Name: 一个简单的红细胞溶解法对B淋巴母细胞系的建立 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: 学习一种简单的红细胞溶解法建立B淋巴母细胞系，仅需0.5毫升血液即可实现高效永生化，显著缩短从启动到冷冻保存的时间，为免疫学和细胞生物学研究提供实用方案。

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本工作得到了中国科学院重点项目的资助（KFZD-SW-205），以及中国科学院战略生物资源技术支撑体系项目（CZBZX-1）的支持。

本研究已获得遗传与发育生物学研究所伦理委员会的批准，且研究方案遵循人类福利的机构指南。
1. EB 病毒的制备
<ol>
	<li>第1天，解冻B95-8细胞，将其接种于T25培养瓶中，加入6 mL完全RPMI 1640培养基（含10%胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺以及抗生素[100 µg/mL链霉素、100 U/mL青霉素]）进行培养。将培养瓶置于5% CO₂培养箱中。2 37 °C 培养箱中孵育。</li>
	<li>第2天，在显微镜下观察细胞形态。细胞呈明亮且圆形时状态良好。加入10 mL完全RPMI 1640培养基。</li>
	<li>第4天，加入10 mL新鲜的完全RPMI 1640培养基，然后转移至T75培养瓶中。</li>
	<li>第8天，加入20 mL完全RPMI 1640培养基。</li>
	<li>培养细胞8天，期间不添加新鲜培养基， 即，饥饿。</li>
	<li>第16天，在显微镜下观察细胞。将细胞收集至15 mL离心管中，每管12 mL。</li>
	<li>在 -80 °C 条件下冷冻保存 1 小时，然后在 37 °C 快速解冻。重复 3 次，直至病毒颗粒从细胞中释放。</li>
	<li>在室温下以 240 x g 离心 10 分钟。</li>
	<li>将上清液通过0.22 µm滤器过滤，分装，每管12 mL，于-80 °C保存。</li>
</ol>
2. 使用红细胞裂解缓冲液处理全血
<ol>
	<li>取0.5 mL经EDTA·K2抗凝的全血加入至15 mL离心管中。</li>
	<li>向全血中加入1 mL红细胞裂解液（使用前经0.22 µm滤器过滤并解冻至室温），充分混匀。室温放置4分钟，随后迅速加入5–7 mL 1×PBS以终止反应。</li>
	<li>在室温下以240 × g离心5分钟，白细胞将沉淀于管底。</li>
	<li>弃去上清液，加入7 mL 1640基础培养基重悬沉淀，于室温下以240 × g离心5分钟。重复洗涤两次。</li>
	<li>用300 µL转化培养基（RPMI 1640培养基，含20%胎牛血清和10 µg/mL植物血凝素（PHA））重悬细胞沉淀。</li>
</ol>
3. EBV 感染
<ol>
	<li>向细胞悬液中加入 60 µL 浓度为 20 µg/mL 的环孢素 A（CsA）。</li>
	<li>将一份 EBV 样本在 37 °C 下快速解冻，然后向细胞悬液中加入 240 µL EBV。</li>
	<li>充分混匀后，将细胞悬液转移至 96 孔板中，每孔 200 µL。为防止蒸发，在 96 孔板周围每孔加入 200 µL 1× PBS。将该板置于 37 °C、5% CO2 的培养箱中。</li>
</ol>
4. B-LCL 的扩增与冷冻保存
<ol>
	<li>EBV 感染后的第一个月内，每周更换一次半量培养基。感染第 7 天时，显微镜下仅可见较厚的细胞碎片层（图 2）。EBV 感染一个月后，显微镜下可在较厚的细胞碎片层下方观察到淋巴母样细胞簇（图 2）。</li>
	<li>每 3 天更换半量培养基，直至显微镜下清晰可见细胞簇（图 2）。该过程通常需要 10 至 20 天。</li>
	<li>混匀后，用移液器吸取细胞并转移至 24 孔板。当培养基变黄时，使用完全 RPMI 1640 培养基将培养液体积加倍。此过程取决于细胞生长速度。</li>
	<li>随后将细胞转移至 T25 培养瓶。当培养基变黄时即加倍培养液体积，直至培养基总体积达到 10 - 15 mL。</li>
	<li>冻存前 24 小时更换培养基。将细胞悬液以 240 × g 离心 5 分钟。使用细胞计数仪计数细胞，并以 5 - 10 × 106/mL 的密度悬浮于含 90% 胎牛血清和 10% 二甲基亚砜（DMSO）的冻存液中。以每分钟 1 °C 的速率降温至 -80 °C，然后直接转移至液氮中保存。</li>
</ol>
5. 3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）实验17
<ol>
	<li>用含10%胎牛血清的1640培养基制备B-LCLs单细胞悬液。每孔接种3 × 104 个细胞至96孔板，每孔100 µL。</li>
	<li>将培养板置于37 °C、5% CO2 培养箱中孵育12–16小时。</li>
	<li>向细胞生长的孔中加入MTT（5 mg/mL），于37 °C避光孵育4小时。</li>
	<li>以168 × g离心细胞板10分钟。</li>
	<li>移除上清液，每孔加入100 µL DMSO。 
	注意：操作需小心，避免触碰针状染料结晶。</li>
	<li>以低速振荡培养板10分钟，使结晶充分溶解。</li>
	<li>使用酶标仪在570 nm波长处测定吸光度。</li>
</ol>

<ol><li>Mohyuddin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+instability+in+EBV-transformed+lymphoblastoid+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Genetic instability in EBV-transformed lymphoblastoid cell lines.</a> Biochim Biophys Acta. 1670 (1), 81-83 (2004).</li>
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<li>Toda, T., Sugimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome+analysis+of+Epstein-Barr+virus-transformed+B-lymphoblasts+and+the+proteome+database%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B+Analyt+Technol+Biomed+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Proteome analysis of Epstein-Barr virus-transformed B-lymphoblasts and the proteome database.</a> J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 787 (1), 197-206 (2003).</li>
<li>Chiorazzi, N., Wasserman, R. L., Kunkel, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Epstein-Barr+virus-transformed+B+cell+lines+for+the+generation+of+immunoglobulin-producing+human+B+cell+hybridomas%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Use of Epstein-Barr virus-transformed B cell lines for the generation of immunoglobulin-producing human B cell hybridomas.</a> J Exp Med. 156 (3), 930-935 (1982).</li>
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<li>Lacelle, C., Wang, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+lymphoblastoid+cell+lines+from+frozen+blood+of+extremely+old+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">Establishing lymphoblastoid cell lines from frozen blood of extremely old individuals.</a> Mech Ageing Dev. 123 (10), 1415-1418 (2002).</li>
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<li>Chenevixtrench, G., Kerr, B., Walters, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphoblastoid+Cell-Lines+from+Frozen+Whole-Blood+-+a+Quick+and+Economical+Safeguard+for+Linkage+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Lymphoblastoid Cell-Lines from Frozen Whole-Blood - a Quick and Economical Safeguard for Linkage Analysis.</a> Am J Hum Genet. 46 (1), 635-636 (1990).</li>
<li>Hansen, M. B., Nielsen, S. E., Berg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-Examination+and+Further+Development+of+a+Precise+and+Rapid+Dye+Method+for+Measuring+Cell-Growth+Cell+Kill%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Re-Examination and Further Development of a Precise and Rapid Dye Method for Measuring Cell-Growth Cell Kill.</a> J Immunol Methods. 119 (2), 203-210 (1989).</li>
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<li>Ambach, A., Bonnekoh, B., Gollnick, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Routine+flow+cytometric+immuno-staining+of+T-cell+perforin+is+preserved+using+diethylene+glycol+for+erythrocyte-lysis+but+lost+by+the+use+of+ammonium+chloride%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Routine flow cytometric immuno-staining of T-cell perforin is preserved using diethylene glycol for erythrocyte-lysis but lost by the use of ammonium chloride.</a> Exp Dermatol. 12 (6), 825-831 (2003).</li>
<li>Beck, J. C., Beiswanger, C. M., John, E. M., Satariano, E., West, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+transformation+of+cryopreserved+lymphocytes%3A+A+resource+for+epidemiological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Epidemiol+Biomarkers+Prev%22%5BJournal%5D)">Successful transformation of cryopreserved lymphocytes: A resource for epidemiological studies.</a> Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 10 (5), 551-554 (2001).</li>
<li>Tosato, G., Cohen, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Epstein-Barr+Virus+%28EBV%29-immortalized+B+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Generation of Epstein-Barr Virus (EBV)-immortalized B cell lines.</a> Curr Protoc Immunol. , Chapter 7, Unit 7 22(2007).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

我们报道了一种通过裂解红细胞从全血中永生化人B细胞的新方法，并采用MTT法评估所建立的B淋巴母细胞样细胞系（B-LCLs）的细胞活力。结果表明，采用红细胞裂解法建立的B-LCLs细胞活力显著高于密度梯度离心分离法。红细胞裂解法的主要优势在于操作简便，仅需少量血液（最少0.5 mL）即可高成功率地建立具有高细胞活力的永生细胞系。
EBV 感染前仅需一个简单的裂解步骤。无需预先纯化淋巴细胞，可避免细胞损失和细胞损伤。密度梯度分离法的另一个问题是溶血。血液在不适宜的温度下长期储存，或在运输过程中发生震荡，可能导致溶血，从而严重影响淋巴细胞的分离。其他研究表明，与密度梯度分离法相比，使用红细胞（RBC）裂解法可获得更高数量的活PBMC18，且对淋巴细胞亚群的影响较小19。与成本较高且操作繁琐的密度梯度分离法相比，红细胞裂解法更为简便，尤其适用于处理大量临床样本，对初学者也更具实用性。
在本研究中，我们采用红细胞裂解法对24个样本进行了永生化，成功率达到100%。与使用2–2.5 mL血液时，...

静息B细胞可被EB病毒（EBV）转化 体外 转化为活跃增殖的B淋巴母细胞样细胞系（B-LCLs）。B-LCLs在分化与发育方面与生殖细胞相似，其体细胞突变率仅为0.3%1，且遗传和表型改变极小。因此，B淋巴母细胞样细胞系（B-LCLs）作为外周血单个核细胞（PBMCs）的替代物，已显著推动了EBV相关疾病在基因组学、转录组学和蛋白质组学研究中的进展2,3此外，B淋巴母细胞样细胞系（B-LCLs）在单克隆抗体筛选中也具有重要应用。4,5. 
已开发出多种利用EBV实现B淋巴细胞永生化的方法。其中最主要的常规操作包括B淋巴细胞的分离以及使用B95-8细胞系产生具有感染性的EBV。从分离到转化，这些方法可分为三种策略。本研究中，通过密度梯度离心法从新鲜血液中分离淋巴细胞，并直接进行EBV转化6-8，该方法称为密度梯度分离法。然而，其他技术克服了新鲜血液运输困难的问题，采用先冷冻纯化的淋巴细胞，再进行后续解冻及EBV感染的流程9-11。冷冻保存的全血也可用于B淋巴细胞的分离与转化12,13。除了密度梯度离心法分离B淋巴细胞外，部分研究人员采用磁性细胞分选仪来富集B淋巴细胞12。然而，磁性分离是一种成本高、操作复杂且耗时的过程。尽管这些方法在高效永生化B淋巴细胞方面具有较高成功率，但在需要处理大量临床样本且血液体积相对较小的情况下，仍需建立一种更为简便的方法以获得稳定的永生细胞系。
另一种较少使用的方法是采用全血作为EBV感染和建立B淋巴母细胞样细胞系（B-LCLs）的有核细胞来源。这些方法通过省略细胞分离步骤而使操作更为简便。仅需少量全血，无论是新鲜14还是冻存15,16的样本，均足以获得细胞系。然而，根据文献15,16记载及我们多项验证实验的结果，该方法的成功率存在较大差异。此外，由于存在大量杂质污染，显微镜下难以识别已转化的细胞克隆。因此，亟需一种更为可靠的转化方法。
基于上述考虑，我们开发了一种无需预先纯化淋巴细胞即可建立B淋巴母细胞样细胞系（B-LCLs）的新方法，称为红细胞裂解法。该方法操作简便、节省时间，适用于大量样本。仅需0.5 mL全血即可获得B-LCLs，尤其适用于婴幼儿和老年人，对其健康无明显损害。

<table><tbody><tr><td>离心机</td><td>Techcomp</td><td>CT6T</td><td>离心</td></tr><tr><td>自动细胞计数仪&amp;nbsp;</td><td>Countstar</td><td>&amp;nbsp;IC 1000&amp;nbsp;</td><td>用于细胞计数&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Epoch 微孔板分光光度计</td><td>BioTek Instruments</td><td>SN263839</td><td>用于测定吸光度</td></tr><tr><td>96 孔细胞培养板</td><td>Corning Incorporated</td><td>3599</td><td>聚苯乙烯板</td></tr><tr><td>24 孔细胞培养板</td><td>Corning Incorporated</td><td>3524</td><td>聚苯乙烯板</td></tr><tr><td>25 cm&lt;sup&gt;2 &lt;/sup&gt; 细胞培养瓶</td><td>Nest</td><td>707001</td><td>聚苯乙烯&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270</td><td>B-LCLs 培养基组分</td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基</td><td>Gibco</td><td>31800-022</td><td>用于 B-LCLs 培养基</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Amresco</td><td>0374</td><td>B-LCLs 培养基组分</td></tr><tr><td>100x 链霉素-青霉素溶液 BioRoYeeBRY-2309</td><td>BioRoYee</td><td>BRY-2309</td><td>B-LCLs 培养基组分</td></tr><tr><td>Ficoll paque plus</td><td>GE&amp;nbsp; Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td>用于 &lt;em&gt;in vitro&lt;/em&gt; 淋巴细胞分离</td></tr><tr><td>PHA-M</td><td>Sigma</td><td>L8902</td><td>用于刺激淋巴细胞增殖</td></tr><tr><td>环孢素 A</td><td>Cayman&amp;nbsp; Chemical</td><td>12088</td><td>用于抑制 T 细胞的细胞毒性作用</td></tr><tr><td>红细胞裂解缓冲液</td><td>Tiangen</td><td>RT122-01</td><td>用于裂解红细胞</td></tr><tr><td>MTT</td><td>Amresco</td><td>0793</td><td>用于检测细胞活力</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td>用于细胞冻存</td></tr></tbody></table>

一种简单的红细胞裂解方法用于建立b淋巴母细胞样细胞系

A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines

存在多种利用爱泼斯坦-巴尔病毒转化B淋巴细胞的方法 体外 建立永生化细胞系。我们开发了一种高效且简便的建立B淋巴母细胞样细胞系（B-LCLs）的新方法——红细胞裂解法。该方法通过去除红细胞简化了外周血单个核细胞（PBMC）的分离步骤，仅需0.5 mL全血即可建立EB病毒（EBV）永生化细胞系，可在相对较短的时间内获得大量增殖的细胞，建系成功率达100%。该方法操作简便、结果可靠、节省时间，适用于大规模临床样本的处理。

在转化过程中，可通过光学显微镜观察细胞的形态学变化（图2）。感染7天后，采用密度梯度分离法可清晰观察到少量细胞簇，而红细胞裂解法则仅可见一层较厚的细胞碎片。然而，在感染后30天，可在细胞碎片厚层下方观察到淋巴母细胞样细胞簇。通过更频繁地更换培养基，细胞碎片逐渐减少，细胞簇变得清晰可见，并呈现出与密度梯度分离法所建立的相同图像。
当细胞系成功建立后，采用MTT法检测B-LCLs的细胞活力。根据文献17，选取不同方法建立的B-LCLs进行细胞活力检测，并以1640培养基作为空白对照。结果显示，采用红细胞裂解法建立的B-LCLs细胞活力显著高于密度梯度离心法建立的B-LCLs（图3）。
<img alt="血细胞培养流程图：全血裂解、PBS洗涤、转移...

开发了一种简单的红细胞裂解方法用于建立B淋巴母细胞系（B-LCLs），该方法具有高永生化效率，仅需少量血液样本，并可缩短从起始到冻存所需的时间。

一种简单的红细胞裂解方法用于建立B淋巴母细胞样细胞系

已存在多种方法可利用 Epstein Barr 病毒在体外将 B 淋巴细胞转化为永生化细胞系。我们开发了一种新的……

本方法的总体目标是利用少量血液，在从启动到冻存的整个过程中节省时间，高效建立B淋巴母细胞样细胞系（B-LCLs）。这是一种通过裂解红细胞，从全血中永生化人B细胞的新型方法。B-LCLs可为开展各类研究提供宝贵的生物材料来源。该方法的主要优势在于，仅需 0.5 毫升血液即可获得具有高效永生化能力和高细胞活力的 B 淋巴母细胞样细胞系（B-LCLs）。目前建立 B-LCLs 的常用方法是利用爱泼斯坦-巴尔病毒（Epstein-Barr virus, EBV）转化 B 淋巴细胞，该方法通常需先通过 Ficoll 密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（PBMC）。然而，当样本量少于 1 毫升时，红细胞裂解步骤的添加将无法成功。我们最初想到该方法时发现，使用密度梯度分离法从小红细胞中分离PBMC较为困难。为制备EBV，第1天首先将B95-8细胞解冻，并将其在含有10% FBS、2毫摩尔L-谷氨酰胺和抗生素的6毫升完全RPMI 1640培养基中接种于T25培养瓶中。将细胞培养物在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育。在第二天，在显微镜下观察细胞形态。当细胞呈明亮且圆形时，表明其状态良好。向培养物中加入 10 毫升完全 RPMI 1640 培养基。第4天，加入10毫升新鲜培养基，并将细胞转移至T75培养瓶中。然后在第8天，再加入20毫升培养基，之后八天内不再添加新鲜培养基以维持细胞培养。第16天，在显微镜下观察细胞。然后将12毫升细胞收集到15毫升离心管中。接下来，将细胞在-80摄氏度下冷冻保存1小时，然后在37摄氏度下快速解冻。重复冻融过程，再进行三次，直至病毒颗粒从细胞中释放出来。在室温下以 240 × g 离心培养物 10 分钟。然后，将上清液通过 0.22 微米滤器过滤。每管分装 12 毫升滤液，并将试管置于 -80 °C 保存。向一个50毫升离心管中加入0.5毫升经EDTA K2抗凝的全血。向全血中加入1毫升红细胞裂解缓冲液，并充分混匀。将混合物在室温下孵育4分钟。然后迅速加入5至7毫升1×PBS以终止裂解反应。加入红细胞裂解缓冲液后，务必充分混匀。颠倒混匀可确保及时终止反应。接下来，在室温下以 240 ×g 离心 5 分钟。白细胞将沉淀在试管底部。弃去上清液，通过加入7 mL的1640基础培养基洗涤沉淀物，然后离心溶液，并重复洗涤步骤。用 300 微升转化培养基重悬细胞沉淀。随后进行 EBV 感染，在细胞悬液中加入 60 微升浓度为 20 微克/毫升的环孢素 A。将一份 EBV 样品在 37 摄氏度下快速解冻，并向细胞中加入 240 微升病毒液。充分混匀悬浮液，每孔加入200 µL至96孔板中。随后将培养板置于37°C、5% CO₂条件下孵育。EBV感染后的第一个月内，每周更换一次细胞培养基的一半。第七天，在显微镜下仅可见一层厚厚的细胞碎片。感染一个月后，在细胞碎片厚层下可见淋巴母细胞样细胞簇。此后，每三天更换一半培养基，直至在显微镜下细胞簇清晰可见。重悬细胞后，将细胞悬液转移至24孔板的各孔中。随后根据细胞生长速度，当培养基颜色变为黄色时，加入等量的完全RPMI 1640培养基。当肉眼可见淋巴母细胞样细胞簇时，将培养物转移至T25培养瓶中。当培养基变黄时，将培养基体积加倍，直至总体积达到 10 至 15 毫升。冷冻前 24 小时更换一次培养基。然后进行细胞冻存，先离心细胞悬液，并使用细胞计数器对细胞进行计数。使用含有90% FBS和10% DMSO的冻存液，将细胞悬液调整至浓度为每毫升5×10⁶至10×10⁶个细胞。然后以每分钟降低1°C的速率将悬液冷冻至-80°C，随后直接转移至液氮中保存。在转化过程中，可通过光学显微镜观察到细胞的形态学变化。感染7天后，采用密度梯度分离法可清晰观察到少量细胞簇，而红细胞裂解法仅可见一层较厚的细胞碎片。感染30天后，在细胞碎片层下方可见淋巴母样细胞簇。通过更频繁地更换培养基，细胞碎片减少，细胞簇变得清晰可见，其形态与通过密度梯度分离法建立的培养物相似。最后采用 MTT 法检测 B-LCLs 的细胞活力。结果显示，采用红细胞裂解法培养的 B-LCLs 细胞活力显著高于使用密度梯度离心法建立的培养体系。EBV 病毒转化过程若操作熟练，可在 30 分钟内完成。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用一种简单且节省时间的红细胞裂解方法建立B淋巴母细胞样细胞系（B-LCLs），而无需预先纯化淋巴细胞。该技术建立后，显著加快了EBV相关疾病的基因组学、转录组学和蛋白质组学研究进展，并推动了其在单克隆抗体生产中的应用。请务必注意，EBV等人源病原体具有极高危险性，进行该操作时必须始终采取适当的防护措施。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

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学习一种简单的红细胞溶解法建立B淋巴母细胞系，仅需0.5毫升血液即可实现高效永生化，显著缩短从启动到冷冻保存的时间，为免疫学和细胞生物学研究提供实用方案。

一种简单的红细胞裂解方法用于建立B淋巴母细胞样细胞系

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