Name: 1,2- Azaborines的合成及其蛋白复合物的用T4溶菌酶突变体的制备 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: 学习1,2-氮杂硼烷的合成方法及其与T4溶菌酶突变体制备蛋白复合物的技术。该方法利用钯碳催化反应，为生物医学研究中的药物开发提供可靠的硼杂环化合物合成途径。

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本研究由美国国立卫生研究院普通医学科学研究所（NIGMS，资助号：R01-GM094541）和波士顿学院资助。

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<li>Liu, L., Baase, W. A., Matthews, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Halogenated+Benzenes+Bound+within+a+Non-polar+Cavity+in+T4+Lysozyme+Provide+Examples+of+I.S+and+I.Se+Halogen-bonding%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Halogenated Benzenes Bound within a Non-polar Cavity in T4 Lysozyme Provide Examples of I.S and I.Se Halogen-bonding.</a> J. Mol. Biol. 385 (2), 595-605 (2009).</li>
</ol>

所有作者声明本稿件不存在竞争性经济利益。

在本实验方案的第一部分中，我们描述了一种基于先前报道方法改进的1,2-氮杂硼杂苯合成方法12, 13三烯丙基硼烷22 被用作替代烯丙基三苯基锡或烯丙基三氟硼酸钾路线以制备 N-烯丙基-NTBS-缓冲液B-烯丙基氯加合物（1）。该方法实现了更高的原子经济性，并且对环境更加友好。适用于以下合成： N-TBS-B-Cl-1,2-氮杂硼杂苯（3），采用了一锅法两步反应序列（关环复分解反应后接氧化反应），其分离产率高于先前涉及中间体分离的方法（2）（两步反应产率分别为52%和29%）。 （然而，产率取决于加合物的纯度（1），在氧化步骤之前可能需要通过减压蒸馏分离环化产物。此时，使用二氯甲烷代替甲苯作为溶剂，可缩短蒸馏前去除挥发性物质所需的时间。）监测 ...

含硼-氮的杂环化合物（即 1,2-氮杂硼杂苯）近年来作为芳环的生物电子等排体引起了广泛关注。这种电子等排性可促进现有结构基元的多样化，从而拓展化学空间2,3,4。氮杂硼杂苯在生物医学研究中具有潜在应用价值5,6,7,8，尤其在药物化学领域，化学家常需合成结构和功能相关分子的化合物库。然而值得注意的是，尽管目前已有大量成熟的合成方法可用于制备含芳环的分子，但关于氮杂硼杂苯的合成方法报道却十分有限9,10,11,12,13。这主要归因于合成起始阶段硼源选择有限，且该类分子对空气和水分高度敏感。
本文的第一部分将描述使用标准无水无氧技术对N-TBS-B-Cl-1,2-氮杂硼烯（3）进行多克级合成的方法。该化合物是一种多功能的中间体，可进一步官能化生成结构更复杂的分子14,15。以化合物3为起始原料，本文还将描述用于蛋白质结合研究的N-H-B-乙基-1,2-氮杂硼烯（5）的合成与纯化过程。由于5具有挥发性，其高效分离需要对反应温度、反应时间和蒸馏条件进行精确控制。
在第二部分，将介绍T4溶菌酶突变体（L99A和L99A/M102Q）17,18,19,20的蛋白表达与分离纯化方案，随后介绍蛋白结晶及蛋白-配体晶体复合物的制备。选择T4溶菌酶突变体L99A和L99A/M102Q作为生物模型系统，用于研究含N-H键的氮杂硼杂苯分子的氢键形成能力17。采用标准的分子生物学方法，在大肠杆菌（Escherichia coli）RR1菌株中表达蛋白，并用异丙基-β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）诱导表达。通过离子交换柱层析法进行蛋白纯化。采用悬滴气相扩散法进行蛋白结晶，所用蛋白溶液为高浓度且高度纯化的蛋白（经凝胶电泳检测纯度&#62;95%）。由于本研究中所用配体对氧气敏感，蛋白-配体复合物的制备需在无氧条件下进行。

<table><tbody><tr><td>四氢呋喃（THF），无抑制剂，用于高效液相色谱 &amp;ge;99.9%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34865</td><td></td></tr><tr><td>乙醚（Et&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;高效液相色谱用 &amp;ge;99.9%，无抑制剂</td><td>Sigma Aldrich</td><td>309966</td><td></td></tr><tr><td>二氯甲烷&amp;nbsp; (CH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;Cl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;），（稳定化/认证ACS）</td><td>Fisher</td><td>D37-20</td><td></td></tr><tr><td>甲苯</td><td>Fisher</td><td>T290-4</td><td></td></tr><tr><td>戊烷，HPLC</td><td>Fisher</td><td>P399-4</td><td></td></tr><tr><td>乙腈</td><td>Fisher</td><td>A21-4</td><td></td></tr><tr><td>氢化钙（CaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;），试剂级，95%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>208027</td><td>易燃的</td></tr><tr><td>活性炭负载钯（Pd/C），10 wt% Pd</td><td>Strem</td><td>46-1900</td><td></td></tr><tr><td>1.0 M 三氯化硼己烷溶液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>211249</td><td>剧毒/自燃性</td></tr><tr><td>三乙胺 &amp;ge;99.5%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>471283</td><td></td></tr><tr><td>格拉布斯 1&lt;sup&gt;st&lt;/sup&gt; 生成催化剂&amp;nbsp;</td><td>材料</td><td>C823</td><td></td></tr><tr><td>乙酰胺</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A0500</td><td></td></tr><tr><td>正丁醇，无水，99.8%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>281549</td><td></td></tr><tr><td>乙基锂溶液，0.5&amp;nbsp;苯/环己烷中的 M 浓度</td><td>Sigma Aldrich</td><td>561452</td><td>剧毒/自燃性</td></tr><tr><td>2.0 M HCl溶液，溶于Et&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>455180</td><td></td></tr><tr><td>2-甲基丁烷，无水 &amp;ge;99%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>277258</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;大肠杆菌&lt;/em&gt;，（Migula）Castellani 和 Chalmers（ATCC&amp;reg; 31343&amp;trade;)</td><td>ATCC</td><td>31343</td><td></td></tr><tr><td>T4溶菌酶野生型*（L99A）</td><td>Addgene</td><td>18476</td><td></td></tr><tr><td>T4溶菌酶突变体（S38D L99A M102Q N144D）</td><td>Addgene</td><td>18477</td><td></td></tr><tr><td>氨苄青霉素钠盐</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A0166</td><td></td></tr><tr><td>异丙基-&amp;beta;异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>AM9464</td><td></td></tr><tr><td>无水磷酸二氢钠</td><td>Fisher</td><td>BP329</td><td></td></tr><tr><td>无水磷酸氢二钠</td><td>Fisher</td><td>BP332</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Fisher</td><td>S642212&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸</td><td>Fisher</td><td>BP118</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M4880</td><td>腐蚀性</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Pierce DNase I</td><td>Fisher</td><td>PI-90083</td><td></td></tr><tr><td>GE Healthcare&amp;nbsp;Sepharose Fast Flow 阳离子交换介质</td><td>Fisher</td><td>45-002-931</td><td></td></tr><tr><td>Tris碱</td><td>Fisher</td><td>BP152-500&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>TCI</td><td>S0489</td><td>剧毒</td></tr><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>Fisher</td><td>ICN806443&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>赛多利斯&amp;nbsp;Vivaspin 20 离心浓缩管</td><td>Fisher</td><td>14-558-501</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5379</td><td></td></tr><tr><td>2-羟乙基二硫化物</td><td>Sigma Aldrich</td><td>380474</td><td></td></tr><tr><td>N-对甲苯磺酰基对氨基苯甲酸&amp;nbsp;</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-643</td><td></td></tr><tr><td>4 RC 透析膜管，12,000 至 14,000 道尔顿截留分子量&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td>08-667E</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;CryoLoop</td><td>Hampton Research</td><td></td><td>环形低温管</td></tr><tr><td>CryoTong</td><td>赛默飞世尔科技</td><td></td><td>低温钳</td></tr><tr><td>Coot</td><td></td><td></td><td>电子密度图像是由软件生成的</td></tr></tbody></table>

1,2-氮杂硼杂苯的合成及其与t4溶菌酶突变体蛋白复合物的制备

Synthesis of 1,2-Azaborines and the Preparation of Their Protein Complexes with T4 Lysozyme Mutants

我们描述了一种采用标准无水无氧技术合成1,2-氮杂硼杂苯的方法，以及通过蒸汽扩散法制备T4溶菌酶突变体蛋白复合物的流程。对氧气和湿气敏感的化合物需在惰性气氛（N₂）下进行制备和分离。2）使用真空气体操作装置或手套箱。作为氮杂硼杂苯合成的一个示例，我们演示了该挥发性物质的合成与纯化 N- H -B-乙基-1,2-氮杂硼杂苯通过五步反应序列制备，涉及蒸馏和柱层析以分离产物。T4溶菌酶突变体L99A和L99A/M102Q的表达采用 大肠杆菌 RR1 菌株。采用化学法裂解细胞后，通过羧甲基离子交换柱纯化，可获得纯度足以用于结晶的蛋白质。蛋白质结晶采用悬滴 vapor diffusion 法，在不同浓度的沉淀剂和不同 pH 范围内进行。小分子复合物的制备在惰性气氛下通过 vapor diffusion 法完成。对晶体复合物进行 X 射线衍射分析，可明确提供蛋白质结合位点与 1,2-氮硼杂萘之间结合相互作用的结构证据。

1,2-氮杂硼杂苯的示意图合成路线如图1所示。本方案适用于五种不同含硼-氮分子的合成。图2展示了在步骤1.3过程中测得的11B核磁共振谱，用于监测目标产物（3）的生成。蛋白质纯化采用低压色谱系统进行，典型的色谱图如图3所示。收集组分的纯度通过SDS-PAGE测定。T4溶菌酶突变体L99A的晶体结构如图4所示。图5展示了L99A的结合口袋，包含未建模的电子密度，以及配体5结合后经精修的结合空腔。

本文介绍了一种1,2-氮硼杂苯的合成方法及其与T4溶菌酶突变体蛋白复合物的制备方案。

1,2-氮杂硼杂苯的合成及其与T4溶菌酶突变体蛋白复合物的制备

我们描述了一种使用标准无水无氧技术合成1,2-氮杂硼杂苯的方法，以及通过蒸汽扩散法利用T4溶菌酶突变体进行蛋白质复合物制备的流程。

本实验方案的总体目标是描述一种合成1,2-氮杂硼杂苯的通用方法，并探讨其在生物医学研究中的潜在应用。该技术的主要优势在于能够可靠地合成1,2-氮杂硼杂苯类化合物，这类化合物是广泛存在的苯环结构中含硼的生物电子等排体。所描述的前体可进一步进行官能化，转化为潜在的更复杂分子。制备1,2-氮硼杂苯的蛋白复合物将为未来在生物医学研究中的应用提供一定见解。开始该实验前，按照文本方案中所述制备环化产物。将14克钯碳加入该制备好的产物的甲苯溶液中。然后，将烧瓶从箱中取出。装上一个已用氮气吹扫并连接冰水冷却的烘干24/40回流冷凝管。将烧瓶置于油浴中，在135摄氏度下加热至剧烈回流，同时搅拌反应液。将反应保持在回流状态16小时。之后，将烧瓶从油浴中取出，使反应冷却至室温。冷却后，将反应烧瓶上的回流冷凝器替换为橡胶隔垫。使用配有经烘箱干燥的鲁尔锁紧针头的注射器，吸取 5 毫升等分试样。将该试样转移至带螺口盖的核磁共振管中。通过硼-11 核磁共振对样品进行分析。如果反应不完全，将反应瓶转移至手套箱中，然后加入额外的三克碳载钯。接着，将反应瓶从手套箱中取出。将烧瓶连接已用氮气吹扫并通入冷水的24/40回流冷凝管。使用油浴将反应液加热至135摄氏度，剧烈回流并持续搅拌24小时。采用硼-11核磁共振（Boron-11 NMR）分析另一份等分试样，以确认反应完全。此后，将反应瓶重新转移回手套箱中。将反应混合物通过装有纸巾的快速柱色谱柱过滤。随后，将滤液收集至一个配备搅拌子的一升圆底烧瓶中。用50毫升甲苯洗涤层析柱。将滤液容器从手套箱中取出，并连接到配备氮气管线的真空气体歧管上。在烧瓶下方放置一个水浴，并用装有液氮的杜瓦瓶来冷凝捕集溶剂。打开高真空阀，开始从滤液中除去所有挥发性物质。然后将反应混合物重新放回手套箱中。将该混合物转移至一个已烘干的24/40接口250毫升圆底烧瓶中，并加入搅拌子。用二氯甲烷冲洗残留的反应混合物，并转移至烧瓶中。用隔膜盖紧烧瓶。将烧瓶从手套箱转移至真空歧管并连接。打开高真空阀门以除去残留溶剂。随后迅速取下隔垫，用药匙加入氢化钙。将圆底烧瓶连接至文中所述蒸馏装置，并将油浴温度设定为100摄氏度。蒸馏完成后，移去热源，将装置冷却至室温。用氮气对冷却后的装置重新加压，并紧密关闭无水储存烧瓶上的插塞阀。在手套箱中将分离产物从烧瓶转移至样品瓶后，将样品瓶存入手套箱内的冷冻柜中。蛋白纯化后，将纯化后的溶液转移至透析膜管中。将透析管放入盛有4升透析液的容器中，透析液包含100毫摩尔磷酸钠、550毫摩尔氯化钠和0.2%叠氮化钠。在4°C下搅拌透析过夜。第二天，向透析后的样品中加入2-巯基乙醇，使其终浓度为5毫摩尔。然后，使用离心浓缩装置将溶液浓缩至40毫克/毫升。在5,000 RPM和6摄氏度条件下离心，并在浓缩后去除任何沉淀物。接下来，在24孔板中根据文本方案所述设置含有储液溶液的不同条件。通过在每孔边缘涂抹油脂实现严密密封。在硅化玻璃盖玻片上，将5微升浓缩蛋白质溶液与5微升储液溶液混合。将盖玻片倒置覆盖在含有储液的孔上。将板置于4摄氏度条件下培养晶体。使用一段冷冻环，挑取生长好的晶体并放入6毫升微量离心管中。加入50微升母液。然后，将试管转移至手套箱中。取5微升已制备的氮杂硼杂苯配体，转移至试管旋盖内侧。盖上管盖，置于手套箱内的冰箱中，通过蒸气扩散法平衡2至7天。之后，取一滴N型石蜡油滴加到玻璃载片上。使用微量移液器将晶体转移至载片。接下来，使用一段低温环状细管从水溶液中拾取晶体，并将其转移至N型石蜡油中。将带有N型石蜡油保护的晶体迅速浸入装有液氮的杜瓦瓶中。使用低温镊子将快速冷冻的晶体固定在环上。然后，按照文本方案中所述分析收集的晶体数据。本研究基于先前报道的方法，提出了一种改进的1,2-氮杂硼杂苯合成方法。采用三取代硼杂苯制备N-取代NTBSB-取代氯化物加合物。采用一锅两步法合成 NTBS BCl 1, 2-氮杂硼杂苯，其分离产率高于以往方法。N-H-B-乙基-1, 2-氮杂硼杂苯的合成通过两步完成，使用乙基锂替代先前报道方法中使用的铬配合物。该蛋白通过低压色谱系统进行纯化。在280纳米处运行的色谱图显示了一个与T4溶菌酶突变体L99am102q一致的峰。随后将蛋白质结晶并与配体形成复合物。在进行此操作时，需注意氮杂硼杂苯的合成需要使用无氧条件，例如手套箱和真空气体歧管，以防止化合物分解。该技术发展之后，为研究氮杂硼杂苯与经典生物修复区域中碳基芳香族化合物相比所具有的独特化学和物理性质开辟了道路。

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Research

科研

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Biochemistry

生物化学

1,2- Azaborines的合成及其蛋白复合物的用T4溶菌酶突变体的制备

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通过4-硝基亚硝基苯与炔酮的环加成反应直接、区域选择性且原子经济性地合成3-酰基-N-羟基-5-硝基吲哚

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对映体纯非活化氮杂环丙烷的制备及双酰胺B、D和epiallo-异蝇蕈醇的合成

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利用突变型甲硫氨酸tRNA合成酶小鼠品系从复杂组织中进行细胞类型特异性蛋白质纯化与鉴定

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制备用于区域选择性开环反应的连续双氮杂环丙烷

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抗菌肽及其模拟物的制备与检测

我们描述了用于在X射线自由电子激光器和同步辐射光源上进行序列晶体学实验的脂质立方相中膜蛋白微晶的制备与递送方法。这些方案也可应用于可溶性蛋白微晶的包埋与递送，与液体注射相比，可显著减少样品消耗。...

用于序列飞秒晶体学的脂质立方相中蛋白质微晶的制备与递送

学习1,2-氮杂硼烷的合成方法及其与T4溶菌酶突变体制备蛋白复合物的技术。该方法利用钯碳催化反应，为生物医学研究中的药物开发提供可靠的硼杂环化合物合成途径。

1,2-氮杂硼杂苯的合成及其与T4溶菌酶突变体蛋白复合物的制备

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