毛喉素诱导在肠组织体溶胀:一个体外检测方法的评估囊性纤维化患者对药物的反应

该程序的总体目标是使用毛喉素诱导的肿胀或 FIS 测定在囊性纤维化患者产生的肠道类器官中评估个体 CFTR 调节治疗疗效中的功能。这种方法解决了囊性纤维化领域的关键问题。最值得注意的是，它有助于识别可以从现有或实验性药物中长期受益的患者。

该技术的主要优点是，可以使用易于接近的组织从任何 CF 患者生成类器官，而与年龄无关。该技术的意义延伸到囊性纤维化的矫形疗法，并解决了当前以具有成本效益和个性化的方式测试药物疗效的迫切需求。来自 Hubrecht Organoid Technology 的 Marvin Statia 和来自 Jeffrey Beekman 集团的 Annelot Vonk 将演示该程序。

为了获得最佳的毛喉素诱导的溶胀测定数据，必须使用包含具有多个出芽的大类器官的培养物。鉴定出这种培养物后，用样品名称标记一个 15 ml 锥形管，并将一个管标记为洗涤管。接下来，使用 p1000 移液器小心地从类器官培养孔中吸出培养基，而不会干扰基底膜基质滴。

并向每个孔中加入 1 毫升基础培养基。现在使用移液器打碎每个孔中的基底膜基质液滴，并将得到的类器官悬浮液转移到带有样品名称的 15 毫升试管中。用另一毫米的基础培养基冲洗每个孔，然后将洗涤液拉入样品管中。

收集完所有样品后，用基础培养基填充样品管至最终体积为 12 mL，并使用预湿的 5 mL 移液器混合溶液。接下来，离心类器官，将沉淀重新悬浮在一毫升新鲜的基础培养基中。用不带过滤器的 p10 吸头盖住相同的 p1000 移液器吸头，并尝试对悬浮液进行 20 次评级。

然后丢弃两个吸头，并使用 5 毫升移液器向样品中加入 4 毫升新鲜基础培养基。将试管倾斜约 70 度，并使用新的预湿 p1000 移液器吸头将溶液剧烈混合 2 到 3 次。将试管保持在倾斜位置 10 秒钟。

然后使用相同的 p1000 移液器将顶部 1 毫升样品转移到洗涤过的试管中四次。收获最后一个样品后，通过离心收集类器官，并将沉淀重新悬浮在 120 微升 50% 基底膜基质中。然后将 3 微升液滴放在玻璃显微镜载玻片上，并在光学显微镜下确认液滴内存在至少 30 到 50 个类器官。

接下来，将 3 微升 oraganoid 液滴接种到 96 孔板的每个孔的中间，并将板放入 37 摄氏度的培养箱中 15 分钟，以固化基底膜基质。然后将 100 μL 全结肠培养基加 VX809 或单独全结肠培养基添加到适当的类器官孔中，并将板放回培养箱中 18 至 24 小时。第二天，使用连续移液管向每个孔中加入 10 微升钙溶液，用多通道移液器重悬孔一次以确保它们混合，然后将板放回培养箱中再放置 30 分钟。

在对细胞进行染色时，将活细胞成像共聚焦显微镜上的实时成像工具预设为 37 度和 5% 的二氧化碳，以预孵育成像室。孵育结束时，将板转移到共聚焦显微镜上的板架上，并使用智能设置选项选择 Alexa floor 488 轨道。接下来，将五个 ex 镜头和扫描区域设置为 0.6 倍，以缩小并捕获整个井。

调整激光功率和检测器灵敏度，以实现对背景上钙绿色标记的类器官的最佳检测。并将 位深度 设置为 8，将帧大小设置为 512 x 512 像素。使用 time series 选项设置测量时间、频率和间隔。

以及用于手动确定各个孔位置的平铺选项。现在将 100 微升新鲜制备的毛喉素和/或 VX770 添加到相应的孔中，从第一个要成像的孔开始，然后开始测量。由于囊性纤维化跨膜电导调节因子 （CFTR） 的功能障碍，大多数结肠囊性纤维化类器官体积紧凑，并且在毛喉素刺激后 60 分钟不肿胀或表现出非常轻微的肿胀，具体取决于它们的基因型。

然而，当 CF 类器官在毛喉素刺激之前用 CFTR 调节剂处理时，类器官表现出肿胀增加。为了量化肿胀，可以在每个时间点测量总钙绿表面积。一旦掌握，如果执行得当，这些技术可以在三四个小时内完成。

在尝试此过程之前，最重要的步骤是优化肠道类器官的培养条件，因为高质量的培养将决定 FIS 测定的最佳性能。观看此视频后，您将很好地了解如何使用肠道类器官培养物，并随后使用毛喉素诱导的肿胀测定法测量 CFTR 活性和 CFDR 调节剂反应。