Name: 主机表型的考试食蚊鱼继抗生素治疗 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: 了解抗生素治疗后宿主表型变化的实验方法，使用食蚊鱼模型研究微生物组破坏对宿主健康的影响。该技术简单经济，可非侵入性地评估脊椎动物生理表型变化。

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本项目部分资金来自萨姆休斯顿州立大学 EURECA（提升本科生科研体验与创造性活动中心）授予 TPP 和 JMC 的 FAST（教师与学生团队）奖项。

所有动物实验均在IACUC批准的实验方案（编号：14-05-05-1018-3-01、13-04-29-1018-3-01和14-04-17-1018-3-01）下进行。
1. 动物采集、操作与伦理护理
<ol>
	<li>使用小抄网从野外采集点收集Gambusia affinis（鉴定指南见 http://www.sms.si.edu/irlspec/Gambusia_affinis.htm），并放入19升的桶中。通过目视检查进行物种鉴定。</li>
	<li>将鱼置于装有池塘水的桶中静置1–2天&#160;。随后，将鱼转移至76升或189升的水族箱中，水族箱内装有半池塘水和半自来水的混合液，水温维持在25 °C，并使用气石持续曝气。操作鱼类时应使用小抄网，以尽量减少对其皮肤微生物组的干扰。 
	注意：鱼类密度不应超过每38升水体20尾。实验前，鱼类需在水族箱中适应至少5天。</li>
	<li>每日按每尾鱼5 mg的量投喂薄片饲料。维持12小时光照/12小时黑暗的光周期。</li>
</ol>
2. 所有实验的初始抗生素暴露
<ol>
	<li>从同一水族箱中取出每个实验的所有鱼类，分为两个独立的组（处理组：暴露于抗生素） &amp;#38; 对照：未暴露）置于19升桶中。先前收集的数据表明，同一水族箱中的鱼类皮肤微生物组具有均一性，其群落组成变异很小。12</li>
	<li>实验过程中，将鱼饲养在2 L人工池塘水（APW；0.33 g/L CaCl₂）中2，0.33 g/L MgSO₄4，0.19 g/L NaHCO₃3经高压灭菌后使用。</li>
	<li>将50 mg/mL的利福平加入二甲基亚砜（DMSO）中，配制利福平抗生素储备液。利福平是一种典型的广谱抗生素，对鱼类无毒性。在人和小鼠中，该药物在组织中分布良好。</li>
	<li>从利福平储备液中加入终浓度为25 µg/mL至2 L APW中，用于处理组鱼类的抗生素暴露，持续3天。注意，3天后，可培养的皮肤细菌数量恢复至与处理前鱼类皮肤相似的水平。</li>
	<li>同时，将一组未经处理的鱼置于APW中，并向水体中加入等量的DMSO（每升APW加入0.5 mL），作为对照组。</li>
	<li>由于实验旨在测量经抗生素改变的微生物组对鱼类表型的影响，为避免抗生素本身产生的直接效应，在为期三天的抗生素暴露（或对照）处理后，将鱼类转移至含有2升新鲜APW的水桶中。
	<ol>
		<li>使用10小时的休息期，以便鱼类机体将抗生素清除。该消除时间应基于鱼类暴露于25 μg/mL抗生素三天的实验数据。通过剪断脊髓并随后进行毁髓法处死鱼类，然后使用组织研磨器对整个鱼体进行匀浆处理。</li>
		<li>通过将50 μL经0.2 µm滤膜过滤后的悬液置于琼脂培养皿中央来检测抗生素的存在。用倒置的无菌200 μL移液器吸头在琼脂中压出小孔，以容纳该悬液，此操作可移除一小块琼脂形成孔洞。</li>
		<li>使用含有20 mL营养琼脂的培养皿，用棉拭子均匀涂布指示菌株。 枯草芽孢杆菌，对利福平敏感。获取 B. subtilis 从25 °C过夜培养的营养琼脂上，用棉签挑取单菌落。在25 °C过夜培养后观察到抑菌圈，表明鱼组织中存在抗生素。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 微生物组提取
<ol>
	<li>通过将鱼放入装有 2 mL 无菌 PBST（137 mM NaCl、10 mM 磷酸盐、0.1% Tween-20，pH 7.4）溶液的无菌 15 mL 锥形管中，并以 10 档涡旋振荡 1 分钟（每 10 秒暂停一次），从外黏膜表皮提取皮肤微生物组样本。缓冲液中的洗涤剂和盐有助于细菌在溶液中均匀分散。使用 0.85% 生理盐水可获得类似结果，但纯水会导致细菌计数降低。</li>
	<li>将鱼从锥形管转移至恢复桶中。皮肤取样导致的致死率通常低于 10%。可立即分析管中的细菌悬液，或在室温下以 15,000 × g 离心 2 分钟收集菌体，并于 -80 °C 保存以供后续分析。 
	注意：所有培养和生化分析均需立即进行；DNA 或蛋白质提取可使用冷冻样品。</li>
	<li>为获取肠道微生物组样本，首先将鱼置于无菌培养皿中。使用手术剪在头部后方切断颈脊髓以实施安乐死，随后进行脑脊髓破坏，再用 70% 乙醇擦拭液对外部体表进行消毒。</li>
	<li>解剖后，从食管后端至肛门前端完整取出整个肠道。</li>
	<li>将肠道切成 1–2 mm 长的小段，全部放入含有 2 mL PBST 溶液的锥形管中。涡旋振荡 1 分钟后，将上清液转移至另一干净试管中（注意避免吸入肠道组织段）。 
	注意：上清液中含有提取的肠道细菌，可用于直接分析，或采用前述皮肤样本的方法离心收集菌体。</li>
</ol>
4. 特定病原体感染模型的制备与处理
<ol>
	<li>获取一种感染性菌株 Edwardsiella ictaluri (E. ictaluri) 并将培养物保存于 -80 °C。本研究中使用的菌株 93 - 146 来源于感染的鲶鱼，由密西西比州立大学兽医学院 Mark Lawrence 提供。</li>
	<li>划线接种 E. ictaluri 选择性培养基上的菌种 &amp;#38; 鉴别培养基称为 E. ictaluri EIM 琼脂培养基19 培养细菌，并在27 °C下孵育2天。</li>
	<li>从培养物中转移一个纯的单菌落，接种于含有40 mL营养肉汤（NB；5 g/L蛋白胨，4 g/L牛肉浸膏）的150 mL三角瓶中。将三角瓶置于摇床中，150 rpm振荡培养2天。&#160;在 27 °C 下。</li>
	<li>孵育后，用 PBST 稀释培养物样品，使其在 650 nm 处的分光光度读数为 0.2 OD，以进行校准 E. ictaluri 培养以获得所需感染剂量的体积。</li>
	<li>接着将处理后的样本（处理3天后）转移&#160;将抗生素暴露组和未处理组的鱼分别放入盛有130 mL新鲜人工池塘水（APW）的独立塑料杯中，处理约10小时&#160;用于药物从鱼类组织中的清除。</li>
	<li>然后，从两组中分别再次转移每条鱼至含有130 mL清洁APW的8盎司塑料杯中。</li>
	<li>给每条鱼注射致死剂量，包含 2.8 x 10 6 CFU/mL E. ictaluri 将培养物接种至APW（浴染感染模型）中，置于27 °C培养箱内孵育24 h。</li>
	<li>之后 E. ictaluri 将鱼单独转移至含有130 mL APW的新杯子中。</li>
	<li>换水后，记录一周内的鱼类死亡率。在此期间不进行喂食。与鲶鱼不同的是， Gambusia 无明显的外部感染症状，因此必须将死亡率作为实验终点。</li>
</ol>
5. 粪便多微生物攻击 &amp;#38; 土壤
<ol>
	<li>粪便处理
	<ol>
		<li>使用无菌手套和无菌的50 mL锥形管，从过去两周内未使用抗生素的健康志愿者处获取新鲜的人类粪便样本。</li>
		<li>采集后，先将粪便收集到无菌塑料袋中，再转移至无菌的15 mL锥形管内。通过将粪便悬浮于PBST中，制备浓度为500 - 800 mg/mL的储备液。由于该混合物较粘稠，建议使用底部经无菌剪刀剪开、口径较大的1 mL或更大规格的塑料移液枪头进行转移。</li>
		<li>在抗生素处理组和未处理对照组鱼类初次暴露于抗生素后，将其分别放入含有粪便悬液的独立塑料杯中，最终浓度分别为15 mg/mL或10 mg/mL，溶剂为APW，总体积为130 mL。将塑料杯置于25 °C培养箱中孵育。</li>
		<li>在粪便暴露期间，通过密切观察记录鱼类在2天内的死亡情况。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>土壤处理
	<ol>
		<li>采集约7 - 15 cm深度的富含有机质的表层土壤1 - 2 kg（应含有最高密度和多样性的微生物），放入洁净的塑料容器中。注意土壤应在采集后两天内使用。</li>
		<li>在初次暴露期结束后，将经抗生素处理和未处理的两组鱼类分别转移至含有18.2 g土壤和130 mL APW的独立塑料杯中。在加入鱼类前，用手充分搅动水中土壤。大部分颗粒物不会悬浮，而是沉于杯底。</li>
		<li>在25 °C条件下暴露鱼类3天，并记录任何死亡情况。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 渗透压应激挑战
<ol>
	<li>按照上述方法处理并经过10小时休息期后，将鱼单独放入含有17.5 mg/mL（300 mM）NaCl的150 mL APW的独立容器中。该盐度为典型海水盐度的一半，对对照组鱼而言不完全致死（&#60;50%），但具有强烈应激性，需要有效的渗透调节能力。</li>
	<li>在36小时内观察鱼的死亡情况。</li>
</ol>
7. 硝酸盐毒性挑战
<ol>
	<li>抗生素处理后，将鱼静置10小时，然后将鱼分至单独的容器中，每个容器含有130 mL APW，并分别添加10 mg/mL（118 mM）或17.5 mg/mL（206 mM）的硝酸钠。</li>
	<li>记录4天内的死亡率&#160;低剂量和1天&#160;高剂量。</li>
</ol>
8. 个体化或分组鱼类的生长分析
<ol>
	<li>在桶中分组完成为期3天的抗生素暴露或对照处理。</li>
	<li>对于个体测量，将每个8盎司的聚苯乙烯泡沫杯中加入150 mL APW，将一条鱼转移至杯中，并记录其初始总体重。
	<ol>
		<li>对处理组和未处理组中的所有鱼重复此步骤。使用白色聚苯乙烯泡沫杯而非透明塑料杯，因为鱼在透明杯中不会进食。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>每天按标准饮食喂食，每条鱼喂两粒饲料。选用颗粒饲料而非薄片饲料，因为颗粒饲料的单粒质量变异较小（每粒3.53 ± 0.42 mg，变异率为8%），可确保鱼摄食量相近。通过目视记录未食用的颗粒来监测摄食情况。通常摄食率高于80%。</li>
	<li>在连续4周的每周结束时测定鱼的体重。准备一个装有新鲜APW的新杯子，将其置于天平上并记录重量。然后，将鱼从原杯中倒入捞网，转移至新杯中，再次称重。操作中不直接接触鱼体，以避免造成应激。</li>
	<li>对于群体测量，向19 L桶中加入2 L APW，并将天平归零。在将两组鱼转移至新的APW桶时保持群体状态，然后记录群体总重量。在一个月的时间内，每周通过转移至新桶的方式记录一次鱼群的总体重。</li>
</ol>
9. 肠道通过时间
<ol>
	<li>使用荧光素标记的70 kDa阴离子葡聚糖。葡聚糖不易被显著降解，且分子过大无法穿过肠道层被吸收，因此其通过情况可用于测定肠道传输时间。将标记的葡聚糖掺入鱼饲料中。</li>
	<li>在无菌的1.7 mL离心管中加入360 μL无菌去离子水和52 mg明胶（制成13%溶液），并将离心管置于60 °C的加热块上，直至明胶完全融化并溶解。
	<ol>
		<li>使用研钵和研杵将金鱼饲料薄片研磨成细粉，取40 mg该粉末加入上述离心管中，并加入20 μL鱼油。混匀后，加入1.6 mg FITC-葡聚糖。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将热的液体混合物滴加到实验台上的Parafilm表面，每滴20 μL，使其迅速冷却并凝固。这些液滴在变得过于坚硬而无法被鱼类摄食前，可保存最多4 d&#160;。将Parafilm放置于培养皿的一半中，再将该培养皿漂浮在密封塑料容器内的无菌水中，以保持液滴湿润，并将整个装置存放于冰箱中。</li>
	<li>喂食前，用剃刀片将每滴凝固的饲料切成四等份。将每条鱼单独放入泡沫杯中，适应环境2天且不喂食（注意：仅使用未暴露处理的对照组鱼）。向盛有鱼的杯子中加入四分之一份饲料，观察每条鱼在30分钟内摄食的饲料片数。</li>
	<li>开始监测时，用捞网将每条鱼单独转移至含有80 mL APW的杯子中。每隔2 h，手动轻轻搅动APW，然后取1 mL样品，置于已标记的1.7 mL离心管中，并在4 °C保存。持续取样共36 h。</li>
	<li>在完成检测后，使用荧光分光光度计统一测定所有样品的荧光强度。将全部1 mL样品加入比色皿中，设置激发波长为495 nm，发射波长为520 nm，记录测得的荧光值。</li>
</ol>

<ol><li>Panda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-Term+Effect+of+Antibiotics+on+Human+Gut+Microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+ONE%22%5BJournal%5D)">Short-Term Effect of Antibiotics on Human Gut Microbiota.</a> PloS ONE. 9 (4), 95476(2014).</li>
<li>Perez-Cobas, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+microbiota+disturbance+during+antibiotic+therapy%3A+a+multi-omic+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Gut microbiota disturbance during antibiotic therapy: a multi-omic approach.</a> Gut. 62 (11), 1591-1601 (2013).</li>
<li>Theriot, C. M., Young, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+and+metabolic+interactions+between+the+gastrointestinal+tract+and+Clostridium+difficile+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Gut+Microbes%22%5BJournal%5D)">Microbial and metabolic interactions between the gastrointestinal tract and Clostridium difficile infection.</a> Gut Microbes. 5 (1), 86-95 (2014).</li>
<li>Buffie, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision+microbiome+reconstitution+restores+bile+acid+mediated+resistance+to+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Precision microbiome reconstitution restores bile acid mediated resistance to Clostridium difficile.</a> Nature. 517, 205-208 (2015).</li>
<li>Sekirov, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic-Induced+Perturbations+of+the+Intestinal+Microbiota+Alter+Host+Susceptibility+to+Enteric+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Antibiotic-Induced Perturbations of the Intestinal Microbiota Alter Host Susceptibility to Enteric Infection.</a> Infect Immun. 76 (10), 4726-4736 (2008).</li>
<li>Looft, T., Allen, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collateral+effects+of+antibiotics+on+mammalian+gut+microbiomes%5BTitle%5D)+AND+%22Gut+Microbes%22%5BJournal%5D)">Collateral effects of antibiotics on mammalian gut microbiomes.</a> Gut Microbes. 3 (5), 463-467 (2012).</li>
<li>Magnadottir, B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15950491">Innate immunity of fish.</a> Fish Shellfish Immunol. 20 (2), 137-151 (2006).</li>
<li>Gomez, D., Sunyer, J., Salinas, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mucosal+immune+system+of+fish%3A+the+evolution+of+tolerating+commensals+while+fighting+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Fish+Shellfish+Immunol%22%5BJournal%5D)">The mucosal immune system of fish: the evolution of tolerating commensals while fighting pathogens.</a> Fish Shellfish Immunol. 35 (6), 1729-1739 (2013).</li>
<li>Nunes, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+Effects+of+Tetracycline+Exposure+in+the+Freshwater+Fish+Gambusia+holbrooki%3A+Antioxidant+Effects%2C+Neurotoxicity+and+Histological+Alterations%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Environ+Contam+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Acute Effects of Tetracycline Exposure in the Freshwater Fish Gambusia holbrooki: Antioxidant Effects, Neurotoxicity and Histological Alterations.</a> Arch Environ Contam Toxicol. 68 (2), 331-381 (2014).</li>
<li>Fryxell, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+ratio+variation+shapes+the+ecological+effects+of+a+globally+introduced+freshwater+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Sex ratio variation shapes the ecological effects of a globally introduced freshwater fish.</a> Proc Biol Sci. , 22(2015).</li>
<li>Nunes, B., Miranda, M. T., Correia, A. T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27074930">Absence of effects of different types of detergents on the cholinesterase activity and histological markers of mosquitofish (Gambusia holbrooki) after a sub-lethal chronic exposure.</a> Environ Sci Pollu Res Int. , 1-8 (2016).</li>
<li>Leonard, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://file.scirp.org/pdf/AiM_2014051916164703.pdf">The Skin Microbiome of Gambusia affinis Is Defined and Selective.</a> Adv Microbiol. 4, 335-343 (2014).</li>
<li>Carlson, J. M., Hyde, E. R., Petrosino, J. F., Manage, A. B. W., Primm, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+host+effects+of+Gambusia+affinis+with+an+antibiotic-disrupted+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Biochem+Physiol+C+Toxicol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">The host effects of Gambusia affinis with an antibiotic-disrupted microbiome.</a> Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 178, 163-168 (2015).</li>
<li>Karsi, A., Gulsoy, N., Corb, E., Dumpala, P. R., Lawrence, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+bioluminescence-based+mutant+screening+strategy+for+identification+of+bacterial+virulence+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">High-throughput bioluminescence-based mutant screening strategy for identification of bacterial virulence genes.</a> Appl Environ Microbiol. 75 (7), 2166-2175 (2009).</li>
<li>Hawke, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Edwardsiellosis+caused+by+Edwardsiella+ictaluri+in+Laboratory+Populations+of+Zebrafish+Danio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22J+Aquat+Anim+Health%22%5BJournal%5D)">Edwardsiellosis caused by Edwardsiella ictaluri in Laboratory Populations of Zebrafish Danio rerio.</a> J Aquat Anim Health. 25 (3), 171-183 (2013).</li>
<li>Petrie-Hanson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Zebrafish+Danio+rerio+as+a+Model+for+Enteric+Septicemia+of+Catfish+%28ESC%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Aquat+Anim+Health%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Zebrafish Danio rerio as a Model for Enteric Septicemia of Catfish (ESC).</a> J Aquat Anim Health. 19 (3), 151-158 (2007).</li>
<li>Fultz, R. S., Primm, T. P. A Laboratory Module for Host-Pathogen Interactions: America's Next Top Model. J. Microbiol. Biol. Educ. 11, abstract 20-B (2010).</li>
<li>Uliano, E., Cataldi, M., Carella, F., Migliaccio, O., Iaccarino, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+acute+changes+in+salinity+and+temperature+on+routine+metabolism+and+nitrogen+excretion+in+gambusia+%28Gambusia+affinis%29+and+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Biochem+Physiol+A%22%5BJournal%5D)">Effects of acute changes in salinity and temperature on routine metabolism and nitrogen excretion in gambusia (Gambusia affinis) and zebrafish (Danio rerio).</a> Comp Biochem Physiol A. 157, 283-290 (2010).</li>
<li>Shotts, E. B., Waltman, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+medium+for+the+selective+isolation+of+Edwardsiella+ictaluri%5BTitle%5D)+AND+%22J+Wildl+Dis%22%5BJournal%5D)">A medium for the selective isolation of Edwardsiella ictaluri.</a> J Wildl Dis. 26, 214-218 (1990).</li>
<li>Under animal toxicity studies, sodium chloride entry. TOXNET - Hazardous Substances Data Bank. , National Library of Medicine. Available from:
 <a target="_blank" href="https://toxnet.nlm.nih.gov/">https://toxnet.nlm.nih.gov/</a> (2016).</li>
<li>Under animal toxicity studies, sodium nitrate entry. TOXNET - Hazardous Substances Data Bank. , National Library of Medicine. Available from:
 <a target="_blank" href="https://toxnet.nlm.nih.gov/">https://toxnet.nlm.nih.gov/</a> (2016).</li>
<li>Under animal toxicity studies, sodium nitrite entry. TOXNET - Hazardous Substances Data Bank. , National Library of Medicine. Available from:
 <a target="_blank" href="https://toxnet.nlm.nih.gov/">https://toxnet.nlm.nih.gov/</a> (2016).</li>
<li>Vilz, T. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Assessment+of+Intestinal+Motility+and+Gut+Wall+Inflammation+in+Rodents%3A+Analyses+in+a+Standardized+Model+of+Intestinal+Manipulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Functional Assessment of Intestinal Motility and Gut Wall Inflammation in Rodents: Analyses in a Standardized Model of Intestinal Manipulation.</a> J Vis Exp. (67), e4086(2012).</li>
<li>Katoh, H. International Harmonization of Laboratory Animals. National Research Council (US) International Committee of the Institute for Laboratory Animal Research. Microbial Status and Genetic Evaluation of Mice and Rats: Proceedings of the 1999 US/Japan Conference. , National Academies Press. (2000).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

某些实验设计在抗生素处理后需要在清洁的人工池水（APW）中设置一段恢复期，以确保药物在鱼体组织中被充分清除。如果跳过恢复期，残留的抗生素可能干扰实验结果，尤其是在涉及细菌暴露的检测中。为了在不显著改变宿主微生物总数的前提下研究微生物组组成变化所造成的影响，有必要在抗生素处理期间开展预实验，监测微生物组组成（如通过16S扩增子测序或全基因组测序）以及微生物种群密度（例如通过qPCR进行16S定量）。尽管在此系统中3 d&#160;为最佳时长，但若更换宿主物种和/或抗生素，则需要重新校准处理时间。
在生物医学研究中，小鼠模型常被用于微生物组研究，而最常见的鱼类模型是斑马鱼。为了更好地理解黏膜微生物组结构与功能及其与宿主相互作用的普遍特性，亟需采用新的、非典型的模型。我们的野生型（WT）鱼类模型包含了自然宿主的遗传多样性，能够真实地反映宿主与微生物组之间的相互作用，而其他模型由于实验室饲养动物经过多代近交繁殖，已丧失了这种遗传变异性24。Gambusia 的一个主要实验优势在于其强健的特性，能够耐受广泛的环境条件。在水温（...

已有研究证实，抗生素会破坏人体微生物组，导致菌群失调，即微生物群落失衡。抗生素治疗后，微生物群落结构的改变已被证明会降低群落多样性，减少关键菌种，并改变群落代谢，尤其是在肠道中1,2。抗生素对肠道微生物组的干扰可能削弱其对Clostridium difficile3,4和Salmonella5的定植抗性。
此外，微生物群的紊乱已被证实与人类多种综合征和疾病的发生相关（例如， 抗生素相关性肠炎，炎症性肠病，代谢紊乱 等等。抗生素还被广泛应用于农业中，作为家畜和家禽养殖的生长促进剂。6这些强大工具的使用并非没有副作用，这一点在抗生素耐药性的迅速上升以及微生物组失衡对其宿主产生的影响中已显而易见。许多研究表明，广谱抗生素的使用会对微生物群落的结构和功能造成长期影响，然而，由抗生素引起的微生物组紊乱进而影响宿主生理功能的副作用，目前仍停留在推测阶段，尚未得到充分证实。
宿主、微生物群与抗生素之间的相互作用远未被清晰理解。因此，采用一种简单且更易于操作的模型有助于阐明高度复杂的哺乳动物系统。人体的黏膜表面（包括肠道）拥有最高密度和多样性的微生物，同时也是微生物与宿主相互作用最密切的部位。鱼类的黏膜皮肤微生物组作为一个模型系统具有多项优势。 辐鳍鱼纲 （硬骨鱼类）是脊椎动物中最早分化出来的谱系之一 脊索动物门 这意味着硬骨鱼类具有先天性和获得性免疫系统，这些系统与共生细菌群落共同进化出了一种相互关系。7鱼类皮肤与哺乳动物的I型黏膜表面在生理功能、免疫组分以及黏液分泌细胞的排列等方面具有诸多相似特征8鱼类皮肤黏膜表面位于外部，易于进行实验操作和取样。
西方食蚊鱼， Gambusia affinisG. affinis是一种模式鱼类，过去常被用于研究交配行为和毒理学9,10,11由于其体型小、在野外作为入侵物种数量丰富、养护成本低且生命力强，我们已开发出 G. affinis 作为黏膜微生物组模型。此外， Gambusia 与胎生哺乳动物一样具有产下活体幼崽的生理特征，这在鱼类物种中较为罕见。我们当时完成了最全面的鱼类皮肤正常微生物群研究，采用16S测序技术对 Gambusia12进一步的研究表明，使用广谱抗生素破坏皮肤和肠道微生物群后，对宿主产生三种负面影响。13.
在鱼类暴露于抗生素后，研究了五种不同的效应。微生物组对宿主最明确的益处是通过竞争性排斥病原体。鱼类病原体Edwardsiella ictaluri已知可在商业鲶鱼养殖场中引起肠道败血症暴发14。E. ictaluri也被证实可致死性感染斑马鱼15,16和Gambusia17。通过水体暴露于该病原体可作为评估排斥能力的指标。为了与单一病原体易感性进行比较，还进行了在高密度混合微生物暴露条件下的存活实验。粪便和富含有机质的土壤被用作常见的微生物群落来源。
肠道菌群的另一个已知功能是营养物质的加工和能量的摄取，从而影响宿主整体的营养吸收。作为营养状况的粗略衡量指标，比较了鱼类在标准饲料喂养一个月前后体重的变化。经抗生素处理的鱼类平均体重下降，而对照组鱼类在一个月内平均体重增加。这种体重未能增加的机制尚不明确。一个可能的影响因素是食物在肠道内的通过时间。一种胃肠道动力学方法借鉴自斑马鱼研究（Adam Rich，纽约州立大学布罗克波特分校，个人交流），用于测定食物通过时间。目前尚未确定经抗生素处理的鱼类是否存在肠道通过时间的改变。
所有生物，尤其是鱼类，在自然环境中普遍面临的一种挑战是渗透压胁迫。Gambusia 在高盐度急性胁迫下已被证明能够迅速适应18。令人意外的是，经抗生素改变其微生物组的鱼类在高盐胁迫下的存活率降低。这一新表型的机制目前仍在研究中。对水生动物的另一种常见胁迫，尤其是在水族环境中，是有毒形态的氮（如氨、硝酸盐和亚硝酸盐）。在对抗硝酸盐胁迫方面，经抗生素处理的鱼类与对照组鱼类的存活率无显著差异。本论文所介绍的方法可用于Gambusia或类似的鱼类模式生物（如斑马鱼和青鳉鱼），以检测实验干预后鱼类的表型变化。

<table><tbody><tr><td>利福平</td><td>Calbiochem</td><td>557303-1GM</td><td></td></tr><tr><td>硝酸钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5506</td><td></td></tr><tr><td>荧光素标记的70 kDa阴离子葡聚糖</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D1823</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）片剂</td><td>Calbiochem</td><td>6500-OP</td><td>片剂溶于水后形成PBS</td></tr></tbody></table>

抗生素处理后对gambusia affinis宿主表型的观察

Examination of Host Phenotypes in Gambusia affinis Following Antibiotic Treatment

抗生素在医学中的广泛应用意味着理解其对宿主造成的后果至关重要。抗生素常常会降低宿主微生物组群落的多样性，并改变微生物群落的组成。许多疾病，如抗生素相关性肠结肠炎、炎症性肠病和代谢紊乱，均与微生物群失衡有关。宿主、微生物组与抗生素之间复杂的相互作用需要一个可操作的模型来研究宿主与微生物组之间的相互关系。我们的淡水脊椎鱼类是一种有用的模型，可用于研究黏膜微生物组结构与功能的普遍特征，以及分析因改变微生物群落而引发的宿主效应。研究方法包括宿主挑战实验，例如已知鱼类病原体感染、暴露于粪便或土壤微生物、渗透压应激、硝酸盐毒性、生长分析以及肠道蠕动功能测定。这些技术展示了一个灵活且实用的模型系统，可用于快速确定宿主表型。

研究抗生素暴露对鱼类宿主影响的实验系统总体示意图13 以……表示 图1A 并包括提取皮肤的技术（图1B）和肠道（图1C) 从鱼类中获取微生物组。选择3天作为抗生素处理周期，是因为先前的数据显示，尽管治疗初期可培养的皮肤细菌总数迅速下降，但在3天后已恢复至处理前水平；与此同时，通过16S谱型分析确定的菌群组成已发生显著改变。因此，3天的时间点最适合用于分析在大致相同菌群密度下因群落结构变化所造成的影响。需要注意的是，采用琼脂平板上的菌落数量进行培养分析时，可能会遗漏部分物种。皮肤微生物组分散方法的效率（图1B) 通过比较悬浮缓冲液平板上的菌落数量进行分析（通常在10范围内4 - 105 CFU/g 鱼体重）与接受相同悬浮处理的多条鱼第二次处理后的菌落数量进行比较（以量化残留细菌）。第二次悬浮处理后的计数低于 100 CFU/g，表明该悬浮方法有效（未...

本研究涉及通过抗生素改变模式鱼类宿主的皮肤和肠道微生物群落&#160;组成后，揭示其对宿主影响的方法。

抗生素处理后对Gambusia affinis宿主表型的观察

抗生素在医学中的普遍使用意味着了解其对宿主造成的后果至关重要。抗生素通常会降低宿主……

本实验体系的总体目标是研究抗生素治疗后对宿主生物体产生的负面副作用。因此，该方法有助于回答微生物组领域中的关键问题，例如由抗生素相关副作用引起、并通过菌群紊乱介导的宿主健康影响。该技术的主要优势在于，该体系操作简便、成本低廉，可用于检测脊椎动物宿主的生理表型，同时能够实现对黏膜微生物组的非侵入性干扰。该技术的意义在于阐明动物微生物组的紊乱如何导致严重的副作用。首先，将先前获得并冷冻保存的爱德华氏菌（Edwardsiella ictaluri）感染菌株划线接种于爱德华氏菌选择性鉴别培养基（E.Ictaluri selective and differential medium）琼脂平板上。在27°C条件下培养两天。从培养物中转移一个纯的分离菌落，接种至含有40毫升营养肉汤的150毫升锥形瓶中。将锥形瓶置于摇床培养箱中，在27摄氏度、150转/分钟条件下培养两天。培养结束后，为校准E.Ictaluri培养物以获得所需的感染剂量体积，使用PBST将培养物样品稀释至650纳米处的光密度（OD 650）为0.2。收集食蚊鱼（Gambusia affinis）后，将鱼置于水体中用利福平处理三天。随后，将经抗生素处理和未经处理的对照组鱼分别转移至盛有130毫升新鲜人工池塘水（APW）的独立塑料杯中，静置约10小时，以清除鱼体内的药物。接着，再次将鱼分隔至盛有130毫升洁净APW的独立8盎司塑料杯中。向每条鱼接种致死剂量的E. Ictaluri菌液，并在27°C条件下孵育24小时。完成E. ictaluri浸浴后，将每条鱼转移至含有130毫升APW的新杯子中。在不喂食的情况下，记录为期一周的鱼死亡率。收集粪便物质并放入无菌塑料袋中，然后转移至无菌15毫升锥形管中，使用PBST配制粪便物质的储备浓度为每毫升500至800毫克；使用剪去尖端的1毫升或更大塑料移液管，制备每杯130毫升含15毫克/毫升或10毫克/毫升粪便物质的APW溶液。将经抗生素处理或未处理的鱼分别转移至含有溶液的独立杯中，在25摄氏度下孵育两天，期间密切观察并记录死亡情况。若需用土壤处理鱼类，采集1至数公斤富含有机质的表层土壤（深度约7至15厘米），转移至洁净的塑料容器中。准备若干单独的塑料杯，每杯加入18.2克土壤和130毫升APW，用手充分混匀土壤，然后将经抗生素处理或未处理的鱼放入杯中，于25摄氏度下放置三天，同时记录任何死亡情况。在使用抗生素处理后，于APW中静置10小时，将鱼转移至含有17.5毫克/毫升氯化钠和APW的独立杯子中，观察鱼36小时内的死亡情况。为进行硝酸盐毒性挑战，在如前所述静置10小时后，将鱼分至独立杯子中，杯子中分别含有10或17.5毫克/毫升硝酸钠及130毫升APW。在高剂量硝酸钠条件下，观察鱼一天内的死亡情况；在低剂量条件下，观察四天内的死亡情况。在完成为期三天的群体抗生素或对照暴露后，对于单尾鱼，使用150毫升APW填充8盎司的聚苯乙烯杯，在称量装满液体的杯子重量后，将鱼转移至杯中，随后记录总体重以进行初始评估。每天每条鱼投喂两粒饲料，通过目视记录未食用的饲料颗粒来监测摄食情况。在为期四周的实验期间，每周结束时测定鱼的体重：首先称量一杯新鲜APW的重量并记录，然后将鱼倒入捞网中，转移至新的杯子，再次称量杯子的总重量。对于群体饲养的鱼，将150毫升APW倒入杯中，并将天平归零。将两组鱼在转移至新的APW容器时保持在一起，然后记录总群体重量。在一个月内每周结束时重复称重。为分析肠道通过时间，向无菌的1.7毫升离心管中加入360 µL无菌去离子水和52 mg明胶，并将其置于60 °C的加热块上，直至明胶完全融化并溶解。使用研钵和研杵将金鱼饲料薄片研磨成细粉，取40毫克粉末加入离心管中，并加入20微升鱼油。混匀后，加入1.6毫克FitC葡聚糖。将20微升热液体滴加到实验台面上的Parafilm上，使其迅速冷却并凝固。将Parafilm置于培养皿的一半上，漂浮于密封塑料容器内的无菌水表面。将凝固后的液滴在冰箱中保存，最多可存放四天，以免变得过硬而影响鱼类摄食。喂食前，用刀片将液滴切成四等份。将鱼类放入单独的泡沫杯中适应两天，期间不喂食，然后将四分之一份食物放入鱼杯中，观察每条鱼在30分钟内摄食的食物片数。开始监测时，将单条鱼转移至含有80毫升APW的杯子中，每隔两小时取1毫升样品，置于预先标记的1.7毫升离心管中，于4摄氏度保存。完成检测后，取全部一毫升样品放入比色皿中，并使用荧光分光光度计在激发波长495纳米、发射波长520纳米的条件下，同时记录所有样品的荧光信号。如图所示，抗生素处理导致微生物组改变的鱼类比对照组鱼类更易感染爱德华氏菌（E. Ictaluri）。经处理组与对照组鱼类的平均死亡时间差异无统计学意义。这可能是由于样本量较小所致。该图表表明，与对照组鱼类相比，暴露于利福平的鱼类对渗透压胁迫更为敏感；在本实验中，当盐度超过每毫升18毫克时，鱼类迅速死亡。如本表格所示，当暴露于水体中的硝酸盐毒素时，预先接触抗生素处理并未影响鱼类的存活率。在 10 毫克/毫升浓度下，抗生素处理组和对照组在 90 小时均观察到 50% 的致死率。在本实验中，使用水族箱中的对照鱼类，向其投喂两段或一段 FitC 葡聚糖标记的食物，通过随时间测量周围水中的荧光强度来检测食物通过时间。在此步骤之后，可进一步开展其他方法，如测量总体脂储存量和定量皮肤黏液分泌，以了解其作用机制，并缩小可能导致宿主产生负面效应的混杂因素。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

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