A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines

这种简单方法的总体目标是仅使用少量血液建立 B 淋巴母细胞样细胞系或具有高永生化效率的 B-LCLs，并节省起始和冷冻保存之间的时间。这是一种通过裂解红细胞使全血中人 B 细胞永生化的新方法。B-LCL 为开展各种研究提供了宝贵的生物材料来源。

该方法的主要优点是仅需 0.5 毫升血液即可获得具有永生化效率和高细胞活力的 B-LCLs。通过 Epstein-Barr 病毒或 EBV 建立 B-LCLs，通过 Ficoll 密度梯度离心将广泛使用的方法 B 淋巴细胞转化为单独的外周血单核细胞或 PBMC。但是，当样品中的红细胞裂解液少于 1 毫升时，添加将失败。

我们最初想到这种方法时，我们发现使用密度梯度分离方法很难从小红细胞中分离 PBMC。为了制备 EBV，在第一天开始解冻 B95-8 细胞，并在 T25 培养瓶中培养它们，其中含有 6 毫升补充有 10% FBS、2 毫摩尔 L-谷氨酰胺和抗生素的 RPMI 1640 完全培养基。在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育培养物。

第二天，在显微镜下观察细胞形态。当细胞明亮和圆润时，它们处于良好状态。向培养物中加入 10 mL 完全 RPMI 1640 培养基。

第 4 天，加入 10 mL 新鲜培养基，将细胞转移至 T75 培养瓶中。然后，在第 8 天，再添加 20 mLs 培养基，并将细胞维持 8 天，不添加新鲜培养基。第 16 天，在显微镜下检查细胞。

然后将 12 毫升细胞收集到 15 毫升离心管中。接下来，将细胞在零下 80 摄氏度下冷冻保存 1 小时，并在 37 摄氏度下快速解冻培养物。重复冻融，再冻融 3 次，直到病毒颗粒从细胞中释放出来。

室温下以 240 倍 g 离心培养物 10 分钟。然后，通过 0.22 微米过滤器过滤上清液。每管分装 12 毫升滤液，并将试管储存在零下 80 摄氏度。

向 50 mL 试管中加入 0.5 mL经 EDTA K2 抗凝的全血。向全血中加入 1 毫升红细胞裂解缓冲液并充分混合。将混合物在室温下孵育 4 分钟。然后快速加入 5 到 7 毫升 1x PBS 以终止裂解反应。

将红细胞裂解缓冲液加入血液中后，请务必充分混合。倒置可确保反应及时终止。接下来，在室温下以 240 x g 离心试管 5 分钟。

白细胞会在管底部沉淀。弃去上清液，加入 7 ml 1640 碱性培养基洗涤沉淀物。然后在重复洗涤之前离心溶液。

用 300 μL 转化培养基重悬细胞沉淀。然后进行 EBV 感染，向细胞悬液中加入 60 微升每毫升 20 微克的环孢菌素 A。在 37 摄氏度下快速解冻等分试样的 EBV，并向细胞中加入 240 微升病毒。

充分混合悬浮液，并将每孔 200 μL 转移到 96 孔板中。然后将板在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育。在 EBV 感染后的第一个月，每周更换一次细胞培养物中一半的培养基。

第 7 天，在显微镜下只能看到一层厚厚的细胞碎片。感染一个月后，在一层厚厚的细胞碎片下可以看到淋巴母细胞样细胞簇。从此时起，每三天更换一半的培养基，直到细胞簇在显微镜下清晰可见。

重悬细胞后，将悬浮液转移至 24 孔板的孔中。然后，根据细胞生长速度，当培养基变黄时，将 RPMI 1640 完全培养基的体积增加一倍。当肉眼可见淋巴母细胞样细胞簇时，将培养物转移到 T25 培养瓶中。

当培养基变黄时，将培养基的体积加倍，直到体积扩大到 10 至 15 毫升。冷冻前，请提前 24 小时更换培养基。然后要冷冻细胞，将细胞悬液离心并使用细胞计数器对细胞进行计数。

使用含有 90% FBS 和 10% DMSO 的冷冻储备溶液，将悬浮液调节至每毫升 10 至 6 个细胞的 5 至 10 倍密度。然后以每分钟 1 摄氏度的速度冷冻悬浮液至零下 80 摄氏度，然后将冷冻细胞直接转移到液氮中。在转化过程中，细胞的形态变化可以通过光学显微镜看到。

感染 7 天后，使用密度梯度分离法可以清晰地看到小细胞簇，而从红细胞裂解法只能看到一层厚厚的细胞碎片。感染后 30 天，在厚厚的细胞碎片层下可以看到淋巴母细胞样细胞簇。随着培养基更换的频繁，细胞碎片减少，细胞簇清晰可见，看起来与通过密度梯度分离建立的培养物相似。

最后，采用 MTT 法评价 B-LCLs 的活力。此处显示的结果表明，使用红血裂解法培养的 B-LCLs 细胞比使用密度梯度分离法建立的培养物具有显着更高的活力。一旦掌握，如果执行得当，EBV 病毒转化过程可以在 30 分钟内完成。

观看此视频后，您应该对如何使用简单且省时的红细胞裂解方法建立 B-LCL 有很好的了解，而无需事先纯化淋巴细胞。该技术发展后，加速了 EBV 相关疾病的基因组学、转录组学和蛋白质组学研究的进展，以及该技术在单核抗体生产中的应用。不要忘记，与 EBV 等人类病原体一起工作可能非常危险，因此在执行此程序时应始终采取预防措施。