基于荧光的淋巴细胞检测适用于小分子的高通量筛选
2017年3月10日
我们提出在目前的研究使用从转基因小鼠衍生的淋巴细胞的新颖的基于荧光的测定法。该测定是适于赋予的任抑制或促进淋巴细胞的活化的能力的小分子的高通量筛选（HTS）。
这种基于荧光的淋巴细胞检测的总体目标是鉴定新的小分子免疫调节剂。这种方法可以帮助回答免疫学领域关于淋巴细胞活化和抑制机制的关键问题。这种表型功能和测定的主要优点是它可以适应药物发现。
演示该程序的是我们实验室的研究生 Ahmed Fouda。在无菌工作罩下，用 70% 乙醇对 6 到 8 周龄雌性 Nurr77 GFP 小鼠的皮毛进行消毒，并将动物放在右侧。接下来，在左上腹象限的皮肤和肌肉上切开，找到并切除脾脏，将组织放入冰上的脾细胞培养基中。
收集完所有脾脏后，将组织转移到含有 5 毫升预热脾细胞培养基的 10 平方厘米的细胞培养皿中，并使用无菌注射器柱塞捣碎组织，直到溶液浑浊。在脾细胞培养基中充分混合后，通过 70 微米细胞过滤器将细胞悬液过滤到 50 毫升试管中以去除任何碎片，然后离心所得单细胞悬液。将沉淀重悬于 2 至 3 mL 红细胞裂解缓冲液中，20 至 30 秒后用 5 mL RPMI 或其他合适的缓冲液浸湿反应物。
然后用另一次离心收集细胞，并将沉淀重悬于 twp ml 脾细胞培养基中用于细胞计数。为了分离 T 细胞，再次离心细胞，并以 1 倍 10 至 7 个细胞/毫升的浓度将沉淀重悬于无血清 RPMI 培养基中。将细胞转移到 5 mL 聚苯乙烯管中，并留出 100 μL 等分试样的脾细胞，以便稍后用于纯度评估。
接下来，向细胞中加入每毫升 50 微升的正常大鼠血清，然后加入每毫升 50 微升的 T 细胞分离抗体混合物，轻轻混合。10 分钟后，将细胞与链霉亲和素偶联的磁珠孵育 2 分半钟。然后，向细胞中加入最终体积为 2.5 mL 的无血清培养基，并将试管放入细胞分离磁力架中 3 分钟。
孵育结束时，将试管放在磁力架中，将上清液一次性倒入新的聚苯乙烯试管中。然后可以计数 T 细胞。将 T 细胞以 2.5 倍的浓度接种到圆底 96 孔板中，每孔 10 至第五个细胞，每孔含有 200 微升新鲜脾细胞培养基。
将重组白细胞介素 7 和 CD3/CD28 磁珠添加到适当的孔中，并将板置于细胞培养箱中。12 小时后，轻轻研磨每个孔中的细胞悬液，以打碎任何微珠细胞聚集体。然后将细胞悬液从每个孔转移到单独的 5 ml 聚苯乙烯管中。
收集完所有细胞后，将每管细胞放入分离磁力架中，每次 5 分钟，当试管仍在磁力架内时，将上清液倒出到新的聚苯乙烯管中，每次孵育结束时。然后通过离心收集细胞，并将沉淀以每毫升浓度的两倍 10 倍重悬于新鲜的脾细胞培养基中至第六个细胞。对于小分子高通量筛选，在 384 孔板中每孔接种 40 μL 细胞，并在细胞培养箱中用所选药物或载体处理适当的孔，以达到所需的处理期。
GFP 分析前 30 分钟，用适当浓度的 Hoechst 溶液对细胞进行染色，轻轻移液充分分布染色剂。当所有孔都染色后，离心板以收集孔底部的细胞，并让细胞在室温下静置 15 分钟。根据制造商的说明装入板。
然后，将目标设置为 40 倍或更高。为 UV 灯设置相机编号 4，然后为激光 488 设置相机编号 1。将板加载到高内涵筛选系统中。
接下来，将自动共聚焦高内涵筛选系统设置为在 488 纳米和紫外光下每孔读取 6 到 10 个视野，每个视野有两个连续读数。CD3 阳性 T 细胞约占给定小鼠脾脏的 30%，表明基础 GFP 表达为 10%。CD3/CD28 T 细胞受体珠刺激后，观察到 GFP 表达百分比增加 5 至 6 倍。
同样，CD19 阳性 B 细胞占总脾细胞的 50% 至 55%，基础 GFP 表达与未活化的 T 细胞相似。有趣的是，使用抗小鼠 IgG、IgM 和重组 CD40L 刺激 B 细胞受体仅触发 GFP 表达的微不足道的增加。如刚才所示，磁珠分离后，分离的 CD3 阳性 T 细胞仍显示 10% 的基础 GFP 表达。
然而，CD3/CD28 珠刺激诱导 GFP 反应的显着上调。同样，在 B 细胞磁珠分离后，与脾细胞中活化的 B 细胞相比，纯化的活化 B 细胞表现出更高的 GFP 表达。在这个代表性实验中，对 4398 种化合物的初级高通量筛选揭示了 T 细胞活化的几种激活剂和抑制剂。
但观察到的受刺激 T 细胞的 GFP 表达比未受刺激的 T 细胞测得的 GFP 表达高 20 倍。允许生成一个作用区窗口，在该窗口中可以轻松检测 GFP 抑制化合物。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在 36 到 48 小时内完成。
在尝试此过程时，请务必记住在每个步骤后对细胞进行计数。按照此程序，可以执行其他方法，如 ELISA 或 western blotting 来回答任何其他附加问题。这项技术将为啮齿动物的药物发现免疫调节铺平道路。
观看此视频后，您应该对如何分离和激活源自 Nurr77 GFP 小鼠板的 T 细胞或 B 细胞有很好的了解。
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概述
本研究提出了一种利用转基因小鼠淋巴细胞的新型荧光基测定法，旨在高通量筛选可以调节淋巴细胞活化的小分子。
关键研究组成部分
科学领域
- 免疫学
- 药物发现
- 细胞生物学
背景
- 该测定法专注于识别小分子免疫调节剂。
- 它解决了有关淋巴细胞活化机制的关键问题。
- 该方法适用于药物发现应用。
- 程序演示由一名研究生进行。
研究目的
- 开发免疫调节剂的高通量筛选方法。
- 增强对淋巴细胞活化和抑制的理解。
- 为未来的药物发现努力提供平台。
使用的方法
- 荧光基测定法开发。
- 从Nurr77 GFP转基因小鼠中分离淋巴细胞。
- 小分子的高通量筛选。
- 淋巴细胞活化的体外分析。
主要结果
- 成功识别出调节淋巴细胞功能的小分子。
- 展示了测定法在药物发现中的适应性。
- 提供了淋巴细胞活化机制的洞见。
- 为未来的免疫学研究建立了可靠的方法。
结论
- 荧光基测定法是免疫学研究的有前景的工具。
- 它可以促进新免疫调节药物的发现。
- 该研究有助于深入理解淋巴细胞生物学。
常见问题
Executive Industry Relevance
High-throughput phenotypic screening of lymphocyte activation using a fluorescence-based assay enables rapid identification of immunomodulatory small molecules without a predefined target hypothesis. This platform supports early-stage drug discovery in immunology and transplantation by providing quantitative, scalable readouts of T and B cell responses. The assay's adaptability and throughput position it as a critical tool for portfolio triage and mechanistic de-risking in immunomodulator pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of immunomodulatory hypotheses in primary lymphocytes using functional readouts.
- Supports biological de-risking by quantifying activation and inhibition across diverse compound libraries.
- Facilitates predictive confidence in target-agnostic screening for novel immune modulators.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, quantitative GFP-based outputs for high-throughput compound evaluation.
- Ensures reproducibility and scalability through automated confocal imaging and multi-well formats.
- Prepares validated cellular systems for downstream mechanistic or secondary assays.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant immune pathways by modeling T and B cell activation in vitro.
- Provides continuity from phenotypic screening to in vivo validation of immunomodulatory hits.
- Enables risk-adjusted advancement of candidates based on functional immune modulation profiles.
Pipeline & Workflow Integration
This fluorescence-based lymphocyte assay integrates at the early discovery and lead identification stages, bridging phenotypic screening with mechanistic follow-up and preclinical validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-free screening and pathway clarification in immune cell activation.
- Screening: Offers robust, quantitative readouts for high-throughput evaluation of thousands of compounds.
- Analytics: Provides GFP intensity measurements to compare activation states and identify modulators.
- Translational Research: Facilitates selection of candidates for further in vitro and in vivo immunological studies.
- Enterprise Reuse: Adaptable to various immune cell types and compound libraries for broad portfolio application.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in immunomodulator discovery.
- Operational Value: Standardizes and accelerates screening workflows with scalable, reproducible outputs.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling early functional triage.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of immunomodulatory candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary lymphocyte isolation and high-content fluorescence imaging.
- Needs access to automated confocal screening platforms and analytical infrastructure.
- Demands cross-team standardization of cell preparation and assay conditions.
- Adaptable to different immune cell subtypes and compound libraries with protocol optimization.
- Dependent on robust cell viability and activation controls for reliable data interpretation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:40
Generation of Splenocyte Cell Suspension from Nur77GFP Mouse Spleens
2:07
T Cell Isolation from the Splenocyte Cell Suspension
3:26
T-cell Activation and the Induction of GFP Expression
4:42
High Throughput Screening of Small Molecule
6:05
Results: T and B Cell Receptors Activation Flowcytometry Results and a Representative T Cell HTS of Smal Molecules
7:56
Conclusion
