一种简单的红细胞裂解方法用于建立B淋巴母细胞样细胞系

该简单方法的总体目标是仅用少量血液，在从启动到冷冻保存的较短时间内，高效建立B淋巴母细胞样细胞系（B-LCLs）。这是一种通过裂解红细胞从全血中永生化人B细胞的新方法。B-LCLs为开展各类研究提供了宝贵的生物材料来源。

该方法的主要优势在于，仅需 0.5 毫升血液即可获得具有高效永生化能力和高细胞活力的 B 淋巴母细胞样细胞系（B-LCLs）。目前建立 B-LCLs 的常用方法是利用爱泼斯坦-巴尔病毒（Epstein-Barr virus, EBV）转化 B 淋巴细胞，该方法通常需先通过 Ficoll 密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（PBMC）。然而，当样本量少于 1 毫升时，红细胞裂解步骤的添加将无法成功。

我们最初想到这种方法是因为使用密度梯度分离法从小量红细胞中分离PBMC较为困难。为制备EBV，第一天首先将B95-8细胞解冻，并将其接种于含6毫升完全RPMI 1640培养基的T25培养瓶中，培养基中需添加10% FBS、2毫摩尔L-谷氨酰胺及抗生素。将细胞培养物置于37摄氏度、5%二氧化碳环境中孵育。

第二天，在显微镜下观察细胞形态。当细胞呈明亮且圆形时，表明细胞状态良好。向培养物中加入10毫升完全RPMI 1640培养基。

第4天，加入10毫升新鲜培养基，并将细胞转移至T75培养瓶中。第8天，再加入20毫升培养基，之后连续8天不再添加新鲜培养基。第16天，在显微镜下观察细胞。

然后将12毫升细胞收集到15毫升离心管中。接着，在-80摄氏度下冷冻细胞1小时，再于37摄氏度迅速解冻培养物。重复冻融过程三次，直至病毒颗粒从细胞中释放出来。

在室温下以 240 × g 离心培养物 10 分钟。然后，将上清液通过 0.22 微米滤膜过滤。每管分装 12 毫升滤液，并将试管置于 -80 °C 保存。

向一个50毫升离心管中加入0.5毫升经EDTA K2抗凝的全血。向全血中加入1毫升红细胞裂解缓冲液，并充分混匀。将混合物在室温下孵育4分钟。然后迅速加入5至7毫升1×PBS以终止裂解反应。

加入红细胞裂解缓冲液至血液后，务必充分混匀。倒置混匀可确保及时终止反应。接下来，在室温下以240 ×g离心5分钟。

白细胞将沉淀在试管底部。弃去上清液，通过加入7 mL的1640基础培养基洗涤沉淀物，然后离心溶液，并重复洗涤步骤。

加入 300 微升转化培养基，重悬细胞沉淀。随后进行 EBV 感染，向细胞悬液中加入 60 微升浓度为 20 微克/毫升的环孢素 A。将一份 EBV 样品在 37 摄氏度快速解冻，并向细胞中加入 240 微升病毒液。

充分混匀悬浮液，每孔加入200微升至96孔板中。随后将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育。EBV感染后的第一个月内，每周更换一次细胞培养基的一半。

第7天，在显微镜下仅可见一层厚厚的细胞碎片。感染一个月后，在细胞碎片厚层下可见淋巴母细胞样细胞簇。此后，每3天更换一半培养基，直至在显微镜下清晰可见细胞簇为止。

重悬细胞后，将细胞悬液转移至24孔板的各孔中。随后根据细胞生长速度，当培养基颜色变黄时，加入等量的完全RPMI 1640培养基以扩大培养体积。当肉眼可见淋巴母细胞样细胞簇时，将培养物转移至T25培养瓶中。

当培养基变黄时，将培养基体积增加一倍，直至总体积达到10至15毫升。冷冻前，提前24小时更换培养基。随后进行细胞冻存时，先离心细胞悬液，并使用细胞计数器对细胞进行计数。

使用含有90% FBS和10% DMSO的冻存液，将细胞悬液调整至浓度为每毫升5×10⁶至10×10⁶个细胞。然后以每分钟降低1°C的速率将悬液冷冻至-80°C，再将冻存的细胞直接转移至液氮中保存。在转化过程中，可通过光学显微镜观察到细胞的形态学变化。

感染七天后，采用密度梯度分离法可清晰观察到少量细胞簇，而红细胞裂解法则仅可见一层较厚的细胞碎片。感染30天后，在细胞碎片厚层下方可见淋巴母细胞样细胞簇。通过更频繁地更换培养基，细胞碎片减少，细胞簇变得清晰可见，其形态与通过密度梯度分离法建立的培养物相似。

最后采用 MTT 法检测 B-LCLs 的细胞活力。此处结果显示，采用红细胞裂解法培养的 B-LCLs 细胞活力显著高于使用密度梯度离心法建立的培养体系。一旦掌握，EBV 病毒转化过程若操作得当，可在 30 分钟内完成。

观看本视频后，您应能够充分理解如何利用一种简单且节省时间的红细胞裂解法建立B淋巴母细胞样细胞系（B-LCLs），该方法无需预先纯化淋巴细胞。该技术建立后，显著加快了EBV相关疾病的基因组学、转录组学和蛋白质组学研究进展，并推动了其在单克隆抗体生产中的应用。请务必注意，EBV等人源病原体具有极高危险性，操作过程中必须始终采取适当防护措施。