Name: 毛喉素诱导在肠组织体溶胀:一个体外检测方法的评估囊性纤维化患者对药物的反应 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: 了解毛喉素诱导肠组织体溶胀检测方法，用于评估囊性纤维化患者CFTR功能及药物反应。该技术利用患者来源类器官实现个性化治疗策略。

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本研究得到了荷兰囊性纤维化基金会（NCFS）的HIT-CF项目、ZonMW（40-00812-98-14103）、威尔海米娜儿童医院研究基金以及CZ和Zilverenkruis/Achmea的资助。我们感谢S. Heida-Michel、M. Geerdink、K.M. de Winter-de Groot和G. Berkers（乌得勒支大学医学中心威尔海米娜儿童医院儿科呼吸科）以及R.H.J. Houwen（乌得勒支大学医学中心威尔海米娜儿童医院儿科消化科）在患者招募及获取活检样本以建立囊性纤维化生物样本库方面所做的贡献。

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<li>Van Goor, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ivacaftor+potentiation+of+multiple+CFTR+channels+with+gating+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cystic+Fibrosis%3A+Official+Journal+of+the+Eur+Cyst+Fibrosis%22%5BJournal%5D)">Ivacaftor potentiation of multiple CFTR channels with gating mutations.</a> Journal of Cystic Fibrosis: Official Journal of the Eur Cyst Fibrosis. 11 (3), 237-245 (2012).</li>
</ol>

Hans Clevers 是类器官培养技术和佛司可林诱导肿胀实验相关专利的发明人。Jeffrey M Beekman 是佛司可林诱导肿胀实验相关专利的发明人。Sylvia F Boj 和 Robert Vries 就职于 Hubrecht 类器官技术基金会（HUB），该机构拥有类器官技术的独家许可权。除此之外，作者无其他利益冲突需要披露。

本文提供了人源结直肠类器官的生成、扩增、冻存与复苏的完整实验方案。尽管我们此前已建立了人源类器官培养体系17，但其他实验室在缺乏实际操作培训的情况下，往往难以成功建立该技术。我们预期这些实验方案将可替代传统的操作培训。
Wnt-3A 条件培养基是成功建立并维持长期类器官培养的最关键试剂之一。事实上，类器官培养可能 &#34;碰撞&#34; 当暴露于低活性的Wnt-3A条件培养基时。由于Wnt-3A条件培养基为实验室自制，因此在制备具有活性的培养基时需考虑多个因素。只有使用高质量的胎牛血清（FBS）配制培养基，才能产生具有活性的Wnt-3A，因为高质量FBS可为L细胞提供适当的生长信号，并有助于疏水性Wnt-3A分子的稳定。当Wnt-3A活性较低时（即， 低 TOP/FOP 比值（见下文）通常是由胎牛血清（FBS）引起的问题。
商用重组Wnt效果较差，因此我们不建议将其用作TOP/FOP Wnt报告基因实验的阳性对照。TOP/Renilla与FOP/Renilla...

囊性纤维化（CF）由编码上皮细胞阴离子通道的囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）基因突变引起。全球约有85,000人受此疾病影响1。目前已鉴定出超过2,000种CFTR突变（<a href="http://www.genet.sickkids.on.ca">www.genet.sickkids.on.ca</a>）。这种突变的多样性部分解释了临床上观察到的广泛疾病表型（<a href="http://www.CFTR2.org">www.CFTR2.org</a>）2,3。根据CFTR蛋白表达和功能的影响，CFTR突变被分为六类：(I) 无蛋白合成，(II) 转运障碍，(III) 通道门控缺陷，(IV) 电导异常，(V) 正常功能CFTR蛋白水平降低，以及(VI) 细胞表面稳定性受损4。尽管常见CFTR突变已被广泛研究，但在个体水平上，CFTR功能与其临床状态之间的关系仍不明确，尤其是对于大量罕见的&#34;孤儿&#34;突变而言（<a href="http://www.CFTR2.org">www.CFTR2.org</a>）1,3。
近年来，已开发出针对CFTR蛋白的突变特异性药物。目前临床上使用的CFTR蛋白靶向药物分为两类，其作用机制各不相同。增效剂（如VX-770）可提高定位于细胞顶膜的突变型CFTR通道的开放概率，并在加入细胞后直接发挥作用5。校正剂（如VX-809）则可恢复内质网中错误折叠的CFTR蛋白的转运功能，但需在细胞中预先孵育一段时间后才能观察到效果6。CFTR增效剂VX-770已被批准用于携带G551D突变的患者7,8，以及另外八种CFTR门控突变（包括S1251N）的患者9；总体而言，这些突变存在于约5%的囊性纤维化患者中。其他临床试验表明，VX-770与校正剂VX-809联合使用，对携带F508del突变纯合子（存在于45-50%患者中）的个体肺功能具有有限但显著的改善作用，并可降低病情加重的发生率10,11。
在其余50%的囊性纤维化（CF）患者中，通过传统临床试验识别药物响应个体成本高昂且耗时漫长，对于携带极为罕见CFTR基因型的个体而言并不可行。因此，亟需开发新型、经济高效且个性化的研究方法，以将不断增多的CFTR调节剂精准匹配至携带各类CFTR突变的患者。迄今为止，针对携带特定CFTR突变患者群体的临床试验入组，主要依据是在异源细胞系统中转染突变CFTR基因后，通过Ussing chamber进行的电生理研究5,6,12。由于缺乏合适的CF动物模型，药物有效性研究通常采用来自CF肺组织移植材料的气液界面分化支气管上皮细胞进行药物开发13,14,15。然而，肺移植组织来源有限，且从非终末期疾病患者获取支气管细胞需侵入性操作，这限制了对较罕见CFTR突变的分析，也阻碍了个性化药物测试的实施。为克服这些局限，目前正探索使用诸如结肠类器官、鼻腔气道细胞以及由诱导多能干细胞衍生的气道细胞等&#34;易于获取&#34;的组织，用于个性化药物治疗。
此前，我们已建立了从任何胃肠道器官中以三维类器官形式培养上皮干细胞的方案16,17。对于人结肠/直肠组织，培养条件包括特定的生长因子（表皮生长因子（EGF）、胃泌素、Wnt-3A、R-脊椎蛋白3（Rspo3）和Noggin）以及小分子化合物（烟酰胺、A83-01和SB202190），并置于基底膜基质中进行培养。在此条件下，单个干细胞或微小组织片段可生长为封闭的囊状三维结构，其上皮细胞具有高度极性，基底面朝外。所有细胞类型均以正常的比例和位置出现。类器官可通过每周机械性传代和重新接种实现长期扩增。它们在遗传和表型上均保持稳定，并可被冻存，从而实现长期扩增和生物样本库保存17。此外，类器官适用于所有为二维细胞系开发的标准细胞生物学/遗传学操作及分析技术18。
我们最近证明，囊性纤维化跨膜电导调节因子（CFTR）功能可在结直肠类器官中通过佛司可林诱导肿胀（FIS）实验便捷地测定19,20。当暴露于佛司可林（Fsk）或霍乱毒素时，类器官会迅速升高其环磷酸腺苷（cAMP）水平，进而导致CFTR通道开放19。来自健康个体或携带具有残余功能的CFTR突变个体的类器官，会因离子和水向类器官腔内的转运而发生肿胀，这相当于体外的分泌性腹泻现象。in vitro研究表明，结直肠类器官的FIS反应完全依赖于CFTR，这一点已通过来自CFTR缺失个体的类器官以及特异性药理学CFTR抑制剂的使用得到证实19。在取活检后数周内，即可获得大量个体特异性的数据集。
本文详细描述的FIS检测中，类器官由直肠活检组织培养获得，该活检可在任何年龄进行且仅引起轻微不适21。类器官通过机械性分离为单个隐窝进行每周传代，这些隐窝易于自我封闭并形成新的类器官。进行FIS检测时，将约30–80个经机械分离的小类器官接种至96孔板的每个孔中19。在检测当日，使用钙黄绿素绿色（calcein green）对类器官进行染色，该荧光染料可穿透活细胞并在其中保留，便于活细胞成像。随后加入Fsk（forskolin），其可提高细胞内cAMP水平，从而激活CFTR，诱导类器官肿胀。作用于顶膜CFTR的增效剂与forskolin同时加入，而恢复CFTR转运功能的矫正剂则在加入Fsk前24小时添加。类器官肿胀程度通过自动图像分析进行量化，该分析计算在加入forskolin后各时间点所有荧光物体总面积相对于基线的增加倍数。
与在Ussing室中培养于二维气道细胞的传统电生理CFTR检测方法相比，三维类器官肿胀检测具有优势与局限性。其主要优势在于检测通量高。细胞培养和检测可使用同一种培养基完成，经验丰富的技术人员每周可培养多达25个类器官样本，并在12例患者样本中每周定量约1,200个数据点。我们通常在每块培养板上对单个实验条件设置双复孔或三复孔，并在三个独立的孵育时间点重复检测。总体而言，每个实验条件可测量约300–500个单独的类器官结构，从而实现对CFTR功能的高精度测定，技术变异性极低。这种高精度使我们能够清晰界定残余功能的差异以及对CFTR调节剂的反应差异，并可轻易检测到携带相同CFTR突变但遗传背景不同的患者之间的效应差异19,22,23,24,25。数据质量可通过显微镜图像轻松评估。尽管FIS完全依赖于CFTR，但它是一种间接的CFTR功能检测指标，其信号读出源于离子转运与液体转运的耦合效应。这与Ussing室中直接测量跨上皮离子电流的CFTR功能检测方法形成对比26。Ussing室允许选择性刺激顶膜或基底外侧膜（而类器官检测无法实现）；通过通透化基底外侧膜，可选择性测定顶膜CFTR依赖性阴离子分泌27。

<table><tbody><tr><td>高级DMEM&amp;rsquo;s 改良伊格尔培养基与F-12哈姆营养混合物（Ad-DF）500 ml&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技&amp;nbsp; Invitrogen</td><td>#12634</td><td>4 ℃ 保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>赛默飞世尔科技&amp;nbsp; Invitrogen</td><td>#35050</td><td>4 ℃ 保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>赛默飞世尔科技&amp;nbsp; Invitrogen</td><td># 15630-056</td><td>4℃保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>赛默飞世尔科技&amp;nbsp; Invitrogen</td><td>#15140-122</td><td>储存于 -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>96孔培养板</td><td>Cellstar</td><td>#655180</td><td></td></tr><tr><td>24孔培养板</td><td>Cellstar</td><td>#662160</td><td></td></tr><tr><td>6孔培养板</td><td>Cellstar</td><td>#657160</td><td></td></tr><tr><td>不含氯化钙的杜氏磷酸盐缓冲液&lt;sub&gt;2 &lt;/sub&gt;(-) MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;) (DPBS)</td><td>Life Technologies：Gibco</td><td>#14190-094</td><td>4 ℃下保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>杜尔贝科&amp;rsquo;s 改良伊格尔培养基&amp;nbsp; （DMEM）500 ml&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技&amp;nbsp; Invitrogen</td><td>#31966-021</td><td>用于Wnt-3A条件培养基的制备。4℃保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Bovogen</td><td>#SFBS 批号#11113</td><td>用于Wnt-3A条件培养基的制备。储存于-20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>L Wnt3A 细胞系</td><td>ATCC</td><td>#CRL-2647</td><td>用于Wnt-3A条件培养基的制备</td></tr><tr><td>TOP/FOP 质粒</td><td>Millipore&amp;nbsp;</td><td>#17-285</td><td>用于检测Wnt活性</td></tr><tr><td>pTK-Renilla</td><td>Promega&amp;nbsp;</td><td>#E2241</td><td>用于检测Wnt活性</td></tr><tr><td>HEK-293</td><td>ATCC</td><td>#CRL-1573</td><td>用于检测Wnt活性</td></tr><tr><td>双荧光素酶报告基因检测系统</td><td>Promega&amp;nbsp;</td><td>#E1910</td><td>用于检测Wnt活性</td></tr><tr><td>Zeocin&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技&amp;nbsp; Invitrogen</td><td>#R250-01</td><td>Wnt-3A 细胞系筛选</td></tr><tr><td>B27添加剂&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技&amp;nbsp; Invitrogen</td><td>#17504-044</td><td>储存于 -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>N-乙酰半胱氨酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#A9165-5G</td><td>储存于 -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>烟酰胺</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#N0636</td><td>储存于 -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>人表皮生长因子（hEGF）</td><td>PrepoTech</td><td>#AF-100-15</td><td>储存于 -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>胃泌素</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#G9145</td><td>储存于 -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>TGFb I型受体抑制剂（A83-01）&amp;nbsp;</td><td>Tocris</td><td>#2939</td><td>储存于 -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Y-27632 二盐酸盐（RhoKi）</td><td>Selleckchem</td><td>#S1049</td><td>储存于 -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>p38 MAPK抑制剂（p38i）（SB202190）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#S7067</td><td>储存于 -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen</td><td>#ant-pm-1</td><td>储存于 -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>人Noggin（hNoggin）</td><td>PrepoTech</td><td>#120-10C</td><td>储存于 -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>人R-脊椎蛋白3（hRspo-3）</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>#3500-RS/CF</td><td>储存于 -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>万古霉素</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#861987- 250毫克</td><td>储存于 -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>庆大霉素</td><td>Life Technologies：Gibco</td><td>#15710-049</td><td>储存于 -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸（EDTA）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#431788</td><td>4 ℃下保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>康宁</td><td>#354230</td><td>储存于 -80 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>TryplE Express&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies：Gibco</td><td>#12605-010</td><td>用于类器官冻存前的胰蛋白酶消化</td></tr><tr><td>复苏细胞培养冻存液</td><td>Life Technologies：Gibco</td><td>#12648010</td><td>用于冷冻</td></tr><tr><td>钙黄绿素</td><td>Life Technologies：Gibco</td><td>#C3100MP</td><td>储存于 -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>福斯科林</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>#1099-50 mg</td><td>储存于 -80 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Lumacaftor (VX-809)</td><td>Selleckchem</td><td>#s1565</td><td>储存于 -80 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Ivacaftor (VX-770)</td><td>Selleckchem</td><td>#s1144</td><td>储存于 -80 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;试剂/材料名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;溶剂&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;储存浓度&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;终浓度&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td></td><td>200 mM</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>Hepes</td><td></td><td>1 M</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td></td><td>10K U/ml 10K &amp;micro;g/ml</td><td>100 U/ml 100 &amp;micro;g/ml</td></tr><tr><td>Zeocin&amp;nbsp;</td><td></td><td>100 mg/ml&amp;nbsp;</td><td>125 &amp;micro;g/ml</td></tr><tr><td>B27添加剂&amp;nbsp;</td><td></td><td>100x</td><td>1x</td></tr><tr><td>N-乙酰半胱氨酸</td><td>MiliQ H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>500 mM</td><td></td></tr><tr><td>烟酰胺</td><td>DPBS</td><td>1 M</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>人表皮生长因子（hEGF）</td><td>DPBS 0.1% BSA</td><td>0.5 mg/ml</td><td>50 ng/ml</td></tr><tr><td>胃泌素</td><td>DPBS</td><td>100 &amp;micro;M</td><td>10 nM</td></tr><tr><td>TGFb I型受体抑制剂（A83-01）&amp;nbsp;</td><td>DMSO</td><td>5 mM</td><td>500 nM</td></tr><tr><td>Y-27632 二盐酸盐（RhoKi）</td><td>DMSO</td><td>10 mM</td><td>10 &amp;micro;M</td></tr><tr><td>p38 MAPK抑制剂（p38i）（SB202190）</td><td>DMSO</td><td>30 mM</td><td>10 &amp;micro;M</td></tr><tr><td>Primocin</td><td></td><td>50 mg/ml&amp;nbsp;</td><td>100 &amp;micro;g/ml</td></tr><tr><td>人Noggin（hNoggin）</td><td>DPBS 0.1% BSA</td><td>100 &amp;micro;g/ml</td><td>100 ng/ml</td></tr><tr><td>人R-脊椎蛋白3（hRspo-3）</td><td></td><td>因批次而异</td><td>300 ng/ml</td></tr><tr><td>万古霉素</td><td></td><td>10 mg/ml</td><td>50 &amp;micro;g/ml</td></tr><tr><td>庆大霉素</td><td></td><td>10 mg/ml</td><td>50 &amp;micro;g/ml</td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸（EDTA）</td><td>MiliQ H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>0.5 M</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>钙黄绿素</td><td>DMSO</td><td>10 &amp;micro;g/ml</td><td>3.3 ng/ml</td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>DMSO</td><td>10 mM</td><td>可变的</td></tr><tr><td>Lumacaftor (VX-809)</td><td>DMSO</td><td>20 mM</td><td>可变的</td></tr><tr><td>Ivacaftor（VX-770）</td><td>DMSO</td><td>20 mM</td><td>可变的</td></tr></tbody></table>

肠类器官中佛司可林诱导的肿胀：一种 体外 用于评估囊性纤维化患者药物反应的检测方法

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

近年来开发的囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）调节药物可纠正囊性纤维化（cystic fibrosis, CF）患者中突变型CFTR通道的表面表达和/或功能。由于CFTR突变存在广泛的异质性，以及其他影响个体药物疗效的未知因素，识别可能从这些药物中获益的患者具有挑战性。本文介绍一种简单且相对快速的检测方法，用于评估个体CFTR功能及其对CFTR调节剂的反应 体外三维（3D）上皮类器官由直肠活检组织在标准类器官培养基中培养生成。类器官建立后，可进行生物样本库保存，以供后续分析使用。在检测中，将30–80个类器官接种于96孔板中的基底膜基质内，并暴露于药物中。一天后，使用钙黄绿素绿色染料对类器官进行染色，并在37 °C条件下通过共聚焦活细胞显微镜监测佛司可林诱导的肿胀反应。佛司可林诱导的肿胀完全依赖于CFTR功能，且具有足够的敏感性和精确性，能够区分不同个体之间、甚至基因型相同个体之间的药物反应差异 CFTR 突变。 体外 肿胀反应与治疗的临床反应相关。该检测方法提供了一种经济有效的手段，用于识别对药物有反应的个体，且不受CFTR突变类型的影响。该方法还可能在未来的CFTR调节剂开发中发挥重要作用。

图1A 显示了嵌入基底膜基质（BMM）中的一例代表性新鲜分离隐窝。这些隐窝来自一名囊性纤维化（CF）患者的结肠直肠活检组织。通常情况下，每个隐窝可生成一个类器官（图1A–图1C）。由于CFTR功能障碍，大多数结肠CF类器官不呈囊状，而是结构致密，并带有突起和芽状结构（图2A–图2B）。然而，某些CF类器官培养物，尤其是具有较高残余功能的样本，会出现少量呈囊状形态的类器官（图2C），类似于野生型类器官培养物（图2D）。
在对类器官进行传代以扩增培养或接种FIS实验之前，类器官应具有较大的尺寸并形成多个出芽结构，如图3A所示。如果类器官在传代时体积较小且缺乏明显出芽，则会对其培养效果产生不...

本方案描述了一种用于检测囊性纤维化（CF）患者来源的培养组织中CFTR功能及CFTR调节剂反应性的实验方法。源自活检组织的肠道类器官在cAMP驱动下会发生肿胀，而囊性纤维化类器官中的这一反应存在缺陷（或显著减弱），通过暴露于CFTR调节剂可使该反应得以恢复。

近年来开发的囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）调节药物可纠正突变型CFTR的表面表达和/或功能……

本实验的总体目标是利用囊性纤维化患者来源的肠道类器官，通过佛司可林诱导肿胀（FIS）实验评估单个CFTR的功能，从而评价CFTR调节治疗药物的有效性。该方法解决了囊性纤维化研究领域中的关键问题，尤其有助于识别能够长期受益于现有或实验性药物治疗的患者。该技术的主要优势在于，可利用易于获取的组织，为任何年龄的囊性纤维化（CF）患者生成类器官。该技术的应用可拓展至囊性纤维化的个体化治疗，有助于以经济高效且个体化的方式检测药物疗效，满足当前迫切的需求。本次实验操作将由Hubrecht类器官技术中心的Marvin Statia和Jeffrey Beekman课题组的Annelot Vonk进行演示。为了获得最佳的佛司可林诱导肿胀实验数据，必须使用含有多个出芽的大类器官的培养物。确定此类培养物后，用样本名称标记一个15毫升锥形管，并将另一根管标记为“洗涤用”。接下来，使用P1000移液器小心吸取类器官培养孔中的培养基，注意不要扰动基底膜基质液滴。向每个孔中加入1毫升基础培养基。现在使用移液器将每个孔中的基底膜基质液滴吹打分散，然后将所得类器官悬液转移至标记样品名称的15毫升离心管中。用另1毫升基础培养基冲洗每个孔，并将冲洗液收集至同一样品管中。所有样品收集完毕后，用基础培养基将样品管补至终体积 12 毫升，并使用预先润湿的 5 毫升移液器混匀溶液。接着，离心类器官，将沉淀重悬于 1 毫升新鲜基础培养基中。用一个无滤芯的 p10 移液器吸头套住同一支 p1000 移液器吸头，反复吹打重悬液 20 次。然后丢弃两个吸头，使用5 mL移液器向样品中加入4 mL新鲜基础培养基。将离心管倾斜约70度，用新的预润湿的P1000移液器吸头剧烈吹打溶液2至3次。保持离心管处于倾斜状态10秒。然后使用同一支 p1000 移液器将样品上层一毫升液体分四次转移至已清洗的离心管中。最后一次样品收集完成后，通过离心收集类器官，并将沉淀重悬于 120 微升 50% 基底膜基质中。随后取 3 微升悬液滴加到玻璃显微镜载片上，在光学显微镜下确认液滴内至少含有 30 至 50 个类器官。接下来，将3 µL类器官液滴接种到96孔板每个孔的中央位置，然后将该板放入37°C培养箱中孵育15分钟，以使基底膜基质凝固。随后，向相应的类器官孔中加入100 µL完全结肠培养基加VX809，或仅加入完全结肠培养基，再将该板放回培养箱中继续孵育18至24小时。次日，使用多通道移液器向每孔加入10 µL钙溶液，并用多通道移液器将各孔重悬一次，以确保充分混匀，然后将该板再次放回培养箱中孵育30分钟。在细胞染色的同时，将活细胞成像共聚焦显微镜的活体成像工具预设为37摄氏度和5%二氧化碳，以对成像腔室进行预孵育。孵育结束后，将培养板转移至共聚焦显微镜的板架上，并使用智能设置选项选择Alexa Fluor 488通道。接着，设置5

forskolin-induced-swelling-intestinal-organoids-an-vitro-assay-for

Research

科研

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医学

毛喉素诱导在肠组织体溶胀：一个<em&gt;体外</em&gt;检测方法的评估囊性纤维化患者对药物的反应

本文描述了一种从小鼠小肠类器官中收获、维持并用病原体相关分子模式（PAMPs）和单核细胞增生李斯特菌（Listeria...

该 离体 小鼠肠道类器官的培养与模式识别受体刺激

本文介绍一种建立人鼻腔上皮细胞三维球状体培养的方法。通过刺激球状体，诱导其产生囊性纤维化跨膜电导调节因子（CFTR）依赖性的离子和液体分泌，并以球状体管腔大小的变化作为CFTR功能的指标进行定量分析。...

用于个体化囊性纤维化跨膜电导调节因子研究的人鼻上皮细胞球体的生成

本文提供了一项详细的实验方案，用于描述一种 体外...

人鼻上皮类器官的培养与成像

本方案描述了一种通过测量膜电位变化来研究生电性膜蛋白的方法。该检测方法为功能性读取上皮细胞系中内源性表达的多种离子通道提供了平台。...

一种基于荧光的膜电位检测方法，用于高通量功能研究两种上皮细胞系中的两种内源性离子通道

本文介绍了一种在双室可渗透支持系统中培养犬肠道类器官的实验方案。该方案详细描述了在可渗透支持膜上接种类器官、单层细胞的维持培养，以及后续的药物渗透性实验。...

犬类肠道类器官在双腔可渗透支撑系统中的应用

将活检来源的肠道类器官与器官芯片技术结合，构建出一种微生理系统平台，用以模拟特定区域的肠道功能。...

结合人类类器官与器官芯片技术模拟肠道区域特异性功能

本方案描述了一种用于囊性纤维化（CF）的新型诊断检测方法——直肠类器官形态学分析（ROMA）。形态学特征，即圆形度（圆形度指数，CI）和管腔的存在（强度比，IR），可作为CFTR功能的衡量指标。对189名受试者进行的分析显示，该方法能够完美区分CF与非CF个体。...

直肠类器官形态分析（ROMA）：囊性纤维化的诊断检测方法

类器官-成纤维细胞共培养为研究提供了模型 体内...

利用类器官共培养对食管成纤维细胞进行功能表征与可视化

在此，我们介绍一种用于生成大鼠肠道类器官并将其应用于多种下游实验的方案。大鼠常被作为首选的临床前模型，而稳定的肠道类器官系统填补了该领域对一种可靠的体外模型的需求。 体外 系统以配合 体内...

大鼠肠道类器官的生成与操作

本实验方案旨在通过免疫染色评估生物功能化自组装肽在细胞黏附、类器官形态及基因表达方面的作用。我们将使用结直肠癌细胞系，以提供一种经济高效的方法来获取用于高强度检测的类器官。...

利用超短自组装肽基质从SW1222细胞系构建和表征结直肠癌类器官

关键词：类器官，结直肠癌，SW1222细胞系，自组装肽，三维细胞培养，肿瘤模型，细胞外基质，癌症研究

本研究概述了一种从猪的小肠和大肠来源的类器官生成二维单层细胞的方案。这些单层细胞的生长伴随着跨上皮电阻（TEER）值的升高，表明上皮完整性良好。此外，在Ussing室实验中，施加佛司可林后，这些单层细胞表现出生理性的分泌反应。...

二维猪肠道类器官反映原生肠道的生理特性

了解毛喉素诱导肠组织体溶胀检测方法，用于评估囊性纤维化患者CFTR功能及药物反应。该技术利用患者来源类器官实现个性化治疗策略。

肠类器官中佛司可林诱导的肿胀：一种体外用于评估囊性纤维化患者药物反应的检测方法

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