使用生物正交化学进行预靶向的^99mTc标记三齿螯合物的制备与评价

本实验的总体目标是利用反式环辛烯修饰的生物分子作为靶向载体，通过生物正交化学反应，制备用于预靶向成像的锝-99m标记四嗪化合物。该方法为新型放射性药物的开发提供了一个重要的新平台。通过预靶向策略，本文所述的锝配合物可用于对多种器官、组织和生物标志物进行成像。

该技术具有优势，可提供一种稳健的分步方法，用于制备以锝-99m放射性标记的四嗪化合物，其中锝-99m是诊断医学中应用最广泛的医用同位素。该技术可与多种靶向载体联用，包括小分子和抗体。此外，通过将锝替换为发射β射线的铼同位素，该技术也可用于放射性治疗。

动物实验部分将由本实验室的生物技术员 Nancy Janzen 演示。开始放射性标记程序时，在微波小瓶中加入 8 毫克硼氢化钾、15 毫克碳酸钠、20 毫克十水合四硼酸钠和 25 毫克四水合酒石酸钾钠。用氩气对小瓶吹扫 10 分钟。

然后，将 1,110 兆贝可勒尔活度的高锝酸盐锝-99m 四毫升溶于 0.9% 氯化钠溶液中加入小瓶。将反应混合物装入微波反应器中，搅拌 10 秒。随后在 110 摄氏度加热 3.5 分钟，得到三水三羰基锝-99m 阳离子。

加入约 400 微升 1 摩尔盐酸，将溶液 pH 值调节至 3.5 到 4。接下来，对于每种四嗪配体，将 2 毫克配体溶解于 250 微升甲醇中。向每种配体溶液中加入 250 微升锝-99m 复合物，其放射性活度为 74 兆贝可。

将混合物在微波反应器中于 60 摄氏度加热 20 分钟。对于带有 t-丁基保护基团的四嗪配体，将溶液从微波反应瓶转移至 20 毫升闪烁瓶中，然后蒸发溶剂，并将各配合物重新溶解于 1 毫升体积比为 1:1 的二氯甲烷与三氟乙酸混合溶液中。接着，将溶液转移至微波反应瓶中，在微波反应器中于 60 摄氏度加热 6 至 10 分钟，以脱除配体的保护基团。

将复合物冷却至室温，然后蒸发溶剂。将残余物重新溶解于500 µL乙腈-水或甲醇-水（1:1，v/v）的水溶液中，随后进行HPLC纯化。采用C18反相HPLC纯化每种放射标记的四嗪复合物，洗脱梯度为在20分钟内乙腈-水从30:70线性变化至40:60，流动相中始终含有0.1%三氟乙酸。

当在γ射线图谱中观察到洗脱峰时，收集纯化产物。然后，将每种标记的复合物与含有0.125毫克相应镭-四嗪复合物的溶液共同进样，该溶液由20%甲醇水溶液配制而成。比较铼复合物在紫外图谱中的保留时间与锝复合物在γ射线图谱中的保留时间，以确认γ射线峰的身份。

从每种纯化的锝-四嗪配合物中除去溶剂。将每种配合物配制成浓度为7.4千贝可/微升的溶液，溶剂为含0.5%牛血清白蛋白和0.01%聚山梨酯80的磷酸盐缓冲液。对每只实验小鼠，用注射器吸取100微升浓度为5微克/微升的TCOPB衍生物生理盐水溶液，以制备20毫克/千克剂量。

将30号针头连接到给药注射器上。将小鼠放入物理固定装置中。在尾部侧面距尾尖约两厘米处辨认静脉，并用酒精棉片擦拭该区域。

将注射器针头以浅角度平行于静脉插入。缓慢注射TCOBP衍生物。拔出针头，并用干净的纱布轻轻按压注射部位，直至出血停止。

注射 TCOBP 衍生物一小时后，通过尾静脉注射给予 100 微升所需活度约为 0.74 兆贝可的锝-99m 四嗪复合物。在注射时，使用活度计测量锝-99m 复合物 100 微升测试样品的活度。保存该测试样品以供后续测量使用。

注射后六小时，使用3%异氟烷和2%氧气的混合气体对小鼠进行麻醉。将小鼠仰卧放置，鼻部置于鼻罩中以维持麻醉状态，并定位剑突。将25号针头连接至经肝素预处理的注射器上。

在胸骨剑突下方中线略偏左处，以20度角插入针头。针头完全插入后，缓慢回抽活塞，检查针座内是否有血液，以确认心脏穿刺成功。根据需要调整针头位置。

心脏穿刺后，缓慢将一毫升血液抽入注射器中。将血液样本转移至预先称重的计数管中。在麻醉状态下，通过颈椎脱位法处死小鼠。

将安乐死的动物放入塑料袋中，使用剂量校准仪测量其全身放射性活度。随后，采集膝关节和肩关节骨骼、胆囊、肾脏、肝脏、甲状腺和气管，以及尾部。连同其内容物一并采集胃、小肠、大肠和盲肠，以及膀胱。

用磷酸盐缓冲液冲洗所有采集的组织（胆囊和膀胱除外）。用滤纸吸干组织表面液体，将每种组织分别放入已称重的计数管中。测量尸体的残留放射活性。

称量每个组织样本，并计算组织本身的重量。使用多探测器γ计数器测量锝配合物测试样本中五微升（5 µL）等分试样的放射活性。根据测得的每分钟计数（counts per minute）以及注射时测得的放射活性，计算转换因子。

使用γ检测器测量每种组织和体液样本的放射活性。将测得的数值转换为微居里（µCi），并根据器官重量对每个数值进行归一化处理，以确定每克组织中所含注射剂量的百分比。另取未注射TCOPB衍生物的小鼠进行相同操作，作为阴性对照组重复该实验过程。

采用该方法，对五种在连接子和关键引导组合上不同的四嗪配合物进行了锝-99m标记。使用一种TCOPB衍生物对小鼠的肩关节和膝关节进行预靶向，该衍生物可定位于骨中钙转换率较高的区域。针对每种四嗪化合物，计算了骨组织与血液的每克组织百分注射剂量比值。

所有五种化合物均迅速从血液中清除并靶向骨骼，表明四嗪化合物与TCOBP衍生物之间的选择性生物正交偶联反应已在体内发生。其中化合物三表现出最优的靶向性与血液清除组合效果。阴性对照实验表明，在缺乏TCOBP衍生物的情况下，放射性标记的四嗪复合物未在骨骼中显著富集。

例如，当未给予 TCOBP 衍生物时，化合物二在胆囊和肠道中浓度较高，但在骨骼中含量极少。在接受 TCOBP 衍生物的小鼠中，五种测试化合物在组织分布上表现出显著差异。例如，与其他复合物相比，化合物三在大肠、肝脏以及尿液和膀胱中含量很少，而在骨骼中则检测到更高的含量。

一旦掌握，若操作正确，此处所述的标记技术可在不到两小时内完成。尝试该技术时，需确保所有试剂均准确称量，并在加入锝溶液前用氩气对盐类进行充分吹扫。此外，在加入四嗪配体前，必须将锝溶液的 pH 值调节至 3.5 到 4 之间。

观看本视频后，您应能够充分掌握如何制备和纯化锝标记的四嗪，以及如何利用预靶向策略和生物正交化学方法开发新型放射性药物。在处理放射性物质时，务必采取适当的防护措施，例如了解所发射辐射的类型，以及如何对样品进行有效的屏蔽和安全操作。