Name: 线粒体钙和线粒体膜的同时测量通过荧光显微镜活细胞的潜在 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: 学习利用共聚焦荧光显微镜同时测量活细胞线粒体钙摄取与膜电位的方法。该技术无需基因操作即可实时监测钙动态，为研究线粒体疾病及其他退行性病变提供重要工具。

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我们感谢莫纳什大学显微成像中心（Monash Micro Imaging）的 Kirstin Elgass 博士和 Sarah Creed 博士提供的技术支持，以及威康信托基金（Wellcome Trust）和英国医学研究理事会（Medical Research Council UK）提供的经费支持。MMcK 受澳大利亚研究理事会未来学者计划（Australian Research Council Future Fellowship Scheme，项目编号 FT120100459）、威廉·巴克兰基金会（William Buckland Foundation）、澳大利亚线粒体疾病基金会（The Australian Mitochondrial Disease Foundation, AMDF）、哈德逊医学研究所（The Hudson Institute of Medical Research）和莫纳什大学的资助。本研究得到了维多利亚州政府运营基础设施支持计划的资助。

1. 细胞的制备
<ol>
	<li>在 10 cm 细胞培养皿或 75 cm2 培养瓶中，使用培养基 [含 5% (v/v) 胎牛血清 (FBS) 和 1× 青霉素/链霉素 (p/s) 的 10 ml DMEM (Dulbecco 改良 Eagle 培养基)] 于 37 °C/5% CO2 条件下培养细胞。</li>
	<li>收集细胞时，通过抽吸去除培养基，然后用 5 ml 1× 磷酸盐缓冲液 (1× PBS) 洗涤。再次通过抽吸去除 1× PBS，加入 1.5 ml 0.25% (w/v) 胰蛋白酶/0.25% (w/v) 乙二胺四乙酸 (EDTA)，于 37 °C/5% CO2 条件下孵育 2 分钟。轻敲培养皿或培养瓶使细胞脱落，然后加入 5 ml 培养基重悬细胞。</li>
	<li>取 12 µl 重悬的细胞悬液加入血细胞计数板，进行细胞计数。</li>
	<li>将细胞接种于培养皿或带腔室的盖玻片上，用于共聚焦成像。 
	注意：所用培养皿或盖玻片应具有适合倒置显微镜观察的塑料或玻璃底材。</li>
	<li>接种细胞时，应使成像当天细胞融合度约为 80%。例如，可在成像前一日，将约 2 × 104 个 143B 骨肉瘤细胞接种至 8 孔腔室载玻片的一个孔中。</li>
	<li>将细胞于 37 °C/5% CO2 条件下孵育过夜，以使细胞贴壁并恢复状态。</li>
</ol>
2. TMRM 和 Fluo-4 成像用缓冲液
<ol>
	<li>配制含156 mM NaCl、3 mM KCl、2 mM MgSO₄的记录液（RS）4，1.25 mM KH2PO4，10 mM D-葡萄糖，2 mM CaCl2 和 10 mM HEPES（pH 7.35）。将 RS 分装后于&#160; -20 ºC</li>
	<li>配制含有 6 mM NaCl、130 mM KCl、7.8 mM MgCl₂ 的细胞内液（IM）2，1 mM KH2PO4，0.4 mM CaCl2，2 mM EGTA，10 mM HEDTA，2 mM 苹果酸，2 mM 谷氨酸，2 mM ADP 和 20 mM HEPES（pH 7.1）。苹果酸、谷氨酸和 ADP 可分别配制成 200 mM 储存液，分装后于 -20 °C 保存。使用前可将这些储存液直接加入 IM 中。</li>
	<li>Ca2+ 无钙 Hank's 平衡盐溶液（HBSS）可从商业供应商处购买预配制成品。加入乙二醇双（β-氨基乙基醚）四乙酸（EGTA），使其终浓度为 500 µM。</li>
	<li>配制10 mM四甲基罗丹明甲酯高氯酸盐（TMRM）的甲醇（100%）储备液。从中配制2 µM的工作液，使用蒸馏水稀释H2O.</li>
	<li>用100%乙醇配制10 mM维拉帕米储备液。</li>
	<li>配制 1 mg/ml (w/v) 的 Fluo-4 乙酰甲氧基酯（Fluo-4, AM）在二甲基亚砜（DMSO）中的储备液。 
	注意：Fluo-4, AM 是一种钙离子指示剂，与 Ca²⁺ 结合后荧光增强2+Fluo-4 是 fluo-3 的一种类似物，其两个氯取代基被氟原子取代。这使得 Fluo-4 在 488 nm 处的荧光激发效率提高，并产生更强的荧光信号。AM 酯基团使 Fluo-4 分子呈电中性，因而能够穿透细胞膜。进入细胞后，AM 酯基被非特异性酯酶水解，生成带电荷的 Fluo-4 形式，从而被滞留在细胞内。</li>
	<li>在100%乙醇中配制1 mM羰基氰化对-三氟甲氧基苯腙（FCCP）储备液。</li>
	<li>配制 25 mg/ml (w/v) 的皂苷素（digitonin）蒸馏水储备液2O.</li>
	<li>在DMSO中配制100 µM毒胡萝卜素储备液。</li>
	<li>配制 40 mM 氯化钙（CaCl₂）储备液2) 于蒸馏 H2O.</li>
</ol>
3. 使用TMRM和Fluo-4, AM对细胞进行染色
<ol>
	<li>在RS溶液中配制RS染色液，其中含20 nM TMRM、5 µg/ml (w/v) Fluo-4, AM 和0.005%的表面活性剂（如Pluronic F-127）。 
	注意：该表面活性剂为非离子型聚醇，有助于Fluo-4, AM的溶解。若所分析的细胞类型表达质膜多药耐药转运蛋白，可额外加入10 µM维拉帕米以抑制TMRM的外排。</li>
	<li>用移液器吸除细胞培养基，并用100 µl 1× PBS洗涤细胞。</li>
	<li>用移液器吸除1× PBS，将细胞置于250 µl RS染色液中，在室温下孵育45分钟。 
	注意：Fluo-4, AM进入细胞后，其AM酯键会被细胞内的酯酶水解。在室温下孵育可抑制酯酶活性，从而使Fluo-4, AM得以进入线粒体。</li>
	<li>用移液器吸除RS染色液，并用100 µl无Ca2+ HBSS洗涤细胞，以去除多余的Fluo-4, AM和TMRM。</li>
	<li>在IM溶液中配制IM成像液，其中含25 µg/ml (w/v) 皂苷（digitonin）、200 nM TMRM 和1 µM毒胡萝卜素（thapsigargin）。 
	注意：皂苷的浓度可能需要调整，以确保不导致线粒体内膜通透化。可通过在不同皂苷浓度下评估TMRM信号强度，凭经验确定最佳浓度。</li>
	<li>用移液器吸除无Ca2+ HBSS，并向细胞中加入300 µl IM成像液。将细胞在室温下平衡10分钟。此时细胞已准备好进行添加CaCl2后的成像实验。</li>
</ol>
4. 细胞成像
<ol>
	<li>将含有细胞的培养皿或带孔盖玻片置于倒置激光扫描共聚焦显微镜上，加入IM成像溶液。</li>
	<li>调整显微镜激光设置，以匹配TMRM和Fluo-4的激发与发射光谱。例如，分别使用543 nm的He-Ne激光和473 nm的氩离子激光激发TMRM和Fluo-4。使用约5%的低激光功率，以尽量减少对细胞的光损伤。</li>
	<li>设置显微镜每25秒扫描一次图像。连续扫描细胞10分钟，以建立TMRM和Fluo-4信号的基础值。 
	注意：在静息钙浓度下，Fluo-4信号可能较弱或无法检测。</li>
	<li>在300 μl的IM成像溶液中，直接加入3 μl的40 mM CaCl2储备液（1:100稀释），并用移液器轻轻混匀。如需，可在添加和混匀CaCl2时暂停图像扫描。 
	注意：IM成像溶液中游离Ca2+离子的最终浓度[Ca2+]可通过Maxchelator WEBMAXC EXTENDED（<a href="http://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html">http://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html</a>）或Chelator11等软件计算。第6节中详细描述了如何计算最终游离Ca2+离子浓度[Ca2+]。</li>
	<li>继续图像扫描约4分钟，之后每隔4分钟重复一次CaCl2添加，直至达到所需的TMRM或Fluo-4信号，通常需添加8至10次。</li>
	<li>使用移液器，直接向细胞中加入1 mM FCCP的1:100稀释液（终浓度为10 μM），以消除ΔΨm。再继续成像5分钟。实验至此结束。</li>
</ol>
5. 图像分析
<ol>
	<li>成像完成后，使用图像分析软件（例如安装了 Bio-Formats 插件的 ImageJ 软件）测定 Fluo-4 和 TMRM 信号的强度（从 http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/ 下载 'bioformats_package.jar' 文件，并将其保存至 'C:\Program Files\ImageJ\plugins' 文件夹中）。</li>
	<li>在 ImageJ 中打开成像文件（例如 .oif 文件）。点击选择工具，选取包含线粒体的感兴趣区域（ROI）。使用初始的 TMRM 信号来确定 ROI。</li>
	<li>打开“分析&#62;工具&#62;ROI 管理器”，点击“添加”以将选定的 ROI 加入强度测量列表。可在单张图像上选择多个 ROI 进行测量。重复前述步骤，直至所有 ROI 均已添加至 ROI 管理器。</li>
	<li>点击“更多&#62;多测量”，确保勾选“测量所有切片”且未勾选“每切片一行”，然后点击“确定”，以获得每个时间点各 ROI 的 TMRM 和 Fluo-4 信号平均荧光强度数据表。</li>
	<li>利用所有 ROI 的数据，计算 TMRM 和 Fluo-4 信号的平均强度及其标准差。</li>
</ol>
6. 计算最终游离 Ca2+ 离子浓度 [Ca2+]
<ol>
	<li>IM成像溶液中游离Ca2+离子浓度[Ca2+]可通过软件（如Maxchelator WEBMAXC EXTENDED（<a href="http://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html">http://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html</a>）或Chelator11）进行计算。例如，在WEBMAXC EXTENDED中设置以下变量：温度 = 24 °C，pH = 7.1，离子强度 = 0.162，EGTA = 0.002 M，HEDTA = 0.01 M，Ca2+ = 0.0004 M，Mg2+ = 0.0078 M。由此计算得到最终游离Ca2+离子浓度[Ca2+]为62 nM。需注意，这些程序无法考虑所有变量，例如试剂纯度、测量准确性和pH测定的误差。测定游离Ca2+浓度最准确的方法是使用经校准的Ca2+选择性电极。</li>
</ol>

<ol><li>Szabadkai, G., Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%3A+the+hub+of+cellular+Ca2%2B+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology%22%5BJournal%5D)">Mitochondria: the hub of cellular Ca2+ signaling.</a> Physiology. 23, 84-94 (2008).</li>
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<li>Rao, V. K., Carlson, E. A., Yan, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+permeability+transition+pore+is+a+potential+drug+target+for+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial permeability transition pore is a potential drug target for neurodegeneration.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1842, 1267-1272 (2014).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

钙在许多细胞过程中发挥着关键作用，包括肌肉收缩、神经元信号传导以及细胞增殖13。细胞内钙浓度的升高通常与能量需求相关，钙可直接刺激线粒体氧化磷酸化，从而提高ATP的生成3。因此，我们必须具备有效监测线粒体钙积累的能力，并能够比较遗传因素和药理学试剂对这一功能的影响。
方案中的关键步骤
本方案描述了使用 Fluo-4, AM 和 TMRM 同时监测线粒体钙积累和线粒体膜电位（ΔΨm）的方法。在染色过程中，关键步骤是在室温下孵育细胞，以优化 Fluo-4, AM 对线粒体钙的检测效果。室温孵育可降低细胞质酯酶的活性，使不带电荷的 Fluo-4, AM 能够穿过线粒体膜进入线粒体基质。相反，在 37 °C 孵育会增强细胞质中酯酶的活性，导致 AM 酯基被切除，生成带电荷的 Fluo-4 荧光染料，从而无法有效穿过线粒体膜。
细胞染色完成后，将细胞浸入线粒体成像溶液（I...

线粒体通过作为细胞内局部 Ca2+ 缓冲剂，在调节细胞内 Ca2+ 浓度方面发挥重要作用1。Ca2+ 通过 Ca2+ 单向转运体进入线粒体，该过程由线粒体内膜两侧存在的电化学梯度（ΔΨm）驱动2。一旦进入线粒体基质，Ca2+ 可通过激活三羧酸循环中的三种限速脱氢酶来促进氧化磷酸化3。这种激活作用可维持 ΔΨm，而该电势在正电性的钙离子跨过线粒体内膜进入基质时会暂时消散。当线粒体内 Ca2+ 浓度过高时，可能诱发线粒体通透性转换，导致 ΔΨm 消散、氧化磷酸化停止，并激活细胞死亡信号通路4。
线粒体在细胞钙离子的空间缓冲中发挥着重要作用，因此准确监测线粒体钙离子水平至关重要。目前已建立多种监测线粒体钙离子的方法，包括使用基于罗丹明的染料。其中一种染料Rhod-2, AM可有效靶向线粒体，用于检测线粒体内的Ca2+水平5,6。然而需谨慎使用，因为部分染料可能在其他细胞器（如脂质体）中积聚，或滞留在细胞质中。尽管如此，可通过后续分析手段将这些信号与线粒体来源的信号区分开来7。
另一种监测线粒体钙的方法是利用荧光报告基因构建体8。这类基因编码探针的优势在于，可通过内源性N端肽将其特异性靶向至线粒体，例如人细胞色素c氧化酶（COX）亚基VIII的N端靶向信号。该系统已被用于构建靶向线粒体的水母发光蛋白（aequorin）探针，在研究线粒体钙信号方面已证明极为有效9。这类基因编码探针的主要缺点是需要通过瞬时转染将探针导入细胞（某些细胞类型无法实现瞬时转染，且结果可能存在较大变异性），或构建稳定表达系统（耗时较长）。
为克服上述问题，我们开发了一种新方案，可同时测量线粒体 Ca2+ 和 ΔΨm。该方案基于先前描述的一种向透化细胞中添加外源性钙的方法10。与其它方法相比，本方案具有三个主要优势：首先，我们使用 Fluo-4, AM 和 TMRM 来监测线粒体 Ca2+ 和 ΔΨm，这两种染料具有截然不同的光谱特性；其次，细胞经过透化处理，使得 Fluo-4 信号仅检测线粒体内的 Ca2+，而不会受到其他细胞器或细胞质中 Ca2+ 的干扰；第三，使用 Fluo-4 检测线粒体 Ca2+ 可实现快速且简便的细胞染色，避免了使用基因编码探针时可能存在的细胞转染或转化问题。

<table><tbody><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）</td><td>ThermoFisher</td><td>10566016</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>ThermoFisher</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>1×磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>ThermoFisher</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>100×青霉素/链霉素（p/s）</td><td>ThermoFisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>0.25%胰蛋白酶/0.25% EDTA</td><td>ThermoFisher</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>8孔腔室盖玻片</td><td>ibidi</td><td>80826</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>793566</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746452</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>795488</td><td></td></tr><tr><td>D-葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746495</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>HEDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8126&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>苹果酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1000</td><td></td></tr><tr><td>谷氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1626</td><td></td></tr><tr><td>ADP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5285</td><td></td></tr><tr><td>无Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;汉克斯平衡盐溶液（HBSS）&amp;rsquo;&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>四甲基罗丹明甲酯高氯酸盐（TMRM）</td><td>ThermoFisher</td><td>T668</td><td></td></tr><tr><td>维拉帕米</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V4629</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4乙酰甲酯（Fluo-4, AM）</td><td>ThermoFisher</td><td>F14201</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>ThermoFisher</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>羰基氰化物对-三氟甲氧基苯腙（FCCP）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2920</td><td></td></tr><tr><td>皂苷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D141</td><td></td></tr><tr><td>毒胡萝卜素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9033</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>P3000MP&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>VWR</td><td>631-0925</td><td></td></tr><tr><td>10 cm细胞培养皿</td><td>Corning</td><td>COR430167</td><td></td></tr><tr><td>75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;细胞培养瓶</td><td>Corning</td><td>COR430641</td><td></td></tr></tbody></table>

活细胞中线粒体钙与线粒体膜电位的荧光显微镜同步检测

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

除了在生成ATP中的关键作用外，线粒体还作为局部钙（Ca2+) 缓冲液以严格调控细胞内 Ca2+ 浓度。为此，线粒体利用其内膜两侧的电化学势能（ΔΨm) 以螯合 Ca2+. Ca²⁺的内流2+ 进入线粒体后可刺激三类限速脱氢酶，从而增强三羧酸循环中电子通过氧化磷酸化（OXPHOS）复合体的传递。这种刺激作用可维持ΔΨm，这种电势会在正钙离子穿过线粒体内膜进入线粒体基质时暂时消散。
本文介绍一种利用共聚焦显微镜在活细胞中同时检测线粒体 Ca2+ 摄取和线粒体膜电位（ΔΨm）的方法。通过细胞透化处理，可使用荧光 Ca2+ 探针 Fluo-4, AM 检测线粒体内的 Ca2+ 水平，同时采用荧光染料四甲基罗丹明甲酯高氯酸盐（TMRM）检测 ΔΨm。该系统的优势在于两种荧光染料的光谱重叠极少，因而能够实现对线粒体 Ca2+ 和 ΔΨm 的精确同步测量。通过依次加入定量的 Ca2+ 溶液，可实时监测线粒体对 Ca2+ 的摄取过程，并确定 Ca2+ 诱导线粒体膜通透性转换及 ΔΨm 丧失时的临界浓度。

我们已采用该方案研究MT-ND5突变对143B细胞线粒体缓冲钙离子浓度升高能力的影响12。在本示例中，对照组143B细胞在经皂苷透化前，先加载TMRM和Fluo-4, AM。成像5分钟后，依次加入8次40 mM外源性CaCl2的1:100稀释液，并计算最终游离Ca2+离子浓度[Ca2+]。
每次CaCl₂处理后2 此外，随着 Ca 的内流，TMRM 信号减弱2+ 离子进入线粒体会使线粒体膜电位 ΔΨ 消散m (图1). ΔΨm 随后随着呼吸作用增强以维持ΔΨ而恢复m。这在每次CaCl之后发生四次2 添加。第五次添加后，线粒体 Ca2+ 离...

线粒体可利用其内膜上的电化学势能（ΔΨm）来摄取钙离子（Ca2+），从而调控细胞质内的Ca2+信号。本文介绍一种利用荧光染料和共聚焦显微镜在活细胞中同时检测线粒体Ca2+摄取和ΔΨm的方法。

除了在生成ATP中的关键作用外，线粒体还可作为局部钙离子（Ca2+）缓冲池，以严格调控细胞内Ca2+水平……

本实验的主要目标是提供一种简单的方法，利用共聚焦显微镜在活细胞中同时测量线粒体钙离子摄取和线粒体膜电位。该方法有助于解答线粒体研究领域中的关键问题，例如线粒体如何作为局部钙库，严格调控细胞内钙离子浓度。该技术的主要优势在于，无需进行基因操作，即可在活细胞中特异性地同时检测线粒体钙离子水平和线粒体膜电位。尽管该方法可用于研究线粒体疾病病理中的钙调节，当尿钙调节至关重要时，也可用于研究其他较新的退行性疾病。在此实验步骤中，将细胞接种于10厘米细胞培养皿或75平方厘米培养瓶中，在37摄氏度培养基中培养24小时。收集细胞时，通过抽吸去除培养基，并用5毫升PBS洗涤细胞。随后，吸除 PBS。然后加入 1.5 毫升胰蛋白酶 EDTA，于 37 摄氏度孵育细胞 2 分钟。接着轻拍培养皿，使细胞脱落。用5毫升培养基重悬细胞。随后使用血细胞计数板对细胞进行计数。共聚焦成像前一天，将细胞以60%至70%融合度接种于培养皿或腔室载玻片中。然后在37摄氏度下孵育细胞过夜，以使细胞贴壁并恢复。在此步骤中，使用TMRM、Fluo 4 AM和表面活性剂配制记录染色液。移除培养基，并用100微升PBS洗涤细胞。接下来，去除 PBS，并在室温下用 100 微升记录染色液孵育细胞 45 分钟。随后，去除记录染色液，并用 100 微升无钙 HBSS 洗涤细胞，以去除过量的 Fluo 4 AM 和 TMRM。然后，用皂苷素（digitonin）、TMRM 和毒胡萝卜素（thapsigargin）配制细胞内成像溶液。接下来，移除无钙的 HPSS，并向细胞中加入 300 µL 的 IM 成像溶液。在添加氯化钙进行成像前，将细胞在室温下平衡 10 分钟。使用约 5% 的低激光功率，以尽量减少对细胞的光损伤。使用显微镜激光器的设置，针对TMRM和Fluo 4 AM的激发和发射光谱进行调整。采用约5%的低激光功率并配合高增益，以尽量减少对细胞的光损伤。随后将显微镜设置为每25秒扫描一次图像。对细胞连续扫描10分钟，以建立TMRM和Fluo 4信号的基线读数。然后暂停图像扫描，将3微升40毫摩尔氯化钙储备液直接加入含有300微升IM成像溶液的细胞中。用移液器轻轻混匀。向细胞中添加钙溶液时，注意不要移动显微镜载物台上的培养皿。继续成像扫描约四分钟。随后每四分钟重复加入氯化钙，直至达到理想的TMRM或Fluo 4信号，通常需添加八到十次。之后，将一微摩尔FCCP以1:100稀释后直接加入细胞，以消除内膜电位。然后在实验结束前再对细胞成像五分钟。成像完成后，使用图像分析软件测定 Fluo 4 和 TMRM 信号的强度。操作方法为：打开图像，点击选择工具，选取包含线粒体的感兴趣区域。可通过打开“分析”、“工具”、“ROI管理器”来选择多个感兴趣区域进行测量。单击“添加”以将选定的感兴趣区域纳入强度测量。重复前述步骤，直至所有感兴趣区域均已添加至ROI管理器。通过选择多点测量功能，测量每个感兴趣区域的TMRM和Fluo 4信号的平均荧光强度。确保选中“测量所有切片”，并取消选中“每切片生成一行”。然后点击“确定”，以获得每个时间点下各ROI的TMRM和Fluo 4信号平均荧光强度的数据表。然后合并数据，计算 TMRM 和 Fluo 4 信号的平均强度和标准差。在本实验中，143B 细胞在经皂苷处理通透化之前，预先加载了 Fluo 4 AM 和 TMRM。每次添加氯化钙后，随着钙离子流入线粒体，线粒体膜电位逐渐消散，TMRM 信号随之降低。在通透性转换发生后，膜电位轻微，因为加入10 µM FCCP仍会诱导膜电位的崩溃。此时，由Fluo 4信号指示的线粒体钙浓度在第二次加入氯化钙后开始上升，此时培养基中的游离钙浓度达到0.32 µM。每次后续加入氯化钙均导致线粒体钙浓度逐步升高。此处展示的是线粒体钙离子与膜电位同时测量的图像。红色信号代表 TMRM，绿色信号代表 Fluo 4。一旦掌握，该技术若操作得当，约需两个小时即可完成。观看本视频后，您应能够很好地掌握如何通过向透化细胞中添加外源性钙，利用共聚焦显微镜同时测量线粒体钙水平和线粒体膜电位。请务必注意，使用FCCP和皂苷（digitonin）时可能存在极高危险性，进行该实验操作时应始终采取预防措施，例如穿戴个人防护装备（PPE）。

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本方案旨在逐步描述一种检测SH-SY5Y细胞分离线粒体的Ca2+保留能力及Ca2+诱导线粒体肿胀的方法。...

线粒体 Ca2+ 保留能力检测与 Ca2+ 诱导的线粒体肿胀检测

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分离线粒体与培养细胞中线粒体钙离子内流的分析

本文演示了以下实验方案：（1）新鲜分离完整的大脑微血管内皮“管状结构”；（2）在内皮依赖性超极化过程中，同步测量内皮细胞的钙离子浓度和膜电位。此外，这些方法允许将内皮细胞的钙信号和电学信号作为独立或交互的实验变量进行药理学调控。...

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本技术描述了一种有效的工作流程，利用基于荧光的活细胞成像方法，在HeLa细胞中对线粒体膜电位和超氧化物水平进行可视化及定量检测。...

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学习利用共聚焦荧光显微镜同时测量活细胞线粒体钙摄取与膜电位的方法。该技术无需基因操作即可实时监测钙动态，为研究线粒体疾病及其他退行性病变提供重要工具。

活细胞中线粒体钙与线粒体膜电位的荧光显微镜同步检测

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