靶向液相晶体纳米颗粒载体包封疏水性货物的质膜递送

本实验方案的总体目标是利用基于液晶的纳米颗粒作为递送平台，实现对活体哺乳动物细胞质膜亲脂区域的疏水性双组分货物的可控递送。该方法有助于解答药物递送领域中的关键问题，例如如何高效实现难溶于水的疏水性货物的递送及其细胞摄取。该技术的主要优势在于，能够更特异性地将靶向膜的疏水性货物递送至质膜，同时降低其细胞毒性。

演示该实验步骤的是来自我实验室的博士后研究员 Dr. Okhil Nag。首先，按照文本方案中的描述制备 DiO 液晶纳米颗粒。然后，将 20 微升新配制的 NHSS/EDC 工作溶液加入 1.0 毫升 HEPES 缓冲液中的 DiO 液晶纳米颗粒中。

搅拌5分钟。接着，向该混合物中加入20 µL胆固醇-PEG-胺储备溶液，搅拌2小时。2小时后，使用台式小型离心机以最大转速对反应混合物短暂离心30秒。

然后将上清液通过已用杜氏磷酸盐缓冲液平衡的PD 10凝胶过滤层析柱。为通过凝胶电泳确认PEG-胆固醇是否成功共价偶联至DiO液晶纳米颗粒表面，按文本方案中所述制备琼脂糖凝胶。待凝胶完全凝固后，加入足量TBE电泳缓冲液，使凝胶完全浸没于电泳槽中。

然后，向凝胶的加样孔中加入 35 µL DiO 液晶纳米颗粒样品，在 110 伏电压下电泳 20 分钟。使用凝胶成像系统对凝胶成像，激发滤光片为 488 nm，发射滤光片为 500 至 550 nm。通过在 37 °C 条件下用 DPBS 中的牛纤维连接蛋白孵育 2 小时，制备直径为 35 mm、配有 14 mm 一号盖玻片插件的组织培养皿。

孵育两小时后，从培养皿中移除纤连蛋白包被溶液。用三毫升 DPBS 洗涤 T25 培养瓶中的细胞单层，然后加入两毫升胰蛋白酶 EDTA，以收获 HEK 293 T17 细胞。将培养瓶在 37 摄氏度下孵育约三分钟。

细胞从培养瓶中脱落后，加入4毫升完全培养基以中和胰蛋白酶。通过细胞计数仪对细胞悬液进行计数，确定细胞浓度。然后用生长培养基将细胞浓度调整至约80,000个细胞/毫升。

向培养皿中加入三毫升细胞悬液，并在培养箱中培养过夜。次日，细胞应达到约70%的融合度，可进行后续实验。适当的细胞密度对于高效标记高比例的细胞至关重要。

用递送介质稀释相应的储备液，制备1毫升的DiO、DiO液晶纳米颗粒以及DiO液晶纳米颗粒PEG胆固醇溶液。使用血清移液管从培养皿中移除生长培养基，并用HEPES DMEM洗涤细胞单层两次。洗涤时，用移液管将HEPES DMEM轻轻加至培养皿边缘，随后吸除。

向培养皿中央加入 0.2 毫升制备好的 DiO 游离或 DiO 液晶纳米颗粒递送溶液。然后将培养皿放回培养箱中孵育适当时间。孵育时间过长会导致非膜区域的非特异性细胞标记。

孵育结束后，使用血清移液管移除递送溶液。用两毫升 DPBS 洗涤细胞单层两次。在室温下用 4% 多聚甲醛固定细胞单层 15 分钟。

用移液器吸除多聚甲醛溶液，并用两毫升 DPBS 轻柔洗涤细胞一次。此时固定后的细胞已准备好用于共聚焦激光扫描显微镜检测膜上的荧光信号。在配备加热培养室的显微镜载物台上，使用共聚焦显微镜对活细胞样品进行成像，以评估细胞膜标记情况。

如果成像不能立即进行，需将培养基替换为含有0.05%叠氮化钠的DPBS，并将培养皿置于4摄氏度保存。在本方法中，细胞使用DiO作为FRET供体，DiI作为FRET受体进行共标记。按照先前方法，依次使用DiO液晶纳米颗粒PEG胆固醇和游离DiI对细胞进行标记。

染色后，使用血清移液管以两毫升 DPBS 洗涤细胞一次，并更换为两毫升活细胞成像溶液。在配备加热培养室的显微镜载物台上，使用共聚焦显微镜结合 FRET 成像对活细胞样本进行观察。设置实验参数为每 30 分钟采集一次，持续四小时；以 488 纳米激发 DiO 供体，并使用 32 通道光谱检测器收集 DiO 供体与 DiI 受体在 490 至 700 纳米范围内的完整发射光谱。

然后，测定用 DiO 液晶纳米颗粒 PEG 胆固醇和 DiI 染色的细胞中 DiO 供体和 DiI 受体的时间分辨发射强度。最后，根据文本方案中所述方法计算图像的时间分辨受体/供体 FRET 比值。游离的 DiO 会非特异性地积聚在细胞内部，而非积聚在用 DiI 标记的膜磷脂共染的细胞质膜上。

这可以通过合并图像进行观察。相反，DiO液晶纳米颗粒与聚乙二醇胆固醇（PEG胆固醇）特异性地标记细胞的质膜，这一点可通过其与DiI标记的膜磷脂的共定位现象得以验证。FRET结果显示，DiO从液晶纳米颗粒向膜脂双层发生分配，表现为DiO供体与DiI受体之间的能量转移显著增强。

DiO与DiI之间的FRET，以及DiO和DiI发射光的变化，证实了随着时间推移，DiO向DiI的能量转移（FRET）增强。DiO液晶纳米颗粒与聚乙二醇-胆固醇纳米颗粒在细胞活力达90%时表现出极低的细胞毒性，而游离DiO在细胞活力约为50%时则显示出显著的毒性。观看本视频后，您应能够充分理解如何合成负载货物的液晶纳米颗粒，对其进行生物功能化以实现细胞靶向，并对负载货物的细胞进行成像，以验证其成功递送至细胞内。

通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为将DiO从水溶液特异性递送至细胞质膜是一个重大挑战。我们最初是在利用液晶纳米颗粒平台递送抗癌药物阿霉素并观察到其能够调节药物细胞摄取动力学特性后，产生了本方法的构想。通过此操作流程，该方法可进一步应用于多种疏水性货物的细胞递送，这些货物在从水相介质向细胞递送时往往面临特殊挑战。

该方法可用于更高效地递送靶向细胞膜的药物和生物活性分子，例如用于脑成像的电压敏感性染料，或用于光子辅助药物治疗的光动力药物。