Name: 制备和评价99米锝标记的三齿螯合物预靶向使用生物正交化学 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 54 s
Description: 学习使用生物正交化学制备锝-99m标记的四嗪衍生物用于预靶向成像的方法。该技术可应用于多种靶向载体，为新型放射性药物开发提供重要平台。

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本研究工作得到了加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）、安大略癌症研究所（OICR，#P.SI.015.8）以及加拿大癌症协会（CCS，#703857）的研究资助。作者感谢Denis Snider博士在准备稿件过程中提供的帮助。

动物实验已获得麦克马斯特大学动物研究伦理委员会的批准，符合加拿大动物护理委员会（CCAC）的指南要求。

1. 使用99mTc对Tz-三齿配体进行放射性标记
警告：以下实验步骤涉及放射性化合物的使用。操作仅可在取得许可的实验室中进行，并须严格遵守安全操作与废物处理的相关规定。微波反应必须使用专为化学合成设计的微波反应仪进行。
<ol>
	<li>[的合成99mTc(CO)3(H2O3]+ 19,20
	<ol>
		<li>在微波反应管中，加入 8 mg K2[苯并羟基3CO2]，15 mg Na2CO3，20 mg Na2B4O7·10H2O 和 25 mg KOCO[CH(OH)]2COONa·4H2O. 用氩气吹扫小瓶10分钟。</li>
		<li>加入 4 mL 的 99mTcO4- (~1,100 MBq, ~30 mCi) 的生理盐水加入小瓶中。</li>
		<li>在微波炉中加热反应 3.5 分钟 110 °C 搅拌10秒以确保试剂充分混匀。</li>
		<li>将溶液的 pH 值调节至 3.5–4，使用约 ~400 μL 1 M HCl。使用pH试纸验证。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>四嗪配体1-5的放射性标记
	<ol>
		<li>溶解每种配体（化合物）2 mg 1-5) 在 250 μL MeOH21.</li>
		<li>添加 250 μL 的 [99mTc(CO)3(H2O3]+ （约74 MBq，约2 mCi）加入各溶液中。</li>
		<li>使用微波加热反应混合物，20 分钟，温度为 60 °C. 
		注意：此步骤对全部5种四嗪化合物均相同。</li>
		<li>对于化合物 2- 5，蒸发溶剂，并将所得产物重新溶解于1 mL体积比为1:1的二氯甲烷:三氟乙酸（DCM:TFA）中。</li>
		<li>加热溶解的反应产物（2-5) 在 60 °C 在微波炉中加热 6 分钟（2-4）或 10 分钟（5).</li>
		<li>冷却至室温后，使用蒸发仪蒸发溶剂（36 °C，8 mbar，3 分钟，6,000 rpm）并将干燥的化合物溶解于 1:1 ACN:H2O 或 1:1 甲醇:H2O，在HPLC纯化之前。</li>
		<li>纯化 99mTc标记的化合物（1-5)，包括使用高效液相色谱法（HPLC，C18 反相）。通常使用 30:70 乙腈：水的洗脱梯度2O（均含0.1% TFA）调整为40:60乙腈:水2O 超过 20 分钟（18 分钟）和 C18 分析型色谱柱，4.6 x 100 mm。同时使用紫外检测（254 nm）和γ射线检测。
		<ol>
			<li>取每种标记产物的少量样品，将其HPLC保留时间与共同进样的非放射性Re标记标准品（0.125 mg溶于20%甲醇-H₂O）的保留时间进行比较2O）。在紫外HPLC图谱中鉴定重新标记的标准品，其洗脱时间与原标准品相同 99mγ-HPLC 谱图中 Tc 标记化合物的共注射。该共注射在相近的保留时间出现峰，证实了二者的一致性 99mTc标记化合物</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用蒸发仪将高效液相色谱（HPLC）组分中的溶剂蒸发除去36 °C，8 mbar，3 min，6,000 rpm。</li>
		<li>将纯化后的化合物配制成浓度为 7.4 kBq/µL 在含0.5% BSA和0.01% Tween-80的PBS中。</li>
		<li>为确保标记化合物的稳定性，需进行以下操作 体外 稳定性研究。将配制好的化合物在 37 °C 分别在1、4和6小时，每次向HPLC注入少量（3.7 MBq）混合物以评估其稳定性。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 预靶向生物分布研究
<ol>
	<li>动物准备
	<ol>
		<li>使用7-9周龄的雌性Balb/c小鼠（n=3），通过尾静脉注射给予用生理盐水配制的TCO-BP（20 mg/kg）（5 μg/μL）。</li>
		<li>将小鼠置于物理固定装置中，识别位于尾部侧面的静脉，并用酒精棉片擦拭。在距尾端约2 cm处，以浅角度平行于静脉插入30号针头。缓慢推动注射器活塞完成注射，拔出针头后在注射部位用干净纱布轻压，直至出血停止。</li>
		<li>在TCO-BP注射后1小时，通过尾静脉注射给予约0.74 MBq（20 μCi）的99mTc-四嗪，该溶液配制于100 μL含0.5% BSA和0.01% Tween-80的PBS中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>生物分布研究
	<ol>
		<li>在预定时间点（t = 6 h），使用3%异氟烷和2%氧气混合气体对小鼠进行麻醉。对麻醉后的小鼠实施足趾夹捏试验，确认其处于外科麻醉水平。</li>
		<li>使用预先用肝素处理的注射器经心脏穿刺采集血液（1 mL）。将小鼠仰卧放置，鼻部置于鼻罩中以维持麻醉状态，并定位动物的剑突。
		<ol>
			<li>在动物腹中线左侧剑突下方插入25 G针头，角度约为20°。完全插入针头后，缓慢回抽活塞，若针头进入心脏则可在针座中观察到血液。如有必要，在保持活塞不动的同时轻微调整针头位置以穿刺心脏，然后缓慢将血液吸入注射器。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在麻醉状态下通过颈椎脱位处死动物。</li>
		<li>将每只动物放入塑料袋中，使用剂量校准仪（99mTc设置）测量其整体放射性活度。</li>
		<li>采集以下组织和体液样本至预先称重的计数管中：血液、骨骼（膝部和肩部）、胆囊、肾脏、肝脏、胃（含内容物）、小肠（含内容物）、大肠和盲肠（含内容物）、甲状腺和气管、含尿液的膀胱以及尾部。</li>
		<li>用PBS冲洗适当组织（不包括血液、胆囊和膀胱）以去除残留血液，吸干后放入相应的计数管中。</li>
		<li>将动物尸体放入塑料袋中，使用剂量校准仪测量残余的整体放射性活度。</li>
		<li>称量每个含有组织样本的计数管，减去计数管初始重量，得到各组织的实际质量。</li>
		<li>使用剂量校准仪（99mTc设置）测量每只小鼠注射时所用测试样品（100 µL）的放射性活度。 
		注：该测试样品体积等于注射体积，因此可反映注射时刻的放射性计数。</li>
		<li>在组织测量时，取之前使用的测试样品5 µL进行分装。使用多探头γ计数器（99mTc设置）测定该5 µL样品的每分钟计数（CPM）。</li>
		<li>利用步骤2.2.9和2.2.10获得的两个数值，通过公式1计算放射性活度与CPM之间的关系，从而获得转换因子（CPM µCi-1）。 
		(1) <img alt="放射性示踪剂定量公式，包含每分钟计数、剂量校准、γ计数器" src="/files/ftp_upload/55188/55188eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 1"></li>
		<li>使用γ计数器测定每个组织或体液样本中的放射性活度。</li>
		<li>使用公式1计算在测量时刻各组织或体液中的放射性活度相对于总注射剂量的比例。该数值再根据器官重量进行归一化处理，并以每克组织的注射剂量百分比（即 %ID/g）表示。</li>
		<li>重复步骤2.1.2至2.2.13，开展阴性对照实验：在未给予TCO-BP的情况下，使用99mTc标记的四嗪配体进行实验。分别在注射后0.5、1、4和6小时处死小鼠（n = 3），并按上述方法采集组织或体液样本。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Jurisson, S. S., Lydon, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+Technetium+Small+Molecule+Radiopharmaceuticals%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Potential Technetium Small Molecule Radiopharmaceuticals.</a> Chem. Rev. 99 (9), 2205-2218 (1999).</li>
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<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetrazine-Trans-Cyclooctene+Ligation+for+the+Rapid+Construction+of+18F+Labeled+Probes%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">Tetrazine-Trans-Cyclooctene Ligation for the Rapid Construction of 18F Labeled Probes.</a> Chem. Commun. 46 (42), 8043(2010).</li>
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<li>Russell, R. G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bisphosphonates%3A+The+First+40+Years%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Bisphosphonates: The First 40 Years.</a> Bone. 49 (1), 2-19 (2011).</li>
<li>Yazdani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Bone-Seeking+Trans-Cyclooctene+for+Pretargeting+and+Bioorthogonal+Chemistry%3A+A+Proof+of+Concept+Study+Using+99mTc+and+177Lu-Labeled+Tetrazines%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">A Bone-Seeking Trans-Cyclooctene for Pretargeting and Bioorthogonal Chemistry: A Proof of Concept Study Using 99mTc and 177Lu-Labeled Tetrazines.</a> J. Med. Chem. , (2016).</li>
<li>Alberto, R., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ja980745t">A Novel Organometallic Aqua Complex of Technetium for the Labeling of Biomolecules: Synthesis of [99mTc(OH2)3(CO)3]+ from [99mTcO4]- in Aqueous Solution and its Reaction with a Bifunctional Ligand.</a> J. Am. Chem. Soc. 120 (31), 7987-7988 (1998).</li>
<li>Alberto, R., Ortner, K., Wheatley, N., Schibli, R., Schubiger, A. P. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ja003932b">Synthesis and properties of boranocarbonate: A convenient in situ CO source for the aqueous preparation of [99mTc(OH2)3(CO)3.</a> J. Am. Chem. Soc. 123 (13), 3135-3136 (2001).</li>
<li>Lu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0960894X12011584">Synthesis and SAR of 99mTc/Re-labeled Small Molecule Prostate Specific Membrane Antigen Inhibitors with Novel Polar Chelates.</a> Bioorg. Med. Chem. Lett. 23 (5), 1557-1563 (2013).</li>
<li>Maresca, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0020169312001764">Small Molecule Inhibitors of PSMA Incorporating Technetium-99m for Imaging Prostate Cancer: Effects of Chelate Design on Pharmacokinetics.</a> Inorg. Chim. Acta. 389, 168-175 (2012).</li>
<li>Bartholomä, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insight+into+the+Mode+of+Action+of+Re%28CO%293+Thymidine+Complexes%5BTitle%5D)+AND+%22ChemMedChem%22%5BJournal%5D)">Insight into the Mode of Action of Re(CO)3 Thymidine Complexes.</a> ChemMedChem. 5 (9), 1513-1529 (2010).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

制备了一系列具有不同极性的四嗪连接的三齿螯合物，并研究了它们的实用性 99mIEDDA反应中与TCO衍生物形成的Tc配合物 体内 进行了评估。一种有效且可重复的方法 99mTc标记方法已针对五种四嗪螯合剂开发，其中配体浓度为10-3 M. 标记步骤之后进行脱保护 t-丁基（用于化合物） 2-5）。使用高浓度配体可提高放射化学产率并缩短反应时间，从而最大限度地减少四嗪的降解21通过高效液相色谱法（HPLC）将产物与未标记配体及任何放射性化学杂质分离，得到的放射性化学产率为31–83%，所有产物均具有 &#62;99% 的放射化学纯度以及约 1.48 MBq/µg 的高比活度。所有化合物在含 0.5% BSA 和 0.01% Tween80 的 PBS 中均表现出稳定性，持续时间长达 6 小时（图3).
双膦酸盐类化合物（如 TCO-BP）可定位于骨代谢活跃区域或损伤部位...

99m锝-99m 仍是诊断核医学中使用最广泛的放射性同位素，全球每年进行的显像检查超过5000万例。1,2,3. 大部分 99m临床上使用的锝（Tc）药物属于灌注型放射性药物。目前仅有少数几种为活性靶向化合物，其中 99mTc通过与靶向构建体连接而被引导至特异性生物标志物。靶向构建体的制备 99mTc放射性药物常受到以下因素的影响： 99m靶向分子与生物标志物结合能力可能受到锝-配体复合物的影响，或者同位素的半衰期不足以适用于抗体等分子量较高的生物分子。后者通常需要数天时间才能获得图像，以便使生物分子从非靶组织中清除。预靶向技术为此提供了一种替代策略以克服这些挑战。
预靶向策略结合生物正交化学已被证明是开发新型分子成像探针的有效方法，适用于荧光成像和放射性成像4,5,6,7,8。如图1所示，1,2,4,5-四嗪（Tz）与反式-环辛烯（TCO）衍生物之间的逆电子需求狄尔斯-阿尔德（IEDDA）反应已被证明尤为高效6。该反应在磷酸盐缓冲液（PBS）中具有快速的动力学特征（k2 ≈ 6,000 M-1 s-1）和高选择性，因此非常适用于体内预靶向应用9,10。
最常用的方法是先给予一种由TCO衍生的靶向载体，经过足够的延迟时间后，再给予放射性标记的四嗪。基于放射性标记四嗪的 11C, 18F, 64铜， 89Zr，和 111已有报道11,12,13,14,15相比之下，仅有一份关于 99m使用HYNIC类配体标记的Tc-Tz，该标记过程需加入共配体以防止蛋白质结合与降解 体内16. 作为替代方法，本文报道了 99m使用一类可与[Tc(I)形成稳定三齿配合物的配体对四嗪进行Tc(I)标记99mTc(CO)3]+ 核心
<img alt="化学反应示意图；叠氮-炔烃环加成，氮气释放。" src="/files/ftp_upload/55188/55188fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：四嗪与 转-cyclooctene <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55188/55188fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
所制备的配体家族包含三齿螯合物，其极性以及金属结合区域与Tz之间的连接基团性质各不相同图2目标是鉴定出一个 99m可有效定位于并反应于 TCO 标记位点的 Tc-四嗪探针 体内 且在未结合时能快速清除，以获得较高的靶标与非靶标比值。为测试配体，使用了一种双膦酸盐的反式环辛烯衍生物（TCO-BP）17我们先前已证明，TCO-BP 可定位于骨代谢活跃区域，并能与放射性标记的四嗪发生反应。 体内18它是一种用于测试新型四嗪的便捷试剂，因其可通过单步合成制备，且可在正常小鼠体内进行实验，其定位主要发生在关节（膝关节和肩关节）。

<table><tbody><tr><td>氩气</td><td>Alphagaz</td><td>---</td><td>---</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;CO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>EMD Millipore</td><td>106395</td><td>---</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;B&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;7&lt;/sub&gt;&amp;#183;10H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Anachemia</td><td>S9640</td><td>---</td></tr><tr><td>KNaC&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;&amp;#183;4H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Anachemia</td><td>217255</td><td>---</td></tr><tr><td>Technelite &lt;sup&gt;99m&lt;/sup&gt;Tc 发生器</td><td>Lantheus medical imaging</td><td>---</td><td>&lt;sup&gt;99m&lt;/sup&gt;TcO&lt;sup&gt;4-&lt;/sup&gt; 的来源</td></tr><tr><td>0.9% 氯化钠溶液</td><td>Lantheus medical imaging</td><td>---</td><td>用于洗脱发生器</td></tr><tr><td>1 M HCl</td><td>Lab Chem</td><td>---</td><td>---</td></tr><tr><td>MeOH</td><td>Caledon</td><td>---</td><td>---</td></tr><tr><td>ACN</td><td>Caledon</td><td>---</td><td>HPLC 级</td></tr><tr><td>Millipore H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Barnstead Nanopure</td><td>---</td></tr><tr><td>DCM</td><td>Caledon</td><td>---</td><td>---</td></tr><tr><td>TFA</td><td>Caledon</td><td>---</td><td>---</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td>pH 7.4 1x</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7906</td><td>---</td></tr><tr><td>Tween80</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8047</td><td>---</td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>CDMV</td><td>108737</td><td>供应商：Fresenius Kabi Animal Health</td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Waters</td><td>1525 二元泵，2998 光电二极管阵列检测器，E-SAT/IN，Bioscan Flowcount PMT 检测器（货号 #15590）</td><td>---</td></tr><tr><td>用于化合物 2-4 分析与纯化的 HPLC 色谱柱</td><td>Phenomenex</td><td>00G-4435-E0</td><td>Gemini&amp;reg; 5 &amp;micro;m C18 110&amp;nbsp;&amp;Aring;，LC 色谱柱 250 x 4.6 mm</td></tr><tr><td>用于化合物 1 和 5 分析与纯化的 HPLC 色谱柱</td><td>Waters&amp;nbsp;</td><td>186003115</td><td>XBridge BEH C18 色谱柱，130 &amp;Aring;，5 &amp;micro;m，4.6 mm x 100 mm</td></tr><tr><td>微波反应器&amp;nbsp;</td><td>Biotage&amp;nbsp;</td><td>Initiator 8</td><td>---</td></tr><tr><td>Biotage V10 浓缩仪</td><td>Biotage&amp;nbsp;</td><td>序列号 V1041</td><td>---</td></tr><tr><td>放射性剂量校准仪</td><td>Capintec, Inc.&amp;nbsp;</td><td>CRC-25R</td><td>---</td></tr><tr><td>γ 计数器</td><td>Perkin Elmer</td><td>Wizard 1470 自动 γ 计数器</td><td>---</td></tr><tr><td>动物房用天平&amp;nbsp;</td><td>Mettler Toledo</td><td>XP105 Delta Range</td><td>---</td></tr><tr><td>微波反应瓶&amp;nbsp;</td><td>Biotage&amp;nbsp;</td><td>355629</td><td>0.5–2 mL&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

使用生物正交化学进行预靶向的99mtc标记三齿螯合物的制备与评价

Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry

预靶向结合生物正交化学正成为开发新型放射性药物的有效策略。在现有方法中，放射性标记的四嗪与 转反式环辛烯（TCO）与生物分子连接已被证明是一种高效且生物正交的成像特定生物靶点的方法。尽管锝-99m 仍是诊断核医学中最广泛使用的同位素，但目前可用于制备 99m锝标记的四嗪。本文报道了一类三齿螯合-四嗪衍生物及其锝(I)配合物的制备。这些此前未知的化合物被放射性标记为 99mTc 通过微波辅助法以31%至83%的放射化学产率制备。产物在生理盐水和PBS中稳定，并能快速与TCO衍生物反应。 体外。它们的 体内 通过使用定位于活跃骨代谢或损伤区域的四嗪-双膦酸盐（TCO-BP）衍生物，证明了预靶向能力。在小鼠研究中， 99mTc-四嗪在膝关节和肩关节中显示出高活性浓度，而在不存在TCO-BP的实验中未观察到该现象。非靶器官的总体摄取情况及药代动力学因连接子的性质和螯合物的极性不同而存在显著差异。

配体通过不同的连接臂和螯合剂，采用简单的还原胺化策略合成（图2），随后将产物与市售的四嗪进行偶联22,23放射性标记对所有化合物均采用相同方法进行，且具有高度可重复性。通过改变pH值、配体用量、反应时间和温度对过程进行优化，随后 99mTc-放射性标记化合物 1-5 以中等到较高的放射化学产率获得：83%（1), 45% (2), 31% (3), 42% (4），以及 54%（5）。经HPLC纯化去除未反应的配体，并使用旋转蒸发仪蒸发后，将化合物配制于含有0.5% BSA和0.01% Tween80的PBS中，用于注射。纯化后化合物的放射化学纯度 99mTc标记的四嗪约为1.4...

本文介绍了一种用于前靶向和生物正交化学的三齿99mTc(I)螯合物-四嗪衍生物的放射性标记及体内测试方案。

使用生物正交化学进行预靶向的99mTc标记三齿螯合物的制备与评价

预靶向结合生物正交化学正成为开发新型放射性药物的有效途径。在现有方法中，……

本实验的总体目标是利用反式环辛烯修饰的生物分子作为靶向载体，通过生物正交化学方法制备用于预靶向成像的锝-99m标记四嗪化合物。该方法为新型放射性药物的开发提供了一个重要的新平台。通过预靶向策略，此处所述的锝配合物可用于对多种器官、组织及生物标志物进行成像。该技术具有显著优势，可提供一种稳健的分步方法，用于制备以锝-99m放射性标记的四嗪化合物。锝-99m是诊断医学中应用最广泛的医用同位素。该技术可与多种靶向载体联用，包括小分子和抗体。此外，通过将锝替换为发射β射线的铼同位素，该技术还可用于放射性治疗。动物实验部分的操作将由本实验室的生物学技术员 Nancy Janzen 演示。开始放射性标记程序时，在微波小瓶中加入 8 毫克硼氢化钾、15 毫克碳酸钠、20 毫克十水合四硼酸钠和 25 毫克四水合酒石酸钾钠。用氩气对小瓶吹扫 10 分钟。然后，将 1,110 兆贝可的 0.9% 生理盐水中含有的 4 毫升高锝酸盐-99m 加入小瓶中。将反应混合物装入微波反应器，搅拌 10 秒。随后在 110 摄氏度下加热 3.5 分钟，得到三水三羰基锝-99m 阳离子。加入约 400 微升 1 摩尔盐酸，将溶液 pH 调节至 3.5 至 4。接下来，针对每种四嗪配体，将 2 毫克配体溶解于 250 微升甲醇中。向每种配体溶液中加入 250 微升活度为 74 兆贝可的锝-99m 复合物。在微波反应器中将混合物于60摄氏度加热20分钟。对于带有叔丁基保护基的四嗪配体，将溶液从微波小瓶转移至20毫升闪烁瓶中，蒸发溶剂，再将各配合物重新溶解于1毫升体积比为1:1的二氯甲烷与三氟乙酸混合溶液中。然后将溶液转移至微波小瓶，在微波反应器中于60摄氏度加热6至10分钟，以脱去配体的保护基。将复合物冷却至室温，然后蒸发溶剂。将残余物重新溶解于500微升乙腈或甲醇与水按1:1配制的水溶液中，随后进行高效液相色谱（HPLC）纯化。采用C18反相HPLC纯化每种放射性标记的四嗪复合物，流动相为含0.1%三氟乙酸的乙腈-水体系，洗脱梯度在20分钟内从30%乙腈升至70%，再降至40%，最后升至60%。当伽马谱图中显示洗脱峰时，收集纯化产物。随后，将每个标记的复合物与含有0.125毫克相应镭-四嗪复合物的水-20%甲醇溶液共同进样。比较铼复合物在紫外谱图中的保留时间与锝复合物在伽马谱图中的保留时间，以确认伽马峰的身份。从每种纯化的锝-四嗪复合物中除去溶剂。将每种复合物配制成浓度为 7.4 千贝可勒每微升的磷酸盐缓冲液，其中含有 0.5% 牛血清白蛋白和 0.01% 聚山梨酯 80。对每只实验小鼠，用注射器吸取 100 微升浓度为 5 微克每微升的 TCOPB 衍生物生理盐水溶液，以制备 20 毫克每千克剂量。将一支30号针头连接到给药注射器上。将实验小鼠放入物理固定装置中。在尾部侧面距离尾尖约两厘米处识

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制备和评价<sup&gt;99米</sup&gt;锝标记的三齿螯合物预靶向使用生物正交化学

本视频介绍了预靶向放射免疫治疗（PRIT）技术，该技术通过先给予免疫偶联物，再给予放射性配体，以治疗肿瘤。这种放射免疫治疗可降低对健康组织的辐射剂量，并可使用半衰期极短、无法与基于抗体的载体兼容的放射性核素。...

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生物正交的逆电子需求Diels-Alder环加成反应已被用于开发一种高效且模块化的预靶向PET成像策略，用于癌症检测。本方案以靶向结直肠癌的抗体huA33和一种64Cu标记的放射性配体构成的模型系统为例，详细描述了该方法的各个步骤。...

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由于 89Zr 具有长达数天的放射性半衰期和理想的衰变特性，这种正电子发射放射性金属非常适用于基于抗体的放射性药物在 PET 成像中的应用。本方案将描述 89Zr...

89Zr-DFO 标记抗体的生物偶联与放射性合成

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小鼠淋巴细胞标记 64铜-抗体受体靶向 在体实验 细胞迁移的PET/CT成像

病毒来源的肽段与抗体偶联物（ACs）相结合是一种日益受到关注的方法，因其具有增强分子载荷在肿瘤细胞内蓄积的潜力。本实验方案利用常规方法评估肽段偶联效率、抗体偶联物及其载荷在细胞内的积累情况以及肿瘤靶向性，可为研究人员在关键的早期研发阶段提供支持。...

利用病毒衍生肽修饰抗体偶联物的初步评估：提高细胞摄取与增强肿瘤靶向性

本方案描述了一种的合成与表征方法 转反式环辛烯（TCO）修饰的抗体和一个 177Lu标记的四嗪（Tz）放射性配体用于预靶向放射免疫治疗（PRIT）。此外，本文还详细介绍了这两种构建物的使用方法 体内...

基于逆电子需求狄尔斯-阿尔德反应的预靶向放射免疫治疗

在本实验方案中，我们将描述PODS的合成方法。PODS是一种基于苯并恶二唑基甲基砜的试剂，可用于将载荷分子位点选择性地连接到生物分子（尤其是抗体）的巯基上。此外，我们还将描述含PODS的双功能螯合剂的合成与表征，以及其与一种模型抗体的偶联过程。...

合成用于制备位点选择性修饰免疫偶联物的巯基反应性试剂及其生物偶联方法

本文介绍一种使用正电子发射断层扫描（PET）放射性同位素对细胞进行放射性标记的实验方案。 89Zr (t1/2 78.4 小时），使用即用型放射性标记合成子 [89Zr]Zr-p-异硫氰酸苄基-去铁胺([89Zr]Zr-DBN）。使用 [89Zr]Zr-DBN...

细胞追踪的正电子发射断层成像：细胞放射性标记方法

学习使用生物正交化学制备锝-99m标记的四嗪衍生物用于预靶向成像的方法。该技术可应用于多种靶向载体，为新型放射性药物开发提供重要平台。

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