Name: QTL定位和CRISPR / Cas9编辑识别抗药性基因弓形虫 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: 了解如何使用QTL定位和CRISPR/Cas9基因编辑技术识别弓形虫中的抗药性基因SNR1。该方法结合全基因组测序与表型分析，为寄生虫遗传学研究提供可靠框架。

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我们感谢 L. David Sibley 和 Asis Khan 对本实验方案所依据的原始出版物所做出的贡献。本研究由美国国立卫生研究院资助项目 AI108721 资助。

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

这些实验方案结合了多种方法，可用于鉴定T. gondii中的药物抗性基因。其中两种方法在本研究中尤为关键：一种是相对成熟的QTL定位技术，另一种是近年来发展的CRISPR/Cas9基因编辑技术。Lander和Botstein于1989年发表了具有影响力的研究论文，首次展示了QTL定位方法，该方法可将遗传位点与表型相关联36。更近一些，在2012年，Dounda和Charpentier描述了存在于Streptococcus pyogenes中的CRISPR/Cas9基因编辑系统22，该系统迅速被改造为多种模式生物中的遗传学工具，包括T. gondii13,17。在这项研究中，这两种方法均发挥了重要作用：QTL定位确定了包含药物抗性突变的基因座，该突变最终通过基于全基因组测序（WGS）的SNP检测得以鉴定；而CRISPR/Cas9基因编辑则提供了验证手段，证实SNR1即为sinefungin药物抗性基因。
ME49-FUDRr 与 VAND-SNFr 的杂交体系8最初被用于研究毒力表型19，但其亲本菌株还恰好存在另一个表型差异，即VAND亲本对sinefungin具有抗性，而控制该性状的基因尚不清楚。这凸显了遗传杂交的一个优势：当发现亲本之间存在额外的表型差异时，杂交体系可被重新利用。另一个弓形虫（Toxoplasma）杂交体系（I型×III型）也是如此，通过定位多个表型，研究人员发现了多个与毒力相关的基因37,38,39,40。迄今为止，已有四种不同的T. gondii杂交体系被报道并用于定位控制表型的基因8,37,41,42，这些杂交体系均具有被重复利用以定位遗传基础未知的新表型的潜力。此外，代表已知全球遗传多样性的62种T. gondii菌株的基因组已被测序43。可从这些菌株中选择具有有趣表型差异的组合构建新的杂交体系。在强调QTL定位优势的同时，也必须指出，构建杂交体系并非轻而易举的任务。此外还有其他方法可用于鉴定因果基因。一种强大的技术是利用化学诱变产生突变体，并通过表型筛选进行分析。为鉴定因果基因，可采用基因组重测序方法定位致病突变45，或利用cosmid文库对突变体进行功能互补实验44。有关这些方法的更多细节，请参见Coleman et al. 和 Walwyn et al. 在JoVE上发表的两篇文章46,47。
确定导致SNFr突变的因果关系的多个步骤（方案2和方案3）依赖于使用可免费用于学术研究的软件进行的计算方法。文中提供了每一步的详细命令，只要使用正确的文件运行这些命令，用户即可重建识别因果SNFr SNP所需的数据集。请注意，这些命令中的某些语法涉及文件名或目录结构（$PATH），可根据用户偏好进行修改。尽管此处提供的命令并未穷尽通过QTL分析和基于全基因组测序（WGS）的SNP鉴定来分析杂交实验的所有可能方法，但其内容已足够全面，可重复本文所述实验，并有助于用户逐步熟悉这些方法的实际应用方式。
尽管QTL定位和基于WGS序列的SNP检测&#160;足以鉴定出候选 SNFr 基因，还需开展额外实验以确认其在药物耐药性中的作用。这一点可通过基因敲除或基因敲断技术令人信服地加以验证，而这些技术均可利用CRISPR/Cas9基因编辑实现。有关使用CRISPR/Cas9在目标基因中产生插入缺失突变或插入转基因构建体的详细方法，见于 T. gondii 提供了。CRISPR/Cas9 所具备的靶向特异性使其在基因编辑效率上优于传统方法。此外，这种更高的效率使得研究人员能够使用此前难以进行遗传修饰的非实验室适应性菌株开展遗传学研究。 13尽管仍处于起步阶段，CRISPR/Cas9 已被用于实现基因敲除 2,13,17,18,48,49，标记基因 17，并进行基因敲除 16,19,50,51,52,53,54 在 T. gondii，有望成为未来许多其他研究中的有用工具。
发现SNR1失活可导致对辛呋菌素的抗性，使得SNR1位点成为外源基因插入或遗传互补的有前景的位点。为了最大限度地提高利用CRISPR/Cas9介导的基因靶向技术将外源基因整合到SNR1位点的成功率，在实验设计过程中应考虑以下几个方面。首先，建议在外源基因构建体中包含一个筛选标记，以提高菌株构建的效率。如果构建体中包含筛选标记，则可同时使用正向和负向筛选，使得几乎所有经过双重筛选的寄生虫均为外源基因在SNR1位点成功整合的转基因株。相反，如果外源基因构建体不包含额外的可筛选性状，而仅依赖SNR1位点的负向筛选，则成功转基因的效率在很大程度上取决于CRISPR质粒与外源基因构建体共转染的效率。
其次，尽管通过CRISPR/Cas9介导的非同源DNA片段定点整合常用于基因互补和转基因实验，但需注意的是，此类方法无法保证插入方向，因为两种方向均可能发生，这可能会影响某些实验的应用效果。例如，在利用不同基因等位片段对突变体进行互补时，难以确保所有等位基因均以相同方向插入，而插入方向的差异可能导致表达水平的不同。对于此类应用，建议使用包含与SNR1位点序列同源的DNA构建体，以确保正确的整合方向（图6）。
第三，在转染过程中，CRISPR质粒与转基因DNA分子之间的比例对于成功构建转基因品系至关重要。该比例需根据筛选策略进行调整。建议遵循以下指导原则：1）若转基因载体包含药物抗性标记，且相应药物是用于筛选转基因寄生虫的唯一选择手段， 即 若不使用 sinefungin，建议的转基因载体与 CRISPR 质粒的摩尔比为 1:5。在此情况下，增加 CRISPR 质粒的用量可提高获得转基因载体的寄生虫同时获得 CRISPR 质粒的可能性，因此获得药物抗性的寄生虫更有可能在 CRISPR 靶向位点插入标记基因。若比例相反，则大多数获得转基因载体的寄生虫不会同时获得 CRISPR 质粒，结果导致绝大多数具有药物抗性的寄生虫通过与 CRISPR/Cas9 介导的位点特异性插入无关的随机整合方式获得转基因载体。2）若转基因载体包含药物抗性标记，并使用相应药物与 sinefungin 共同筛选转基因寄生虫，建议的转基因载体与 CRISPR 质粒的摩尔比为 1:1。该策略可实现最高的转基因株构建效率。3）若转基因载体不含可筛选标记，仅依赖 sinefungin 的负筛选获得转基因寄生虫，建议的转基因载体与 CRISPR 质粒的摩尔比为 5:1。该设计的原理与上述第一条指导原则相同。由于在方案 5 中同时使用了乙胺嘧啶（pyrimethamine）和 sinefungin 进行筛选，因此二者之间的比例为 DHFR* 微型基因和 SNR1 靶向CRISPR质粒的比例设定为1:1。
综上所述，本文所述方法的详细程度是最初鉴定SNR1的研究中无法完全呈现的2。这些实验方案，特别是命令行语法、所用程序的顺序布局以及CRISPR/Cas9技术的应用，将有助于今后鉴定导致表型的新基因。

宿主范围决定了寄生虫流行程度的广泛性。一些寄生虫对宿主有非常特异的要求，从而限制了其分布区域，而另一些则是广宿主寄生虫。后者中的一种典型代表是 刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）弓形虫（T. gondii）该寄生虫可感染所有哺乳动物及多种鸟类，因此在全球范围内均有分布。人类亦易感，据估计全球约三分之一人口曾被感染。幸运的是，正常的免疫反应通常能够有效控制该寄生虫的增殖；但在免疫系统受损的情况下，寄生虫可能不受控制地增殖并引发疾病，常表现为脑炎。此外，若妊娠期间女性首次感染该寄生虫，由于缺乏免疫记忆而无法迅速限制其扩散，可能导致先天性感染。同时，弓形虫性眼病亦构成疾病负担，可导致视力丧失。 1因此 T. gondii 已成为研究的焦点，并由于开发了多种分子研究方法，成为顶复门寄生虫的模式研究对象。本文将讨论两种方法：数量性状位点（QTL）定位和成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/Cas9基因编辑。QTL定位和CRISPR/Cas9编辑分别是正向和反向遗传学方法，已在先前研究中用于鉴定和/或表征 T. gondii 毒力基因。在此，这些方法被结合使用，以鉴定并验证抗辛 fungin（SNF）基因的功能r) 基因 TgME49_290860 及其直系同源物（注释为 SNR1) 2.
尽管T. gondii能够感染多种中间宿主，但它必须经过并感染猫科动物的肠上皮细胞才能完成其生活史。猫是该寄生虫的终末宿主，在此宿主体内产生有性阶段，并通过减数分裂发生遗传重组。要开展QTL研究，必须构建一个遗传杂交体系；对于Toxoplasma而言，这意味着将两个在某一表型性状上存在差异的亲本虫株通过猫体感染，以产生重组子代3。在将亲本虫株喂饲给猫之前，需使其分别对不同的药物产生抗性，以便通过子代的双重药物筛选更高效地鉴定重组子代4。目前已有三种药物被用于T. gondii的此类研究：氟脱氧尿苷（FUDR），其抗性基因为尿嘧啶磷酸核糖基转移酶（UPRT）5；阿糖腺苷（ARA），其抗性基因为腺苷激酶（AK）6；以及辛fungin（SNF），其抗性基因此前未知7。研究人员已构建了多个T. gondii的遗传杂交体系，但仅有ME49-FUDRr × VAND-SNFr杂交组合的24个子代通过全基因组测序（WGS）进行了基因分型8。这为利用该杂交体系定位并鉴定SNF抗性基因提供了可能，因为VAND亲本株是通过对药物敏感的VAND株（VAND-SNFs）进行化学诱变而获得辛fungin抗性的；同时，VAND参考基因组正是基于VAND-SNFs株测序获得，因此可通过比较子代WGS数据与VAND-SNFs参考基因组之间的多态性，识别出所有遗传变异，包括来自亲本VAND-SNFr的突变，该突变导致部分子代具有辛fungin抗性。
为了鉴定 SNFr 后代中的致病性单核苷酸多态性（SNP），可利用多种基于计算的开源资源来分析数据。为构建 ME49-FUDRr × VAND-SNFr 杂交后代的遗传图谱，开发了 REDHORSE 软件套件9，该套件利用亲本及后代的全基因组测序（WGS）比对结果，精确检测基因组中遗传交换事件的位点。随后可将该遗传定位信息与表型数据（后代中的 SNFr 表型）相结合，生成适用于 R 统计分析软件中“qtl”软件包10的输入数据格式，并进行 QTL 扫描，以揭示与表型显著相关的基因组位点。为鉴定位于 QTL 位点内的致病性 SNP，可使用 Bowtie 2 比对程序11将后代的 WGS 测序读段分别比对至对辛呋喃敏感的 VAND 基因组，再利用 VarScan mpileup2snp 变异检测程序12识别 SNP。基于这些 SNP 数据，可进一步在 QTL 位点区域内筛选仅存在于 SNFr 而不存在于 SNFs 后代中的多态性位点。当致病性 SNP 被定位至某个基因的编码区后，可在 SNFs 菌株中对该候选 SNFr 基因进行遗传改造，以验证其介导药物抗性的功能。
CRISPR/Cas9 基因组编辑系统最近已在Toxoplasma13中建立，为研究这种寄生虫复杂的生物学特性提供了重要工具，尤其推动了非实验室适应性毒株的遗传学研究。由于野生型（WT）&#160;Toxoplasma细胞中非同源末端连接（Non-Homologous End Joining, NHEJ）活性非常高，外源导入的DNA会以极高的频率随机整合到基因组中，导致靶向基因组修饰难以实现14。为了提高位点特异性修饰的成功率，研究人员已采用多种策略来增强同源重组效率和/或抑制NHEJ活性15,16。其中一种策略便是CRISPR/Cas9系统。与其他方法相比，CRISPR/Cas9系统在引入位点特异性修饰方面效率更高，且设计简便13,17,18。此外，该系统可直接应用于任何Toxoplasma毒株，无需对寄生虫进行额外改造13,19。
CRISPR/Cas9 系统源自化脓性链球菌（Streptococcus pyogenes）的适应性免疫系统，该系统利用它来抵御噬菌体等可移动遗传元件的入侵20,21,22。该系统利用一种由RNA引导的DNA内切酶Cas9，在靶标DNA上引入双链断裂（DSB），随后通过易错的非同源末端连接（NHEJ）修复途径，导致短片段的插入或缺失突变，从而失活靶基因；或者通过同源定向重组（HDR）途径，按照设计精确修改靶位点23,24。靶标特异性由一种名为单链向导RNA（gRNA）的小RNA分子决定，该分子包含一段20个核苷酸长度的特异性设计序列，与靶DNA序列完全同源（100%同源性）22。gRNA分子还包含Cas9识别的特征序列，引导核酸酶定位至靶位点，其中包括一个特殊的前间隔序列邻近基序（PAM，序列为“NGG”）25,26。因此，gRNA分子与PAM序列共同决定了Cas9在基因组中的切割位点。通过简单地改变gRNA序列，即可实现对不同位点的靶向切割。
在刚将CRISPR/Cas9系统应用于Toxoplasma时，研究人员使用了一种单一质粒，该质粒同时表达Cas9核酸酶和gRNA分子，以在靶向位点引入双链断裂（DSB）13,17。研究表明，CRISPR/Cas9系统显著提高了位点特异性基因组修饰的效率，不仅可通过同源重组实现，也可通过外源DNA的非同源整合实现13。这一过程可在具有非同源末端连接（NHEJ）活性的野生型菌株中完成。因此，该系统几乎可用于任何Toxoplasma菌株，以实现高效的基因组编辑。在典型的实验中，将靶点特异性的CRISPR质粒与用于修饰靶点的DNA片段共转染入寄生虫中。如果用于修饰靶点的DNA片段包含与靶位点同源的序列，则可通过同源重组修复CRISPR/Cas9引入的DSB，从而实现对靶基因的精确修饰。另一方面，如果导入的DNA片段不含同源序列，仍可将其整合到CRISPR/Cas9的靶向位点。后者常用于通过插入可筛选标记物来破坏基因，或在允许负筛选的位点对突变体进行功能互补13。本文以SNR1位点为例，展示CRISPR/Cas9如何用于基因破坏及转基因寄生虫的构建。

<table><tbody><tr><td>T25 培养瓶</td><td>康宁</td><td>430639</td><td></td></tr><tr><td>人包皮成纤维细胞 (HFF)</td><td>ATCC</td><td>SCRC-1041</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;T. gondii&lt;/em&gt; ME49 菌株</td><td>ATCC</td><td>50840</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;T. gondii&lt;/em&gt;VAND 菌株</td><td>ATCC</td><td>PRA-344</td><td></td></tr><tr><td>DMEM（无碳酸氢钠）</td><td>生命科学</td><td>12800017</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）优质级</td><td>VWR International</td><td>97068-085</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺&amp;nbsp; 200 mM</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>庆大霉素（10 mg/mL）</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>15710064</td><td></td></tr><tr><td>用于培养瓶的细胞刮刀</td><td>VWR International</td><td>10062-904</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 注射器</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>钝针 22 G × 1&quot;</td><td>BRICO 产品</td><td>BN2210</td><td></td></tr><tr><td>Nuclepore 滤膜 3.0 &amp;micro;m，25 mm</td><td>GE Healthcare</td><td>110612</td><td></td></tr><tr><td>Swin-Lok 25 mm 滤器支架</td><td>GE Healthcare</td><td>420200</td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>Propper MFG</td><td>90001</td><td></td></tr><tr><td>Sinefungin</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>380-070-M001</td><td></td></tr><tr><td>R&amp;nbsp;</td><td>R 基金会</td><td>https://www.r-project.org/</td><td></td></tr><tr><td>J/qtl</td><td>丘吉尔研究组</td><td>http://churchill.jax.org/software/jqtl.shtml</td><td></td></tr><tr><td>Bowtie2</td><td>约翰斯·霍普金斯大学</td><td>http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml</td><td></td></tr><tr><td>NCBI SRA Toolkit</td><td>NCBI</td><td>http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra/?view=toolkit_doc</td><td></td></tr><tr><td>SAMtools</td><td>威康信托桑格研究所</td><td>http://www.htslib.org/</td><td></td></tr><tr><td>VarScan</td><td>圣路易斯华盛顿大学</td><td>http://varscan.sourceforge.net/</td><td></td></tr><tr><td>MUMmer</td><td>JCVI &amp;和汉堡大学</td><td>http://mummer.sourceforge.net/</td><td></td></tr><tr><td>pSAG1::CAS9-U6::sgUPRT</td><td>Addgene</td><td>质粒编号 #54467</td><td>&lt;em&gt;T. gondii&lt;/em&gt; 切割UPRT基因的CRISPR质粒</td></tr><tr><td>pSAG1::CAS9-U6::sg290860-6</td><td>Addgene</td><td>质粒编号 #59855</td><td>&lt;em&gt;T. gondii&lt;/em&gt; 切割TG*_290860 SNR1基因的CRISPR质粒</td></tr><tr><td>pUPRT::DHFR-D</td><td>Addgene</td><td>质粒 #58528</td><td>模板用于 &lt;em&gt;DHFR*&lt;/em&gt; 微型基因</td></tr><tr><td>Q5定点突变试剂盒&amp;nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>E0552S</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep 试剂盒</td><td>QIAGEN</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>LB肉汤</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0446-07-5</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Sigma Aldrich</td><td>746495</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钾</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5504</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>三磷酸腺苷（ATP）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6419</td><td></td></tr><tr><td>L-谷胱甘肽（GSH）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G4251</td><td></td></tr><tr><td>ECM 830 电穿孔系统</td><td>BTX</td><td>45-0002</td><td></td></tr><tr><td>电穿孔比色皿&amp;nbsp; 4 mm</td><td>哈佛仪器</td><td>45-0126</td><td></td></tr><tr><td>结晶紫</td><td>Alfa Aesar</td><td>B21932-14</td><td></td></tr><tr><td>6孔TC培养板</td><td>康宁</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>24孔TC培养板</td><td>康宁</td><td>353935</td><td></td></tr><tr><td>12 mm圆形盖玻片</td><td>VWR International</td><td>89015-724</td><td></td></tr><tr><td>96孔TC培养板</td><td>康宁</td><td>353075</td><td></td></tr><tr><td>Gibson Assembly 克隆试剂盒（多片段）</td><td>New England Biolabs</td><td>E5510S</td><td></td></tr><tr><td>Q5 高保真聚合酶&amp;nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0491S</td><td></td></tr><tr><td>乙胺嘧啶</td><td>TCI AMERICA</td><td>P2037-1G</td><td>使用耐乙胺嘧啶的寄生虫时需谨慎——参见实验方案</td></tr></tbody></table>

qtl定位与crispr/cas9编辑技术用于鉴定toxoplasma gondii中的药物抗性基因

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

科学知识与现有的技术和方法密切相关。本文将介绍两种用于鉴定和验证顶复门寄生虫Toxoplasma gondii中一个药物抗性基因的方法：基于全基因组测序（WGS）遗传图谱的定量性状位点（QTL）定位方法，以及基于成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/Cas9的基因编辑方法。QTL定位方法可用于检测基因组区域与表型之间是否存在相关性。进行QTL扫描需要两个数据集：一是基于重组杂交后代的遗传图谱，二是对每个杂交后代个体进行量化评估的表型数据。这些数据需格式化后输入R/qtl软件，以生成QTL扫描结果，识别与表型显著相关的位点。尽管该方法可极大缩小候选基因的搜索范围，但QTL通常覆盖包含多个基因的区域，仍需进一步确定其中的致病基因。获得后代的全基因组测序数据对于在基因水平上鉴定导致药物抗性的突变至关重要。一旦确定候选突变，即可通过遗传操作对药物敏感型寄生虫进行改造以验证其功能。目前对T. gondii进行基因修饰最简便高效的方法是CRISPR/Cas9系统。该系统仅由两个组分构成，均编码于同一质粒上：一条包含20个碱基与基因组靶标互补的单导向RNA（gRNA），以及Cas9内切酶，后者可在靶位点产生双链DNA断裂（DSB），通过修复该断裂可实现断裂位点附近序列的插入或删除。本文提供了利用CRISPR/Cas9基因编辑工具验证导致辛呋宁抗性基因及构建转基因寄生虫的详细实验方案。

本文详细阐述了可用于连续识别药物抗性相关基因的多种方法（图1）。如方案1所述，对ME49-FUDRr 与VAND-SNFr杂交产生的24个子代进行了抗丝裂霉素药物（sinefungin）表型评估。利用子代的遗传图谱及其SNFr表型，在R/qtl软件中进行了QTL扫描——即方案2（图2）。结果在第九号染色体上发现一个显著的QTL峰，跨度约为1 Mbp。该区域即为导致表型变异的因果突变所在位置。
为了鉴定致病突变，使用Bowtie2将子代的全基因组测序（WGS）读段比对至VAND-SNFs参考基因组（方案3.1），利用VarScan mpileup2snp进行SNP calling（方案3.2），并通过MUMmer鉴定VAND基因组中的QTL位点（方案3.3）。提取位于QTL位点内的子代SNP，并筛选出一种特定模式：即SNFr子代携带SNP而SNFs子代不携带该SNP；这种分析可行的原因在于，子代SNP是通过与VAND-SNFs参考基因组比较获得的（图3）。仅有一个SNP符合该模式，该突变导致一个假定的氨基酸转运蛋白基因SNR1中出现提前终止密码子。
确认 SNR1 是SNFr 利用CRISPR/Cas9系统对耐药基因进行了操作。构建了一种新型的用于此目的的CRISPR/Cas9质粒。 T. gondii 基因编辑包含一个靶向的gRNA SNR1 SNF 附近的基因r 子代中鉴定出的突变 - 方案 4（图 4A）。该 SNR1 靶向CRISPR/Cas9质粒通过电穿孔转入SNFs 野生型寄生虫株和耐药突变株在培养时获得 0.3 µM 正定菌素。无SNFr 寄生虫在电穿孔导入靶向UPRT的CRISPR/Cas9质粒后获得。多个SNFr CRISPR 突变体被克隆，且其突变位点周围的区域被扩增 SNR1 gRNA 靶序列被测序。每个突变体均含有一个插入缺失突变（indel），该突变破坏了编码序列 SNR1 基因图4B）。该方法也可用于将靶向构建体插入到 SNR1 通过NHEJ在基因座处图5）， 或通过 HR（同源重组）图6) - 补充文件 2.
<img alt="遗传作图流程图；基因杂交、后代测序、QTL定位、SNP鉴定。" src="/files/ftp_upload/55185/55185fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：本实验方案中所述实验的示意图工作流程。 使用ME49-FUDRr × VAND-SNFr 杂交组合鉴定并确认SNFr基因的主要步骤，对应于本文所述的相关实验方案。 <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55185/55185fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="QTL 分析；染色体标记示意图；R 软件绘图；遗传连锁研究。" src="/files/ftp_upload/55185/55185fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2：在 SNFr 表型上运行 QTL 扫描的 R/qtl 命令。按照方案 2 中所述的命令，使用 R 中的 qtl 软件包运行。图中显示了代表性命令及结果图。<a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55185/55185fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="突出显示遗传变异的DNA序列比对图；用于突变检测的数据分析。" src="/files/ftp_upload/55185/55185fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：致病性SNP的位置。 将子代WGS测序读段使用Bowtie 2比对至VAND-SNFs参考基因组，利用VarScan进行SNP calling，并通过MUMmer鉴定对应的VAND QTL位点。将位于QTL位点内的SNP导入电子表格，进而确定致病性SNP。SNFr 子代（黄色），SNFs 子代（绿色），SNFr SNP（红色）（见数据文件3）。<a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55185/55185fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="SNR1 基因座的 CRISPR 基因编辑示意图，显示靶向位点、插入缺失突变及序列比对结果。" src="/files/ftp_upload/55185/55185fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 4"> 
图 4：利用 CRISPR/Cas9 验证 SNR1 为 SNFr 基因。（A）CRISPR/Cas9 在 SNR1 基因座中诱导的插入缺失突变（绿色）。（B）由两种不同的 SNR1 特异性 CRISPR 质粒（分别为 C5 和 C6）引起的 SNR1 中典型插入缺失突变。RH 为野生型菌株，C5 和 C6 为 SNFr 突变体。（B 图引自参考文献 2）。<a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55185/55185fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="SNR1 基因座的 CRISPR-Cas9 整合示意图及用于 DNA 分析的凝胶电泳结果。" src="/files/ftp_upload/55185/55185fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 5"> 
图 5. 利用 CRISPR/Cas9 进行插入突变。 (A) 通过 CRISPR/Cas9 介导的位点特异性整合，将互补基因或转基因插入 SNR1 基因座。插入的 DHFR* 小基因有两种可能的取向，F1/2 和 R1/2 表示用于鉴定的诊断性 PCR 中所用引物的结合位点。(B) 一个 snr1::DHFR* 克隆的诊断性 PCR 结果，RH 用作野生型对照。同时扩增 GRA1p 作为对照，以检测基因组 DNA 模板的质量。星号表示出现非特异性条带的泳道（图 5B 引自参考文献 2）。<a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55185/55185fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="CRISPR 基因编辑示意图：利用 CRISPR/Cas9 质粒和模板臂进行同源重组。" src="/files/ftp_upload/55185/55185fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 6"> 
图 6： 使用 CRISPR/Cas9 进行基因敲除。一种在 T. gondii 中通过 CRISPR/Cas9 介导的同源基因替换的经典设计。在此情况下，插入的转基因方向是固定的。F1/R1、F2/R2 和 F3/R3 代表用于诊断性 PCR 的寡核苷酸引物结合位点。<a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55185/55185fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
数据文件 1：ME49-FUDRr 与 VAND-SNFr 杂交数据文件，用于 R/qtl，格式为“csv”。一个可使用 format="csv" 选项加载到 R/qtl 中的 .csv 文件。<a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55185/Data_File_1.csv" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
数据文件 2：（chrid txt、genotype txt、markerpos.txt、mname.txt、phenonames.txt 和 phenos.txt）。ME49-FUDRr × VAND-SNFr 杂交数据文件，适用于 R/qtl 软件的 "gary" 格式。 六个可使用 format="gary" 选项在 R/qtl 中加载的 .txt 文件。<a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55185/Data_File_2.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
数据文件 3. SNFr QTL 位点区域子代 SNP 的电子表格。包含一个含有子代 SNP 的工作表，以及另一个含有亲本与子代表型数据的交叉工作表。<a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55185/Data_File_3.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件 1：附加实验方案详情。<a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55185/Supplementary_File_1_-_101916.docx" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件 2：方案 5 —— 在 SNR1 位点利用负筛选进行遗传互补或转基因菌株构建。<a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55185/Supplementary_File_2_-_101916.docx" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本文详细介绍了如何利用基于全基因组测序的遗传图谱进行QTL定位，以鉴定Toxoplasma gondii中的药物抗性基因，并阐述了如何通过CRISPR/Cas9系统对基因组靶点（本例中为药物抗性基因）进行高效编辑，从而验证该基因的功能。

QTL定位与CRISPR/Cas9编辑技术用于鉴定Toxoplasma gondii中的药物抗性基因

科学知识与可用的技术和方法密切相关。本文将介绍两种实现……的方法。

本定量性状位点定位与CRISPR/Cas9基因组编辑方法的总体目标是，在弓形虫中鉴定并进一步验证参与西奈菌素抗性的基因。这些方法有助于解答寄生虫学领域的一些关键问题，例如变异的遗传基础、致病机制以及药物抗性。这些技术的主要优势在于利用全基因组测序数据进行精确的QTL分析，并结合CRISPR/Cas9基因组编辑实现弓形虫中高效的遗传操作。本实验操作将由我实验室的研究助理Robin Powell博士进行演示。弓形虫（Toxoplasma gondii）寄生虫在汇合的人类包皮成纤维细胞（HFF细胞）中培养，接种于T25培养瓶中，并加入D10培养基。为了检测单个子代克隆对辛呋啶（sinefungin）的抗性，需将每个克隆培养至寄生虫密度较高，直至大部分寄生虫开始裂解宿主细胞。按照文本方案中的描述制备寄生虫溶液后，使用移液器将 2.5 × 10⁵ 个寄生虫转移至一个新的含有 D10 培养基的 T25 HFF 培养瓶中，培养基中添加辛呋菌素（sinefungin）药物，其工作浓度为 0.3 µM。将寄生虫在 37 °C 和 5% CO₂ 条件下培养 7 至 10 天。在倒置相差显微镜下观察 HFF 细胞单层，并对子代寄生虫在辛呋菌素药物中的生长表型进行评分。例如，无生长记为0分，有生长且单层细胞发生裂解记为1分。待所有子代评分完成后，该数据将作为二元表型用于数量性状位点（QTL）定位。为鉴定致病突变，将子代的全基因组测序读段比对至对辛诺菌素敏感的van strand参考基因组，进行SNP calling，并在QTL位点区域内扫描与辛诺菌素抗性相关的SNP。将通过CRISPR/Cas9诱导的插入缺失突变，在野生型对西奈芬净敏感的背景下失活SNR1，以确认SNR1为西奈芬净抗性基因。为构建SNR1特异性的CRISPR质粒，以UPRT靶向CRISPR质粒为模板，利用特异性设计的引物进行基于PCR的定点突变。含有目标基因特异性CRISPR质粒的突变产物被转化至大肠杆菌（E. coli）细胞中。随后挑取单个克隆，在LB培养基中培养，并通过质粒提取后进行DNA琼脂糖凝胶电泳分析以检测其大小。接着对质粒进行测序，以确认目标特异性的引导RNA序列。当目标特异性的CRISPR质粒被导入弓形虫细胞后，引导RNA将Cas9核酸酶定向至目标位点，导致该位点发生特异性的DNA双链断裂。随后，DNA断裂通过易错的非同源末端连接活性进行修复，从而在目标基因中产生插入或缺失（indel）突变。在用SNR1特异性CRISPR质粒转染寄生虫前两到三天，将适量的寄生虫加入含有融合人包皮成纤维细胞（HFF）单层的T25培养瓶中，使寄生虫在两到三天内导致70%至80%的HFF细胞裂解。在倒置相差显微镜下观察培养物，确认寄生虫已使HFF单层细胞发生70%至80%的裂解。用移液管轻轻吸出培养基，并用 5 毫升细胞电穿孔缓冲液（cytomix buffer）冲洗细胞，使其脱离培养瓶表面。将寄生虫悬液转移至 15 毫升锥形管中。使用 10 毫升注射器配 22 号钝头针头，将寄生虫悬液反复吹打 2 至 3 次。为去除 HFF 细胞和细胞碎片，将寄生虫溶液通过孔径为 3 微米的滤膜过滤至新的锥形管中。将过滤后的寄生虫在 400 × g 条件下离心 10 分钟进行沉淀。弃去上清液，并用 10 毫升细胞电穿孔缓冲液重新悬浮沉淀的寄生虫。取10微升等分试样，用血细胞计数板测定寄生虫浓度。将剩余悬液于400 × g离心10分钟，再次收集沉淀。弃去上清液，将沉淀重新悬浮于混合缓冲液中，调整浓度至每毫升含4 × 10⁷个寄生虫。在4毫升间隙的比色皿中，将250至300微升的寄生虫溶液与7.5微克CRISPR质粒、6微升ATP以及6微升谷胱甘肽混合。按照T gondii转染的标准操作程序对寄生虫进行电穿孔。另设一个阴性对照组的电穿孔实验，其中CRISPR质粒靶向其他位点。将电穿孔后的寄生虫与人胚成纤维细胞（HFF）共同接种于T25培养瓶中，在37摄氏度条件下培养两天。为开始检测诱导突变的实验流程，首先将培养瓶中的培养基更换为5毫升含0.3微摩尔杀稻瘟菌素（sinefungin）的D10培养基。将寄生虫与筛选培养基持续传代至少三次，直至获得稳定的抗性群体。阴性对照组中未见寄生虫生长，而实验组中寄生虫生长旺盛。将辛呋菌素抗性群体进行亚克隆以获得单克隆株。收集新近逸出的寄生虫，通过3微米膜过滤纯化，并接种至含150微升D10培养基和汇合人胚肺成纤维细胞的96孔板中进行亚克隆。在37摄氏度的CO2培养箱中培养亚克隆培养物7至10天，期间不要扰动培养板。培养7至10天后，在倒置相差显微镜下检查96孔板，寻找仅含有一个噬斑的孔，并标记这些孔。将每个孔中的细胞转移至含有HFF细胞的24孔板中，在37摄氏度下孵育。当寄生虫开始裂解单层细胞时，取50微升寄生虫溶液传代至新孔以维持菌株，其余部分用于基因组DNA提取。将剩余的寄生虫溶液在1000 × g条件下离心10分钟。用PBS洗涤沉淀后的寄生虫，再次离心。使用商业试剂盒或通过煮沸法从沉淀的细胞中提取基因组DNA，并将寄生虫重悬于50至100 µL的PBS中。最后，按照文中所述实验方案进行PCR，以获得用于测序的SNR1基因片段。通过亲本FUDR抗性的ME49株与抗sinefungin的van株杂交获得的子代，检测其对药物sinefungin的抗性，该抗性通过HFF单层细胞的生长与裂解情况来判断。QTL扫描结果显示，在9号染色体上出现一个显著的峰值，跨度约为1 MBP。致病突变位于该区域。全基因组测序有助于鉴定该突变。将QTL位点内的后代SNP导入电子表格，并扫描特定模式：对正辛fungin具有抗性的后代（黄色表示）含有SNP，而对正辛fungin敏感的后代（绿色表示）则不含SNP。仅有一个以红色标示的SNP符合该模式，该SNP导致一个假定的氨基酸转运蛋白基因SNR1出现提前终止密码子。当将靶向SNR1的CRISPR Cas9质粒电穿孔转入对西尼芬净敏感的野生型寄生虫株后，在含西尼芬净的培养条件下获得了耐药突变体。相比之下，使用靶向其他位点的CRISPR质粒则未获得西尼芬净耐药的寄生虫。对多个对西奈菌素耐药的CRISPR突变体进行了克隆，并对SNR1向导RNA靶点周围的区域进行了测序。来自RH野生型菌株以及C5和C6西奈菌素耐药突变体的代表性结果表明，每个突变体均含有一个插入缺失（indel），导致SNR1基因的编码序列被破坏。请注意，操作刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）可能存在危险，因其可感染人类。在此操作过程中应采取预防措施，例如妥善处理可能接触寄生虫的锐器。完成本操作后，可进一步开展其他方法，如利用CRISPR/Cas9介导的位点特异性外源基因插入，以回答更多科学问题，例如基因功能互补或转基因寄生虫的构建。该技术建立后，为分子寄生虫学领域的研究人员探索刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）复杂的生物学特性及致病机制提供了重要途径。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用基因组测序数据进行数量性状位点（QTL）分析，以及如何利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）进行遗传操作。

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Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

QTL定位和CRISPR / Cas9编辑识别抗药性基因<em&gt;弓形虫</em

正向遗传学是一种强大的方法，可用于揭示Toxoplasma从宿主细胞中逸出的分子机制。本文提供了化学诱变寄生虫、富集诱导逸出缺陷突变体以及验证克隆突变体表型的实验方案。...

分离Toxoplasma gondii宿主细胞逸出突变体的遗传筛选方法

基因操作在 Δku80 功能基因组学分析菌株 弓形虫（Toxoplasma gondii）

我们描述了一种基于化学诱变和全基因组测序的Chlamydia遗传分析方法。此外，还介绍了一种可在感染细胞内实现DNA交换的系统，可用于遗传定位。该方法可能广泛适用于缺乏转化系统和分子遗传工具的微生物体系。...

沙眼衣原体中的正向遗传学方法

正向遗传学是一种用于鉴定胞内病原体中对细胞自主免疫具有抗性的重要基因的强大方法。本方法利用先天免疫细胞，特别是巨噬细胞，来鉴定在免疫逃逸中起重要作用的新型Toxoplasma...

使用巨噬细胞进行正向遗传学筛选，以鉴定在抵抗干扰素-γ依赖性细胞自主免疫中起重要作用的Toxoplasma gondii基因

我们描述了一种利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术在Plasmodium...

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建人类疟原虫P. falciparum的条件性突变体

本文介绍了一种利用CRISPR/Cas9系统在克氏锥虫（Trypanosoma...

使用 CRISPR/Cas9 系统将基因敲除直接引入克氏锥虫（Trypanosoma cruzi）的无鞭毛体阶段

本文介绍了一种利用带有loxP位点的盒式基因交换突变技术（FLAEM）在Chlamydia...

无标记基因缺失通过Chlamydia trachomatis中带loxP盒的等位交换诱变实现

本文介绍了一种利用基于荧光素酶的生长检测方法评估化学化合物对体外弓形虫（Toxoplasma...

基于荧光素酶的生长检测法测定化学抑制剂对细胞内Toxoplasma gondii生长的抑制效率

本实验方案的目的是利用组装的核糖核蛋白复合物以及 dpy-10 共CRISPR标记进行筛选，实现对 C. elegans 基因组的无缝CRISPR/Cas9编辑。该方案可用于在 C. elegans...

使用 dpy-10 共 CRISPR 筛选标记和组装的核糖核蛋白复合物对 C. elegans rbm-3.2 基因进行 CRISPR/Cas9 编辑。

AviTag特异性定位限制性光照增强生物素化（ALIBi）是一种新型的光遗传学激活方法，用于标记和亲和纯化亚细胞区域的核糖体亚群，以进行后续的测序和蛋白质组学分析。...

基于重组肽标签特异性定位限制性光照增强生物素化的亚细胞核糖体亚群分离

化学遗传学涉及在靶位点处将看门残基替换为含有不同侧链的氨基酸。在此，我们构建了一种含有cdpk1功能低下等位基因的突变寄生虫，并鉴定了该突变背景下寄生虫所采用的补偿性通路。...

理解携带植物样激酶功能低下等位基因的突变疟原虫中补偿通路的发育

了解如何使用QTL定位和CRISPR/Cas9基因编辑技术识别弓形虫中的抗药性基因SNR1。该方法结合全基因组测序与表型分析，为寄生虫遗传学研究提供可靠框架。

QTL定位与CRISPR/Cas9编辑技术用于鉴定Toxoplasma gondii中的药物抗性基因

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