活细胞中线粒体钙与线粒体膜电位的荧光显微镜同步检测

本实验的总体目标是提供一种简单的方法，利用共聚焦显微镜在活细胞中同时测量线粒体钙离子摄取和线粒体膜电位。该方法有助于回答线粒体研究领域中的关键问题，例如线粒体如何作为局部钙库来严格调控细胞内钙离子浓度。该技术的主要优势在于，无需进行基因操作，即可在活细胞中特异性地同时检测线粒体钙离子水平和线粒体膜电位。

尽管该方法可用于研究线粒体疾病病理中的钙调节，当尿钙调节至关重要时，也可用于研究其他较新的退行性疾病。在此实验步骤中，将细胞接种于10厘米细胞培养皿或75平方厘米培养瓶中，在37摄氏度培养基中培养24小时。收集细胞时，通过抽吸去除培养基，并用5毫升PBS洗涤细胞。

随后，用抽吸法去除 PBS。然后加入 1.5 毫升胰蛋白酶 EDTA，于 37 摄氏度孵育细胞 2 分钟。接着轻轻敲击培养皿以脱落细胞。

用5毫升培养基重悬细胞。随后使用血细胞计数板对细胞进行计数。共聚焦成像前一天，将细胞以60%至70%融合度接种于培养皿或带孔盖玻片中。

然后在37摄氏度下将细胞孵育过夜，以使细胞贴壁并恢复。在此步骤中，使用TMRM、Fluo 4 AM和表面活性剂配制记录染色液。移除培养基，并用100 µL PBS洗涤细胞。

接下来，移除 PBS，并在室温下用 100 微升记录染色液孵育细胞 45 分钟。随后，移除记录染色液，并用 100 微升无钙 HBSS 洗涤细胞，以去除过量的 Fluo 4 AM 和 TMRM。然后，用皂苷素（digitonin）、TMRM 和毒胡萝卜素（thapsigargin）配制细胞内成像溶液。

接下来，移除无钙的 HPSS，并向细胞中加入 300 微升 IM 成像溶液。在添加氯化钙进行成像前，将细胞在室温下平衡 10 分钟。使用约 5% 的低激光功率，以尽量减少对细胞的光损伤。

使用显微镜激光器的设置，匹配TMRM和Fluo 4 AM的激发和发射光谱。采用约5%的低激光功率和高增益，以尽量减少对细胞的光损伤。接下来，将显微镜设置为每25秒扫描一次图像。对细胞进行连续扫描10分钟，以建立TMRM和Fluo 4信号的基线读数。

然后暂停图像扫描，将3微升40毫摩尔氯化钙储备液直接加入含有300微升IM成像溶液的细胞中。用移液器轻轻混匀。向细胞中添加钙溶液时，注意不要移动显微镜载物台上的培养皿。

继续进行图像扫描约四分钟。然后每四分钟重复添加一次氯化钙，直至达到理想的TMRM或Fluo 4信号，通常需添加八到十次。随后，将一微摩尔FCCP以1:100稀释后直接加入细胞中，以消除内膜电位。

实验结束后，再对细胞成像五分钟。成像完成后，使用图像分析软件测定 Fluo 4 和 TMRM 信号的强度。具体操作为：打开图像，点击选择工具，选取包含线粒体的感兴趣区域。

可通过打开“分析”、“工具”、“ROI管理器”来选择多个感兴趣区域进行测量。单击“添加”以将选定的感兴趣区域纳入强度测量。重复前述步骤，直至所有感兴趣区域均已添加至ROI管理器中。

通过选择“多点测量”功能，测量每个感兴趣区域TMRM和Fluo 4信号的平均荧光强度。确保选中“测量所有切片”，并取消选中“每切片一行”。然后点击“确定”，以获得每个时间点各ROI的TMRM和Fluo 4信号平均荧光强度数据表。

然后合并数据，计算TMRM和Fluo 4信号的平均强度和标准偏差。在本实验中，143B细胞预先加载Fluo 4 AM和TMRM，随后用皂苷进行透化处理。每次加入氯化钙后，随着钙离子流入线粒体，线粒体膜电位消散，TMRM信号随之下降。

在通透性转换发生后，可观察到较小的膜电位，因为加入10 µM FCCP仍会诱导膜电位的崩溃。此处，线粒体钙浓度（以Fluo 4信号表示）在第二次加入氯化钙后开始上升，此时培养基中的游离钙浓度达到0.32 µM。每次后续添加氯化钙均导致线粒体钙浓度逐步升高。

图中显示了线粒体钙离子与膜电位的同时测量结果。红色信号代表TMRM，绿色信号代表Fluo 4。一旦掌握，该技术若操作得当，大约可在两小时内完成。

观看本视频后，您应能够很好地掌握如何通过向透化细胞中添加外源性钙，利用共聚焦显微镜同时检测线粒体钙水平和线粒体膜电位。请注意，FCCP 和皂苷（digitonin）的操作具有极高危险性，在进行该实验操作时，必须始终采取适当防护措施，例如穿戴个人防护装备（PPE）。