活细胞成像与三维分析转染人胚胎肾细胞中血管紧张素受体1a亚型的转运——基于共聚焦显微镜技术
2017年3月27日
本文介绍了一种对表达绿色荧光蛋白标记的血管紧张素Ⅱ 1a型受体的细胞进行成像的实验方案，该成像用于观察由血管紧张素Ⅱ处理引发的内吞过程。该技术包括使用第二种荧光标记物对溶酶体进行标记，然后利用软件分析受体与溶酶体在三维空间中随时间变化的共定位情况。
本实验的总体目标是，在血管紧张素Ⅱ处理后，获得血管紧张素Ⅰ型受体与溶酶体共定位的定量时空证据。该方法旨在检测Y型受体与突变型受体在细胞内吞过程中配体刺激响应下的亚细胞加工差异。该技术的优势在于，活细胞成像可消除固定及去垢剂通透化细胞所导致的人为假象，同时可实时评估受体定位的动态变化。
首先选择一个合适的1.4数值孔径物镜，并将物镜对准显微镜载物台中心。在物镜上滴加一滴高粘度、低自发荧光的浸油，然后将含有转染细胞的培养腔室转移至显微镜载物台上。缓慢抬升物镜，使浸油刚好接触到第一张载玻片的底部，随后找到荧光较弱的细胞。
选择一个状态良好的目标细胞，使其位于视野中央，切换至共聚焦模式，确认细胞充分铺展，其腹侧紧密贴附于盖玻片。打开Z轴层扫对话框，点击“Live”，聚焦于细胞顶部，然后点击“Begin”；接着将焦平面移至细胞底部，设置Z轴步长为1.00 µm，然后点击“End”。
然后在顶部的采集设置中选择XYZT模式。最后，设定扫描的时间间隔和持续时长，以观察GFP标记的血管紧张素II型1A受体向溶酶体的靶向过程。接着，为开始配体刺激，向正在成像的孔中加入3微升100倍浓度的配体储备液，然后点击“开始”，以三维模式在设定的时间段和频率下成像观察其反应。
为了分析活细胞图像，请打开相应的三维图像定量分析软件。在本方案中，使用 Velocity。在图像区域内单击右键，然后选择属性。
输入适当的 XY 和 Z 图像像素参数，以创建测量序列，用于分析经配体处理后标记 GFP 的受体囊泡及全细胞的荧光强度变化。在 2D 菜单下，选择扩展聚焦模式以观察细胞。接着，使用自由绘制区域工具，在细胞周围绘制感兴趣区域，然后右键单击图像并选择“裁剪至选区”。
将生成一个新的图像项目。单击图像名称以选择裁剪后的细胞图像，并打开测量选项卡。为了测量内化囊泡的GFP表达水平，将“查找对象”从“查找”模块拖动到上方的序列框中。
将查找对象通道设为GFP，打开设置图标，使用标准差将阈值的下限设为六，以选择GFP荧光强度最亮的对象。将最小对象大小设为0微米³。然后点击测量，选择通道及测量类型。
为了确定用于识别完整细胞的阈值和滤波器，并测量总GFP强度，拖动第二个“Find Objects”模块。接着，将“Find Objects”通道设置为GFP，并将标准差设为零，以选择具有任意GFP强度的物体，同时将最小物体大小设为2立方微米。将“Filter Population”模块拖至“Population”中的第二个“Find Objects”模块，并选择大于100立方微米的体积，以选中完整细胞并剔除所有更小的物体。
然后，选择“测量”并点击“进行测量”项目，以在所有时间点进行测量。为了分析随时间变化的囊泡内以及整个细胞中的GFP表达，点击图像名称下方的测量项目文件名。为了从总数据中提取GFP和囊泡的数据，请打开“原始数据”标签页，并选择群体一。
然后，打开“分析”选项卡，右键点击数据，选择“分析”，接着选择“将分析限制为群体一”。为了测量整个细胞中的 GFP 含量，将两者均更改为群体二。在“分析这些数据”和“按……汇总”下，选择“GFP 荧光通道总和”和“总和”。
然后，在“按……组织数据”选项中，选择“时间点”作为行。为了提取溶酶体中GFP含量的数据，在“查找群体一中的对象”中，将查找对象的通道设置为红色通道。在对话框内的轮形图标中，将阈值设置方法设为标准偏差，下限设为6，以选择荧光强度最亮的红色对象，并将最小对象大小设为0.017立方微米。
选择测量项并创建测量项目，以在所有时间点进行测量。要分析溶酶体中测得的GFP表达量，请点击图像名称下方的测量项目文件名。在“raw”选项卡下选择群体一，然后在“analyze”选项卡中选择群体一，并选择GFP颜色通道的“sum”选项，右键单击以测量红色囊泡中GFP的含量。
在配体刺激之前，GFP标记的血管紧张素1A型受体主要定位于细胞质膜。但在加入血管紧张素II 2.5分钟后，这些受体即发生内化，形成明亮的小泡，并随后聚集成较大的核周囊泡。血管紧张素II诱导的细胞膜皱褶增加了总囊泡GFP荧光强度定量的难度，如这些代表性GFP表达测量数据所示。
尺寸过滤无法区分较大的皱褶和成簇的囊泡，但可以显示较小物体中的GFP比大型物体中的GFP更早增加。在此代表性的GFP表达时间过程中（未使用自动对焦），内化GFP被测量为细胞总GFP的百分比。对细胞内总GFP的分析表明，该细胞在观察期间未发生明显的光漂白。
对转染细胞溶酶体中GFP的定量分析还表明，在给予血管紧张素II后24分钟内，溶酶体内血管紧张素II型1A受体的强度没有变化。在该实验过程中，重要的是要记住在成像前和成像期间监测细胞的健康状况，由于该过程耗时较长，如果细胞培养出现任何异常，应中止实验。在此步骤之后，可采用免疫染色以及FRET或FLIM技术来检测并确认受体的亚细胞定位。
可以进行蛋白质印迹实验，以鉴定受体运输过程中涉及的信号分子及其变化。观看本视频后，您应能够充分理解如何开展活细胞成像及分析，以检测配体诱导的跨膜受体向溶酶体及其他亚细胞区室的靶向运输。
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概述
本文介绍了一种在血管紧张素II处理引发内吞作用期间，对表达绿色荧光蛋白标记的血管紧张素1a型受体的细胞进行成像的实验方案。该方法可实现受体与溶酶体共定位的实时分析。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 神经科学
- 荧光显微镜技术
背景
- 血管紧张素1型受体在细胞信号转导中发挥关键作用。
- 理解受体的内吞作用对于阐明细胞对配体的反应至关重要。
- 实时成像技术可为动态细胞过程提供深入见解。
- 以往的方法可能引入干扰因素，从而掩盖真实的细胞行为。
研究目的
- 获得受体与溶酶体共定位的定量时空证据。
- 比较野生型与突变型受体的内化过程。
- 加深对活细胞中受体动态行为的理解。
使用的方法
- 使用高数值孔径物镜进行活细胞成像。
- 使用浸油以增强成像效果。
- 对溶酶体进行荧光标记以追踪受体定位。
- 利用软件分析进行三维共定位评估。
主要结果
- 实时成像能够有效捕捉受体动态。
- 观察到野生型受体与突变型受体在内化过程中的差异。
- 受体与溶酶体的共定位得到了成功量化。
- 该技术可最大限度减少与固定细胞相关的假象。
结论
- 本方案提供了一种研究受体内吞作用的可靠方法。
- 实时成像可揭示细胞信号传导机制的关键信息。
- 这些发现可能有助于理解受体在多种生物学背景下的功能。
常见问题
行业应用价值
活细胞成像技术可实时、定量评估配体诱导的受体转运亚细胞动态变化，减少固定处理带来的假象，有助于在早期靶点验证阶段降低机制性风险。该方法能够提高对受体行为预测的可信度，为先导化合物筛选及临床前模型选择中的决策提供依据。通过获取空间和时间上的共定位数据，该技术增强了从发现阶段到临床前验证阶段的转化连续性。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过可视化配体刺激后受体的实时内化及溶酶体转运过程，验证治疗假设。
- 操作价值：消除因固定造成的膜受体定位干扰，提高靶点验证数据的可靠性。
- 预测价值：定量分析受体与溶酶体随时间的共定位情况，评估转运动力学，支持对受体变异体的表型筛选。
筛选与检测方法开发
- 检测准备：制备经验证的表达EGFP标记受体的HEK-293细胞系统，用于标准化、可重复的活细胞成像工作流程。
- 定量输出：生成随时间变化的囊泡和溶酶体中受体强度的三维体素定量测量结果，以评估化合物效应。
- 可扩展性：通过明确定义的采集参数（Z步进、时间间隔、体素大小）和自动分割，支持高内涵成像平台。
转化与临床前研究
- 疾病相关性：在人源细胞系统中模拟血管紧张素受体的转运过程，以指导心血管靶点调控策略的制定。
- 转化生物标志物：将受体在溶酶体中的累积与下游信号转导结果相关联，支持与生物标志物匹配的临床前模型构建。
- 基于风险调整的推进策略：利用转运动力学特征优先筛选具有有利亚细胞处理特性的受体变异体或配体。
流程与工作流整合
该方法可整合到从靶点验证到先导化合物鉴定的整个发现流程中，提供动态且定量的数据，为受体功能的早期临床前评估提供依据。
- 发现生物学：通过实时可视化血管紧张素II（Ang II）诱导的受体内化过程，支持受体转运机制的假设验证及信号通路的阐明。
- 筛选：通过标准化的转染、染色和成像参数，确保囊泡和溶酶体检测的可重复性，实现检测就绪。
- 分析：提供受体囊泡和溶酶体中GFP强度的定量读数，并以细胞总GFP为归一化基准，用于比较不同时间点的实验条件。
- 转化研究：将活细胞成像数据与临床前研究连续性相结合，通过关联受体定位与疾病相关系统中的功能结果，推动转化应用。
- 企业级复用：建立可重复使用的成像平台，适用于多种靶点和细胞系的G蛋白偶联受体（GPCR）转运研究。
运营与企业影响
- 科学价值：通过减少固定假象并捕捉动态转运事件，提高对受体行为的预测可信度。
- 操作价值：在不同团队间标准化成像与分析流程，提升亚细胞定位数据的可重复性。
- 战略价值：通过揭示野生型与突变型受体在加工处理上的差异，支持在先导化合物优化中做出基于数据的决策。
- 项目组合影响：基于经验证的受体转运动力学及溶酶体参与情况，支持对靶向受体候选分子进行风险调整后的优先排序。
实施注意事项
- 需要具备共聚焦显微镜、荧光蛋白标记和活细胞成像方案的专业知识。
- 依赖高数值孔径物镜、浸油以及激光扫描共聚焦系统，以实现最佳信号检测。
- 需要跨团队统一成像参数（Z步进、时间间隔、体素大小）和分析阈值，以确保结果的一致性。
- 需考虑不同受体标签、荧光染料以及除HEK-293以外的其他细胞类型的适应性问题。
- 存在实际限制，例如在高成像速度下光漂白风险增加，以及时间分辨率与光子采集之间的权衡。
