋白胨）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LP0042B</td><td>用 PBS 配制成 20% 溶液，使用 0.22 &amp;mu;m 滤膜过滤除菌。4 &amp;deg;C 保存。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）片剂，pH 7.4，100 ml</td><td>Astral Scientific</td><td>09-2051-100</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap Protein A 高性能柱，1 × 5 ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GE17-0403-01</td><td></td></tr><tr><td>AKTApurifier 100</td><td>GE Healthcare</td><td>28406266</td><td>自动化 FPLC 系统，可配备 P-960 样品泵和 Frac-920 分部收集器。</td></tr><tr><td>甘氨酸-盐酸（Glycine-HCl）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2879</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸，一水合物</td><td>Astral Scientific</td><td>BIOC2123</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸钠，三水合二钠盐&amp;nbsp;</td><td>Astral Scientific</td><td>BIOCB0035</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl 溶液，pH 9.0</td><td>Astral Scientific</td><td>BIOSD8146</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 离心过滤器（30 MWCO）</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC803008/UFC903008</td><td>用于置换缓冲液并浓缩纯化后的蛋白。</td></tr><tr><td>Pierce 二辛可宁酸（BCA）蛋白定量试剂盒</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>BLItz 系统</td><td>fort&amp;eacute;BIO</td><td>45-5000</td><td>用于生物膜层干涉（BLI）检测的仪器。</td></tr><tr><td>Protein A 生物传感器</td><td>fort&amp;eacute;BIO</td><td>18-5010</td><td></td></tr><tr><td>丙烯酰胺/双丙烯酰胺（37.5:1），40% 溶液</td><td>Astral Scientific</td><td>786-502</td><td></td></tr><tr><td>过硫酸铵（APS）</td><td>Astral Scientific</td><td>AM0486</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Astral Scientific</td><td>AM0761</td><td></td></tr><tr><td>考马斯亮蓝 R-250</td><td>Astral Scientific</td><td>786-498</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus 双色蛋白标准品</td><td>Bio-Rad</td><td>1610374</td><td></td></tr></tbody></table>

治疗性抗体的小规模生产与纯化

Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody

确保治疗性抗体的成功生产始于开发过程的早期阶段。第一阶段是抗体基因的载体表达，随后将其稳定转染至合适的细胞系中。对获得的稳定克隆进行筛选，以挑选出具有理想生产性能和生长特性的克隆。这是整个流程中至关重要的一步，尽管耗时较长。本方案涉及用于表达治疗性抗体的载体选择以及抗体序列的获取。方法部分描述了用于稳定转染人胚胎肾293（HEK-293）悬浮细胞系的载体DNA制备过程，采用聚乙烯亚胺（PEI）进行转染。转染时细胞以贴壁状态在含血清培养基中进行，以最大化转染效率，之后再适应无血清培养条件。通过批量扩增培养方式进行大规模生产，所获得的抗体蛋白采用自动化快速蛋白液相色谱仪（FPLC）结合亲和层析进行纯化。该方法所产生的抗体产量足以支持对抗体的初步表征工作，包括体外（in vitro）检测方法的建立或理化性质分析，从而辅助完成对候选克隆进行筛选这一耗时的任务。该方法也可应用于生物类似药抗体生产表达系统的开发。

通过生物膜干涉技术（BLI）验证了转染HEK-293细胞稳定表达曲妥珠单抗，结果如图1所示。通过测定IgG抗体标准品与Protein A生物传感器之间的结合速率，绘制IgG标准曲线（图1A）。同样测定粗上清液样本的结合速率，并根据标准曲线插值计算其浓度（图1B）。在无血清培养适应两周后、建立过量培养批次前，测得上清液浓度约为25 µg/ml（取样自传代培养时收集的50 ml培养液）。
在无血清适应后每次传代收集的上清液被合并，用于优化纯化条件；结合缓冲液和洗脱缓冲液的筛选如图2所示。纯化步骤基于UV280信号展示于图2A。当Protein A柱完成平衡后，UV280信号的升高代表样品上样；该信号升高是由于上清液流穿通过层析柱所致（其中含有未结合的蛋白质，在此波长下吸收紫外光），而抗体则...

本方案描述了在哺乳动物表达系统中生产治疗性抗体的方法。所述方法包括载体DNA的制备、人胚胎肾293细胞系的稳定转染和无血清适应、大规模培养体系的建立，以及利用亲和层析进行纯化。

确保治疗性抗体的成功生产始于研发过程的早期阶段。第一阶段是目的基因的载体表达……

本方法的总体目标是建立一种高产量的无血清表达系统，用于实验室规模生产治疗性抗体。该方法可解决抗体表达系统设计中的关键问题，例如稳定细胞系的构建、添加补充物以及纯化策略的优化。该技术的主要优势在于，构建适应无血清培养基的稳定细胞系，能够高效且可重复地生产大量治疗性抗体。首先，将HEK-293细胞接种于添加0.1%非离子型表面活性剂的无血清培养基中，按照标准操作在锥形瓶中进行培养。于37摄氏度、5%二氧化碳及120转/分钟的振荡条件下孵育细胞。维持细胞密度为每毫升2×10⁵个细胞，并每四天传代一次。转染前一天，将HEK-293细胞以每毫升3×10⁵个细胞的密度接种于12孔板中，每孔加入2毫升含10%热灭活胎牛血清的DMEM培养基。转染当天，检查细胞融合度是否达到80%至90%。每孔用300微升转染培养基稀释1.25微克质粒DNA。然后每孔使用 300 微升转染培养基稀释 2.5 微升浓度为 1 毫克/毫升的聚乙烯亚胺（PEI）溶液。将两种溶液在室温下孵育 5 分钟。接着，将稀释后的 DNA 加入稀释后的 PEI 溶液中。轻轻混匀，并在室温下孵育溶液15分钟。然后将50微升DNA-PEI混合物逐滴加入到板的每孔中。轻轻摇动培养板以分散转染混合物，随后将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育24小时。次日，每孔加入终浓度为 50 微克/毫升的潮霉素 B，将培养板放回培养箱中继续培养 10 天。转染后，成功获得稳定转染的细胞将保持存活并贴壁生长。为进行无血清适应性培养，将每孔中的培养基更换为 1/4 体积的无血清培养基与 3/4 体积含 10% FBS 的 DMEM 培养基。将培养物孵育四天。然后将培养基更换为一半体积的无血清培养基和一半体积含10%FBS的DMEM，继续孵育额外四天。现在，更换培养基，加入3/4体积的无血清培养基和1/4体积的含10% FBS的DMEM。继续培养额外四天。最后，更换为添加了0.1%非离子型表面活性剂的无血清培养基，再培养四天。在稳定细胞成功适应后，用移液器轻轻混匀12孔板中的悬浮培养物，并将细胞收集至一个单独的离心管中。使用血细胞计数板对收集的细胞进行计数，然后将细胞以每毫升2×10⁵个细胞的密度接种于含30毫升无血清培养基的培养瓶中。将细胞置于37 °C、5% CO₂条件下，以每分钟120转的速度进行培养。每四天传代并扩增细胞一次。为比较未添加营养补充物与添加营养补充物培养体系的抗体产量，将细胞以每毫升2 × 10⁵个细胞的密度接种于两个烧瓶中，每瓶含100毫升无血清培养基。于37°C、5% CO₂条件下，以120转/分钟振荡培养24小时。向添加了营养补充物的培养液中加入胰蛋白胨，使其终浓度为 0.5%，然后使用无血清培养基将未补充营养的培养液体积调整至相同。继续培养细胞额外七天。从培养的第八天开始，每天使用血细胞计数板对细胞

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Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

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一种纯化中国仓鼠卵巢细胞产生的单克隆抗体的技术

该视频展示了一种利用稳定转染的哺乳动物细胞生产治疗性抗体的方法。添加胰蛋白胨可促进细胞分裂，导致细胞过度生长，并支持更高的抗体产量。收集含抗体的培养基，经过滤后储存，以供后续使用。...

转染哺乳动物细胞的批量过量培养中抗体的生产

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