Name: 成年小鼠视网膜电生理研究水平切片的制备 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: 学习成年小鼠视网膜水平切片制备技术，用于研究水平细胞和双极细胞等水平方向神经元的功能。该方法保留突触回路完整性，支持膜片钳记录和成像，助力视觉信息处理研究。

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本研究由德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft）DFG FOR701 和 A.F. 获得的 FE464/11-1 项目资助。作者谨此感谢 Andrea Nerz 提供的出色技术协助。

所有操作均按照德意志联邦共和国发布的动物实验指南进行。
注意：由于视网膜组织在该实验的较长时间内将处于缺氧状态，所有步骤均应尽快完成。小鼠在解剖前至少需进行3小时的暗适应。为避免视网膜发生光适应，制备和切片过程应在暗红光条件下进行。
1. 培养基及其他化学试剂的准备
<ol>
	<li>配制 Ames 培养基6。解剖后，视网膜组织必须始终浸没在 Ames 培养基中。
	<ol>
		<li>将 2.2 g Ames 培养基和 298 mg HEPES 溶解于 250 ml 蒸馏水中，HEPES 的终浓度为 5 mM。轻轻搅拌，直至所有成分完全溶解。</li>
		<li>在室温下用碳氧混合气体（95% 氧气，5% 二氧化碳）向 Ames 培养基中通气至少 5 分钟。使用玻璃巴斯德吸管将气体导入溶液，并通过合适的管路将巴斯德吸管连接至气体调节器的出口。</li>
		<li>向溶液中加入 475 mg 碳酸氢钠。在通气后加入碳酸氢盐可防止碳酸钙沉淀。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制低凝胶温度琼脂糖。在振动切片过程中，需使用琼脂糖包埋视网膜组织。
	<ol>
		<li>将 180 mg 琼脂糖溶解于 9 ml Ames 培养基和 1 ml 蒸馏水中。使用微波炉缓慢加热琼脂糖溶液，直至所有固体完全溶解。每次加热 5–10 秒，避免溶液溢出。溶液应呈澄清透明状。</li>
		<li>将溶解后的琼脂糖置于 37 °C 水浴中，在整个操作过程中保温保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 设置振动切片机
注意：所有切片均使用材料表中列出的振动切片机进行。所给出的设置仅适用于此类振动切片机。有关神经组织振动切片的更多细节，请参见参考文献7。
<ol>
	<li>将振动切片机注射刀片放入刀片夹持器中。</li>
	<li>使用&#34;vibrocheck&#34;装置测量刀片的垂直偏转。利用刀片夹持器上的调节螺钉倾斜刀片，直至其与切削平面平行。精确调整刀片位置对于防止切片表面出现百叶窗效应、并获得表面含有活细胞的平整切片至关重要。</li>
	<li>将振动切片机设置为以下参数：振幅 1.00；速度 0.20；切片厚度 180 - 200 µm。</li>
</ol>
3. 小鼠视网膜的解剖
<ol>
	<li>在密闭容器中汽化约1 ml异氟烷，对成年C57BL/6小鼠进行麻醉。麻醉完成后，通过颈椎脱位法处死动物。小鼠年龄不应超过3个月，否则切片质量将下降。</li>
	<li>将弯头镊子置于眼球下方，取出眼球。轻轻提起眼球可暴露视神经。使用弹簧剪刀切断视神经，并将眼球转移至含有2 ml Ames培养基的35 mm培养皿中。</li>
	<li>所有后续步骤均在体视显微镜载物台上进行。调节放大倍数，以确保对以下操作步骤（3.4–3.9）实现最佳视觉控制。</li>
	<li>用尖头镊子或20 G&#160;针头在角膜与巩膜交界处刺破角膜。操作过程中，用另一把镊子固定眼球。注意避免穿刺工具损伤视网膜。</li>
	<li>将弹簧剪刀插入步骤3.3中形成的小孔，沿角膜边缘剪出一圈切口。剪切时仍需用镊子固定眼球。切口应尽量贴近表面，避免切入视网膜。</li>
	<li>用镊子小心移除角膜、晶状体和玻璃体。玻璃体仅在眼球后部形成一层薄而透明的结构。然而，为确保振动切片机能顺利切片，必须完全去除玻璃体。</li>
	<li>在培养皿中放置眼杯，使其孔洞朝下，便于观察视网膜。切口边缘应仅由巩膜组织构成。若步骤3.4中的环形切口过于靠近眼杯赤道部，则切口附近可能残留视网膜组织。此时在步骤3.8中应特别注意避免损伤视网膜。</li>
	<li>用镊子夹住巩膜，小心撕开组织。此步骤中必须避免撕裂视网膜。如有必要，可用镊子固定组织的巩膜部分，同时用另一把镊子轻轻剥离锯齿缘处的视网膜。操作时保持镊子闭合；切勿直接夹持视网膜，因其组织极为柔软，极易受损。 
	注意：此时视网膜与其余眼杯组织仅在视神经乳头处相连。</li>
	<li>用弹簧剪刀切断视神经乳头处的连接点。此时视网膜应已完全游离，作为单一组织片漂浮于Ames培养基中。</li>
	<li>用弯头手术刀片将视网膜切成4–6个大小约为23 mm的小矩形片，操作时用镊子夹住视网膜边缘以调整其位置。避免在矩形区域内夹压视网膜组织。取材应来自视网膜中央区域，而非远周缘区域。</li>
	<li>用大口径塑料巴斯德移液管将视网膜组织片转移至一个底部已更换为网格（网格尺寸小于1 mm）的35 mm塑料培养皿中。将培养皿固定于烧杯或锥形瓶的上三分之一位置，并将视网膜组织片浸入经碳氧混合气（carbogen）鼓泡的Ames培养基中。</li>
</ol>
4. 视网膜组织块在琼脂糖中的包埋
<ol>
	<li>用大口径塑料移液管将2-3块视网膜组织连同部分Ames培养基小心转移至一个35 mm的塑料培养皿中。此步骤中视网膜组织的方向无需特别注意。</li>
	<li>用玻璃移液管尽可能吸除残留的Ames培养基。一旦液体被移除，立即进行步骤4.3。切勿让视网膜组织干燥。</li>
	<li>立即用2 ml溶解的琼脂糖（37 °C）覆盖视网膜组织。根据步骤3.10中提到的尺寸，组织块在琼脂糖中不会卷曲。</li>
	<li>在液态琼脂糖中，轻轻将视网膜组织推至培养皿底部，确保节细胞层朝下。使用体视显微镜判断其准确位置。定位时可用小刮铲操作视网膜组织。由于琼脂糖会迅速凝固，应尽快且精确地完成视网膜的定位。
	<ol>
		<li>将视网膜组织平行排列于玻璃培养皿底部，以避免切片呈切线或斜向。各组织块之间不应相互接触，但也不宜相隔过远。尽量使视网膜组织大致处于同一水平面上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将含有视网膜组织的玻璃培养皿放入冰箱（4 - 6 °C）中至少2分钟，以使琼脂糖快速凝固，便于后续操作。一旦琼脂糖完成聚合，立即进行下一步。</li>
</ol>
5. 视网膜组织片的封片
<ol>
	<li>小心地将含有视网膜组织块的琼脂糖凝胶从培养皿中取出。使用刮铲或类似工具从玻璃表面轻轻抬起琼脂糖块。由于存在黏附力，此操作可能较为困难，但应避免琼脂糖块破裂。此步骤及后续所有操作均需在室温下进行。</li>
	<li>将琼脂糖块置于玻璃盖玻片上，并用手术刀片修整其大小，使视网膜组织块每侧保留约 1 - 2 mm 的琼脂糖。最终琼脂糖块的尺寸应约为 1,066 mm（其中 10 mm 指块体高度，6 mm 指其边长）。</li>
	<li>使用速干胶将琼脂糖块粘附于振动切片机的样品托上。视网膜组织应位于 10 mm 高的琼脂糖块顶部，并与样品托表面平行；琼脂糖块底部则固定于样品托上。</li>
	<li>立即向振动切片机的缓冲槽中倒入预先通入气体饱和的 Ames 培养基，以完全覆盖琼脂糖块。</li>
</ol>
6. 水平式振动切片机切片的制备
<ol>
	<li>开始切片。首先手动设置切片厚度，直至切片中出现视网膜组织碎片，然后切换至步骤2.3中的设置。由于小鼠视网膜厚度仅约200 µm，每块琼脂糖中最多只能获得2–3片切片。</li>
	<li>用玻璃棒将切片从缓冲液托盘中取出，并转移至35 mm培养皿中的2 ml Ames'培养基中。</li>
	<li>立即将切片置于37 °C孵育箱中（5% CO2/55% O2）储存。切片周围的琼脂糖在孵育箱中仍保持固态，可用于操作切片而不损伤视网膜。与在室温下使用充氧Ames'培养基相比，在设定气体环境下37 °C孵育可获得更佳的切片质量。切片可立即使用，或在孵育箱中保存最多4小时，仍可获得良好的生理状态。</li>
	<li>将下一批视网膜组织包埋于琼脂糖中，并重复步骤4–6。</li>
</ol>

<ol><li>DeVries, S. H., Li, W., Saszik, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+processing+in+two+transmitter+microenvironments+at+the+cone+photoreceptor+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Parallel processing in two transmitter microenvironments at the cone photoreceptor synapse.</a> Neuron. 50, 735-748 (2006).</li>
<li>Jackman, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+synaptic+ribbon+in+transmitting+the+cone+light+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Role of the synaptic ribbon in transmitting the cone light response.</a> Nature Neuroscience. 12 (3), 303-310 (2009).</li>
<li>Rabl, K., Cadetti, L., Thoreson, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+exocytosis+is+faster+in+cones+than+in+rods%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Kinetics of exocytosis is faster in cones than in rods.</a> J. Neurosci. 25 (18), 4633-4640 (2005).</li>
<li>Singer, J. H., Lassová, L., Vardi, N., Diamond, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+multivesicular+release+at+a+mammalian+ribbon+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Coordinated multivesicular release at a mammalian ribbon synapse.</a> Nature Neuroscience. 7 (8), 826-833 (2004).</li>
<li>Peichl, L., González-Soriano, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+types+of+horizontal+cell+in+rodent+retinae%3A+a+comparison+of+rat%2C+mouse%2C+gerbil%2C+and+guinea+pig%5BTitle%5D)+AND+%22Vis.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Morphological types of horizontal cell in rodent retinae: a comparison of rat, mouse, gerbil, and guinea pig.</a> Vis. Neurosci. 11, 501-517 (1994).</li>
<li>Ames, A., Nesbett, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+retina+as+an+experimental+model+of+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">In vitro retina as an experimental model of the central nervous system.</a> J. Neurochem. 37 (4), 867-877 (1981).</li>
<li>Mathis, D. M., Furman, J. J., Norris, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+acute+hippocampal+slices+from+rats+and+transgenic+mice+for+the+study+of+synaptic+alterations+during+aging+and+amyloid+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology.</a> J. Vis. Exp. (49), (2011).</li>
<li>Peichl, L., Sandmann, D., Boycott, B. B. Comparative anatomy and function of mammalian horizontal cells. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPeichl%2C+L+%22Development+of+the+Retina%22">Development of the Retina</a>. , Plenum Press. New York. (1998).</li>
<li>Feigenspan, A., Babai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+properties+of+spontaneous+excitatory+currents+and+encoding+of+light%2Fdark+transitions+in+horizontal+cells+of+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Functional properties of spontaneous excitatory currents and encoding of light/dark transitions in horizontal cells of the mouse retina.</a> Eur. J. Neurosci. 42 (9), 2615-2632 (2015).</li>
<li>Enoki, R., Jakobs, T. C., Koizumi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Horizontal+slice+preparation+of+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Horizontal slice preparation of the retina.</a> J. Vis. Exp. (1), e108(2006).</li>
<li>Babai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+roles+of+complexin3+and+complexin4+at+mouse+photoreceptor+ribbon+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Functional roles of complexin3 and complexin4 at mouse photoreceptor ribbon synapses.</a> J. Neurosci. 36, 6651-6667 (2016).</li>
<li>Thoreson, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Horizontal+slices+of+mouse+retina+expose+horizontal+cells+and+their+properties+%28Commentary+on+Feigenspan+%26+Babai%29%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Horizontal slices of mouse retina expose horizontal cells and their properties (Commentary on Feigenspan & Babai).</a> Eur. J. Neurosci. 42 (9), 2613-2614 (2015).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

与垂直切片相比，水平细胞和无长突细胞等径向排列神经元的树突形态得到了良好保存。与整个视网膜制备物相比，这些细胞类型更易于用微电极接触，因而可通过电生理学和成像技术进行研究。本文我们主要关注外层视网膜；然而，已有文献报道采用类似方法研究内层视网膜的无长突细胞10。
水平切片制备的特性对功能研究具有若干意义。视锥感光细胞与突触后水平细胞之间的突触连接数量几乎与完整视网膜中无法区分。这些突触连接具有功能活性，能够在暗处表现出神经递质的紧张性释放。该突触既可由光/暗转换等内源性刺激激活，也可由外部双极细胞刺激激活。
该技术的一个关键步骤是视网膜本身的分离，应尽可能快速完成，同时避免损伤组织。此外，玻璃体残留物的存在会对切片质量产生负面影响。另一个关键步骤是视网膜组织块的准确定位。尽管已尽最大努力使视网膜组织块与玻璃皿底部保持平行，但切面仍可能略微呈切线方向穿过视网膜。根据角度不同，径向排列神经元的树突野将不同程度地被截断。
本文介绍...

视觉信息被编码为光感受器激活的动态时空模式，而光感受器与二级神经元之间的带状突触决定了视觉信息向下游的传递。哺乳动物视网膜的垂直切片制备是研究垂直通路中信号处理的极为有价值的工具。 即 光感受器细胞与双极细胞之间，以及双极细胞与某些类型的无长突细胞之间1,2,3,4.
然而，垂直切片总会严重截断许多视网膜神经元的树突区域，导致大量突触连接丢失。尤其是在视网膜外层，由于水平细胞具有广泛侧向延伸的树突区域和轴突终末系统，因而受到显著影响5。在垂直切片制备中，数百个视锥光感受器终末向一个水平细胞树突提供的突触输入因此减少为少数稀疏的接触点。这或许足以用于研究单个突触的特性，但完全无法反映光感受器带状突触同步激活背后所依赖的信号处理能力。
因此，我们开发了一种水平切片制备方法，该方法几乎完整保留了视锥光感受器向水平细胞树突的突触输入，并维持其功能。切片平面与视网膜表面平行，理想情况下在水平细胞与无长突细胞之间的内核层进行切割。由此制备出的外视网膜水平切片，在突触前侧包含具有内节和外节以及突触终末的光感受器，在突触后侧则包含水平细胞和双极细胞。该制备方法非常适合研究同一树突支配区域内所有视锥光感受器对水平细胞树突的协同突触输入。因此，该方法可能有助于更深入理解光感受器带状突触的功能机制，而带状突触对于将光感受器激活矩阵中的视觉信息转化为突触后反应至关重要。

<table><tbody><tr><td>艾姆斯培养基</td><td>Sigma</td><td>A1420</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>碳酰气</td><td>Air Liquide</td><td></td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Sigma</td><td>A9045</td><td></td></tr><tr><td>35 mm 培养皿（塑料）</td><td>Nunc Thermofisher</td><td>150318</td><td></td></tr><tr><td>玻璃培养皿</td><td>Chemoline</td><td>50-1470-40</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>大学医院药房</td><td></td><td></td></tr><tr><td>振动切片机注射刀片</td><td>Biosystems</td><td>39053250</td><td></td></tr><tr><td>振动切片机</td><td>Leica Microsystems</td><td>VT1200</td><td></td></tr><tr><td>Vibrocheck</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>微波炉</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>水浴锅</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 G 针头</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>弹簧剪刀</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>弯头手术刀片</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>塑料巴斯德吸管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>玻璃巴斯德吸管</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

成年小鼠视网膜水平切片用于电生理研究的制备

Preparation of Horizontal Slices of Adult Mouse Retina for Electrophysiological Studies

垂直切片制备是研究成年哺乳动物视网膜神经环路和信号传递的成熟方法。此类制备的切面垂直于视网膜表面，非常适合研究径向排列的神经元，如光感受器和双极细胞。然而，水平细胞、广视野无长突细胞以及神经节细胞的大范围树突分支在切片过程中大多被截断，导致这些细胞的突触活动显著减少。尽管神经节细胞和移位的无长突细胞可在视网膜整体铺片制备中进行研究，但位于内核层的水平细胞和无长突细胞在完整视网膜组织中难以被电极接近。
为了实现最大程度的可接近性和突触完整性，我们建立了一种小鼠视网膜的水平切片制备方法，并研究了光感受器与水平细胞之间突触上的信号传递。水平切片具有以下优势：&#160;(1) 可方便且明确地通过视觉识别水平细胞的胞体，便于电极定位；(2) 能够保留水平细胞广泛延伸的树突区域，这是水平细胞树突接收完整且功能性视锥细胞突触输入的前提条件。
在黑暗条件下，来自水平切片的水平细胞表现出紧张性突触活动，并且对短暂闪光刺激产生反应，表现为内向电流减小以及突触活动减弱。免疫细胞化学证据表明，水平细胞树突野内的几乎所有视锥细胞均与其周边树突形成突触连接。因此，水平切片制备方法非常适用于研究具有水平延伸特性的视网膜神经元的生理特性，以及特定突触间感觉信号的传递与整合。

在小鼠视网膜的水平切片中，水平细胞的胞体可根据其独特的形态被轻易识别，即从多边形的胞体发出数条初级树突（图1A）。位于切片表面附近的水平细胞胞体通常可被膜片钳电极顺利接触。在记录过程中，细胞内被填充荧光染料，显示出其复杂的树突分支结构，该结构与完整小鼠视网膜中带轴突的水平细胞形态高度相似8（图1B）。利用荧光素标记的花生凝集素对视锥细胞终足进行标记，显示视锥细胞终足与水平细胞树突之间存在紧密的空间关系（图1C）。除极少数例外，水平细胞树突野内的所有视锥细胞终足均与树突突起形成接触。
为了证实视锥细胞与水平细胞之间的突触连接具有功能性，对水平细胞胞体进行了膜片钳记录。在暗适应条件下，电流反应表现为一个大幅的内向电流，并伴随中等到高频率的突触活动（图2A）。基线的偏移和兴奋性...

我们建立了一种成年哺乳动物视网膜的水平切片制备方法，其切片平面与视网膜表面平行。非放射状取向的视网膜神经元树突野未被截断，从而可利用膜片钳和成像技术研究信号处理过程。

垂直切片制备技术已广泛用于研究成年哺乳动物视网膜中的神经环路及信号传递。切片的截面方向在……

本实验旨在通过制备小鼠视网膜的水平切片，保持水平方向排列神经元的形态和生理完整性，从而研究其在视网膜突触回路中的功能作用。该方法有助于回答视觉信息处理领域中的关键问题，例如感觉信号如何在重复性视网膜的带状突触中被编码和整合。该技术的主要优势在于，水平细胞和无长突细胞等水平排列的中间神经元在功能上保持完整，并可进行电生理记录。本实验操作将由本实验室的技术员 Andrea Nerz 进行演示。开始操作时，用一对弯头镊子置于眼球下方，将眼球取出。轻轻抬起眼球以暴露视神经，然后用弹簧剪刀将其剪断。然后将眼球转移至含有2毫升AMS培养基的35毫米培养皿中。在体视显微镜下调节放大倍数，以获得最佳的视觉控制效果。接着，用一对镊子固定眼球，并用另一把尖头镊子或20号针头在角膜与巩膜交界处刺穿角膜。穿刺角膜时需小心，避免损伤视网膜。随后将弹簧剪插入小孔中，用镊子固定眼球，沿角膜周围剪一圈，切口应紧贴表面，以免剪入视网膜。小心移除角膜晶状体和玻璃体。玻璃体仅在眼球后部形成一层薄而透明的结构。然而，为了进行振动切片，必须完全去除玻璃体。在培养皿中放置眼杯，使其露出一个通向视网膜的清晰孔洞。开口边缘应仅由巩膜组织构成。接着，用镊子夹住巩膜，小心地将组织撕开。此步骤中切勿撕裂视网膜。此时视网膜应仅在视神经乳头处与其余眼杯组织相连。使用弹簧剪在视神经乳头连接处将其剪断。视网膜现在应已作为一块完整的组织自由漂浮于AMS培养基中。接下来，使用大口径巴斯德吸管将视网膜转移至盖玻片上，并用弯头手术刀片将其切成四至六个大小约为2×3平方毫米的小矩形。注意避免在矩形组织内挤压视网膜组织。在此步骤中，使用大直径的塑料巴斯德吸管，小心地将两到三块视网膜组织连同部分AMS培养基转移至玻璃培养皿中。用玻璃巴斯德吸管尽可能去除残留的AMS培养基。随后立即用2 mL 37摄氏度溶解的琼脂糖覆盖视网膜组织。轻轻将视网膜组织块推至培养皿底部，尽快且准确地使其节细胞层朝下，因为琼脂糖会迅速凝固。同时，将视网膜组织块调整至与玻璃皿底部平行，以避免切片呈切线或斜向。随后，将包埋的视网膜组织块转移至冰箱中，使琼脂糖凝固，以便后续处理。现在小心地将含有视网膜组织块的琼脂糖块从培养皿中分离。使用手术刀片小心地从玻璃表面提起琼脂糖块。随后，将琼脂糖块置于玻璃盖玻片上，用手术刀片调整其大小，使视网膜组织块每侧保留一到两毫米的琼脂糖。接着，使用速干胶将琼脂糖块粘附至振动切片机的样品固定装置上。立即用先前通入气泡的AMS培养基填充振动切片机的缓冲槽，覆盖组织块。图中使用点反差光学技术观察到靠近切片表面的一个水平细胞。该图像显示一个水平细胞通过膜片钳电极灌注了Oregon Green 488 BAPTA-1，电极仍连接于该细胞。图中显示了一个注射染料的水平细胞与用荧光素偶联的花生凝集素标记的视锥细胞终足阵列的叠加图像，揭示了可能的突触连接。在本图中，在负60毫伏的钳制电位下进行的全细胞电压钳记录显示出高频的紧张性突触活动。在更高时间分辨率下，突触事件表现出单相波形或更复杂的电流轨迹。本图显示了水平细胞对光刺激的电流反应。光刺激引起离子通道关闭，并阻断突触活动。本图中，使用细胞外电极对视锥感光细胞进行了电刺激。突触后兴奋性电流随刺激强度呈梯度变化。若操作得当，掌握该技术后可在一小时内完成实验。完成该步骤后，可进一步开展钙成像等其他方法，以探究视网膜神经网络中视觉信息处理等延伸科学问题。观看本视频后，您应能充分掌握如何制备具有功能性突触输入的哺乳动物视网膜水平切片，以用于研究横向延伸的细胞类型。

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Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

成年小鼠视网膜电生理研究水平切片的制备

传统上，视网膜的垂直切片和整体装片制备方法被用于研究视网膜神经环路的功能。本文中，我们描述了一种新型切片方法，可完整保存视网膜神经元的树突形态。...

视网膜水平切片制备

本文介绍了一种制备小鼠视网膜暗适应切片以进行电生理记录的实验方法。...

小鼠视网膜神经元在暗适应脑片制备中的膜片钳记录

本视频演示了用于从小鼠视网膜平铺标本进行电生理记录的全细胞膜片钳技术。使用带有电极的细玻璃移液管接近视网膜内的星形细胞（SACs）。在形成密封后，施加负压以破裂膜并形成全细胞膜片钳构型。最后，利用该构型测量通过SAC突触受体的离子流。...

建立用于小鼠视网膜扁平铺片电生理记录的全细胞膜片钳技术

该视频介绍了在小鼠脑切片中对视网膜-外侧膝状体突触和皮层-外侧膝状体突触进行电生理记录的方法。包含背侧外侧膝状体核（dLGN）的脑切片被置于记录室中。刺激电极可放置于视束上，以刺激视网膜神经节细胞（RGCs）并研究视网膜-外侧膝状体突触；或放置于丘脑网状核，以刺激皮层神经元并研究皮层-外侧膝状体突触。刺激后，RGCs...

小鼠脑切片中视网膜丘脑和皮层丘脑突触的电生理学研究

来源： Laboissonniere, et. al．视网膜神经节细胞特定亚群的单细胞RNA测序．J. Vis. Exp. (2017)。...

通过荧光示踪鉴定小鼠视网膜神经节细胞亚型

我们将演示如何从小鼠眼球制备视网膜切片，并记录视网膜神经元的光反应。整个操作均在暗适应条件下进行。...

使用膜片钳技术在暗适应小鼠视网膜切片制备中记录神经元的光诱发突触后反应

我们描述了一种利用小鼠视网膜的ex-vivo 离体切片制备方法，监测视锥感光细胞轴突末梢中 Ca2+ 动态的实验方案。该方案可在小鼠这一重要的哺乳动物模型系统中，对视锥细胞的 Ca2+...

成像小鼠视网膜视锥光感受器轴突末梢中的 Ca2+ 动态变化

一旦神经组织被从体内取出，其会受到环境条件的显著影响，导致在6至8小时后逐渐降解。通过一种独特的孵育方法，可对组织的细胞外环境进行密切监测和精确调控，从而将组织活性显著延长至&gt;24小时。...

延长急性神经组织孵育时间用于电生理学和钙成像

本文旨在描述一种系统性的方案，用于获取小鼠的水平脑切片。该方法的目的是保持海马纤维通路（如穿通通路和苔藓纤维束）的完整性，以评估与齿状回相关的神经过程。...

小鼠脑水平海马切片

我们介绍一种制备小鼠背侧-中间海马区急性脑片的方案。我们将这种横向切片制备方法与冠状切片在记录质量以及所记录神经元形态特征的保存方面进行比较。...

成年小鼠背侧海马急性脑片制备用于全细胞记录及齿状回神经元重建

本研究介绍了一种替代性的视网膜平铺制备方法，通过去除感光细胞胞体，可加快抗体扩散速度，并改善对内层视网膜神经元进行免疫组织化学染色时的膜片钳电极接触条件。 原位 杂交和电生理实验。...

改良的视网膜劈裂铺片技术用于研究脊椎动物视网膜内核层神经元

学习成年小鼠视网膜水平切片制备技术，用于研究水平细胞和双极细胞等水平方向神经元的功能。该方法保留突触回路完整性，支持膜片钳记录和成像，助力视觉信息处理研究。

成年小鼠视网膜水平切片用于电生理研究的制备

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