Name: 基于荧光的淋巴细胞检测适用于小分子的高通量筛选 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: 了解基于荧光的淋巴细胞检测方法，用于高通量筛选小分子免疫调节剂。该方法利用Nurr77 GFP转基因小鼠分离淋巴细胞，为免疫学研究和药物发现提供可靠平台。

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本工作得到了蒙特利尔大学提供的默克弗罗斯特启动资金的支持。我们感谢免疫学与癌症研究所高通量平台的Jean Duchaine博士和Dominic Salois博士在讨论、评论和反馈方面提供的帮助。Moutih Rafei 获魁北克健康研究基金会青年一级奖。

所有动物实验方案均经蒙特利尔大学动物护理委员会批准。小鼠通过逐渐吸入 CO2 实施安乐死，直至观察不到生命体征，随后进行颈椎脱位。该操作由经认证的人员执行，以确保动物的安乐死过程符合加拿大动物护理委员会的建议，且以人道方式进行。
1. 脾细胞培养基和流式细胞术缓冲液的制备
<ol>
	<li>所有步骤均须在经70%乙醇清洁的生物安全柜中进行。</li>
	<li>取出70 mL预热的RPMI 1640 1x培养基（商品化产品，以过滤灭菌的500 mL瓶装提供），置于无菌离心管中。该培养基将在后续实验步骤中使用。</li>
	<li>向剩余的430 mL RPMI 1640 1x培养基中添加50 mL灭活胎牛血清（FBS）、5 mL青霉素/链霉素、5 mL HEPES、5 mL非必需氨基酸、5 mL丙酮酸钠以及0.05 mL过滤除菌的（1 M）2-巯基乙醇。 
	注意：使用37 ºC水浴预热脾细胞培养基，以避免对细胞造成热休克。此步骤至关重要，可防止细胞凋亡的诱导。</li>
	<li>配制流式细胞术缓冲液时，将2 mL FBS加入98 mL磷酸盐缓冲液（PBS）中，混匀后置于冰箱冷藏保存，建议在三天内使用完毕。</li>
</ol>
2. 从&#160;Nur77GFP 小鼠脾脏制备脾细胞悬液
<ol>
	<li>无菌条件下分离一只6-8周龄雌性Nur77GFP小鼠的脾脏。
	<ol>
		<li>操作时应在无菌操作台内进行。将已处死的小鼠体表毛发、剪刀和镊子浸入70%乙醇中消毒。</li>
		<li>将小鼠置于右侧卧位，在左上腹部区域切开皮肤和肌肉，观察切口部位以明确脾脏位置，随后将其切除。将取出的脾脏置于含冰上预冷的脾细胞培养基中，待下一步操作时使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将脾脏组织放入一个10 cm2的细胞培养培养皿中，加入5 mL预热的脾细胞培养基。</li>
	<li>用无菌注射器活塞充分研磨脾脏组织，直至液体变浑浊。操作结束时应残留脾脏胶原基质。</li>
	<li>在脾细胞培养基中充分研磨后，收集细胞悬液，并通过置于50 mL离心管上的70 µm细胞滤网过滤，以去除碎片或凝块。</li>
	<li>以500 × g离心5分钟。弃去上清液后，将细胞沉淀重悬于2-3 mL自制或商用的红细胞裂解缓冲液中。轻轻吹打混匀2-3次，静置20-30秒。</li>
	<li>加入5 mL PBS或所选合适缓冲液，再以500 × g离心5分钟。</li>
	<li>移除上清液（应呈红色，因含有裂解的红细胞），将细胞沉淀重悬于2 mL脾细胞培养基中。</li>
	<li>使用血细胞计数板，对经台盼蓝染色的细胞进行计数，以区分活细胞与死细胞（坏死细胞）。</li>
</ol>
3. 从脾细胞悬液中分离T细胞
<ol>
	<li>将细胞悬液在500 × g条件下离心5分钟。用无血清RPMI培养基（来自步骤1.3的50 mL）重悬细胞，使细胞浓度达到10 × 106 个细胞/mL。</li>
	<li>将细胞转移至一个5 mL聚苯乙烯管中，并保留100 µL脾细胞悬液，用于纯化步骤结束后的纯度评估/比较。</li>
	<li>向细胞悬液中加入正常大鼠血清，终浓度为50 µL/mL，随后加入T细胞分离抗体混合物（50 µL/mL）。</li>
	<li>混匀细胞悬液，静置10分钟。此步骤使抗体混合物与所有非目标细胞结合。</li>
	<li>加入链霉亲和素快速磁珠（磁性微珠）孵育2.5分钟，然后用无血清培养基将体积补至2.5 mL。</li>
	<li>将试管置于细胞分离磁铁中3分钟。</li>
	<li>保持磁铁吸附状态，一次性倾倒出上清液，将T细胞悬液转移至新的聚苯乙烯管中。 
	注：分离所得的悬液即为纯化的T细胞。所有非目标细胞均被磁性链霉亲和素微珠结合并吸附在管壁一侧。</li>
	<li>使用台盼蓝染色和血细胞计数板对分离得到的T细胞进行计数。 
	注：在此步骤中，可通过流式细胞术分析T细胞分离前后CD3+细胞所占比例，以验证分离T细胞的纯度（可选）13。
	<ol>
		<li>简要步骤：取1 mL脾细胞悬液，在500 × g条件下离心，弃去上清液，将细胞重悬于流式细胞术缓冲液中，调整浓度至1 × 106 个细胞/mL。</li>
		<li>加入荧光标记的抗小鼠CD3抗体（稀释比例为1:100），在4 °C孵育30分钟。洗涤一次，离心后重悬于流式细胞术缓冲液（400 µL）中，用于流式细胞术分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 从脾细胞悬液中分离B细胞
<ol>
	<li>采用B细胞分离试剂盒，遵循与T细胞相同的实验方案（步骤3.1-3.8），但在纯度检测时使用CD19抗体替代CD3抗体。13
	<ol>
		<li>进行纯度评估（可选）时，使用CD19抗体替代CD3抗体。取1 mL脾细胞悬液，以500 × g离心。弃去上清液，将细胞重悬于流式细胞术缓冲液中，调整细胞浓度至1 × 106 个细胞/mL。</li>
		<li>加入荧光标记的抗小鼠CD19抗体（稀释比例为1:100），在4 °C孵育30分钟。洗涤一次，离心后将细胞重悬于400 µL流式细胞术缓冲液中，用于流式细胞术分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. T细胞活化与GFP表达的诱导
<ol>
	<li>将T细胞悬液以2.5 × 10⁵个/mL的浓度接种至圆底96孔板中5 细胞/孔</li>
	<li>加入重组白细胞介素（IL）-7至终浓度为2 ng/mL，并加入CD3/CD28磁珠（25 µL/106 细胞）。保留一部分T细胞不使用磁珠处理，作为阴性对照，用于后续代表未激活T细胞的检测。</li>
	<li>12小时后，用移液器轻轻吹打96孔板中每个孔的细胞悬液，使磁珠-细胞复合物或细胞团块充分解离，收集所有孔中的悬液至一个5 mL聚苯乙烯管中。</li>
	<li>将含有悬浮液的试管放入之前用于T细胞或B细胞纯化的同一细胞分离磁铁中，静置5分钟。</li>
	<li>将T细胞悬液连同磁铁一同握住，一次性将溶液倒入新的聚苯乙烯管中。</li>
	<li>以 500 × g 离心 5 分钟。将细胞重悬于新鲜脾细胞培养基中，调整细胞浓度至 2 × 106 细胞/毫升</li>
	<li>通过流式细胞术检测刺激后12至24小时的GFP表达强度（可选，用于质量控制），并与未激活的T细胞进行比较。12 
	注意：GFP 荧光是 Nur77 固有的GFP T细胞在T细胞受体（TCR）成功激活后表现出该特性。12</li>
	<li>为通过显微镜评估细胞活力和活化状态（可选），在分析前30分钟以0.2 µg/ml的浓度加入Hoechst染色活化后的细胞。将适量细胞悬液加入盖玻片或平底黑色384孔板的孔中，在荧光显微镜下观察以评估活细胞。死细胞不会保留细胞核染色。14</li>
</ol>
6. B细胞活化与GFP表达的诱导
<ol>
	<li>使用 T-25 培养瓶，将分离的 B 细胞重悬于浓度为 1 × 106 个细胞/mL 的培养基中。</li>
	<li>加入抗小鼠 IgG/IgM (H+L) 抗体，终浓度为 10 µL/mL，同时加入重组 CD40L，终浓度为 200 ng/mL。保留一部分未处理的 B 细胞作为后续检测的阴性对照（代表未活化的 B 细胞）。</li>
	<li>在刺激后 12 或 24 小时，通过流式细胞术检测 GFP 表达强度，并与未活化的 B 细胞进行比较。 
	注意：GFP 荧光信号是 Nur77GFP B 细胞的内在特性，在 BCR 成功活化后显现。12</li>
	<li>如需通过显微镜评估细胞活力和活化状态（可选），在分析前 30 分钟用 Hoechst 染色活化细胞，Hoechst 工作浓度为 0.2 µg/mL。取适量细胞悬液加入盖玻片或平底黑色 384 孔板的孔中，在荧光显微镜下观察活细胞。死细胞无法保留细胞核染色。14</li>
</ol>
7. 小分子高通量筛选
<ol>
	<li>制备浓度为 2 x 10⁶ 个细胞/mL 的细胞悬液6 每毫升细胞数的活化T细胞或B细胞（磁珠或抗体/CD40L）或非活化组。</li>
	<li>在384孔板中每孔接种75,000个细胞（体积为40 µL）。使用平底黑色侧壁384孔板或显微镜盖玻片，通过荧光显微镜结合Hoechst染色对细胞活力和活化状态进行评估（可在高通量筛选前作为可选的质量控制步骤，具体参见步骤5.8和6.4）。14</li>
	<li>手动或使用自动化系统，将所选药物（溶于0.5% DMSO中）加入每孔。</li>
	<li>向阳性（激活）和阴性（非激活）对照孔中加入溶剂（DMSO）。将DMSO浓度调整至最高0.5%。</li>
	<li>将培养板在 37 ºC、5% CO₂ 条件下孵育 24 小时（或根据需要选择孵育时间）2.</li>
	<li>在筛选当天，将 Hoechst 33342 染色液稀释（1:3,333；用于 例如向384孔板中的细胞加入10 µL溶液，使总体积达到50 µL。在进行GFP分析前，加入Hoechst溶液至终浓度为0.2 µg/mL，染色30分钟。</li>
	<li>轻轻吹打细胞，使每孔中的细胞均匀分布。 
	注意：如果使用自动化系统加药（步骤 7.3），此步骤尤为重要，因为细胞容易在孔中流动方向相反的一侧聚集。</li>
	<li>在室温下以 45 × g 离心 3 分钟。</li>
	<li>将培养板在室温下静置15分钟。</li>
	<li>使用自动化共聚焦高内涵筛选（HCS）系统进行平板读数。15 将培养板放入仪器中。将物镜设置为40倍或更高放大倍数。Hoechst检测使用相机#4（紫外光源），GFP检测使用相机#1（488 nm激光）。设置仪器每孔读取6-10个视野。调整仪器，使每个视野依次在488 nm（用于检测GFP）和紫外光（用于检测Hoechst）下进行两次连续读数。将物镜设置为40倍或更高放大倍数。 
	注意：该系统为计算机化显微镜，无需任何手动调节。物镜工作距离、入射光强度及曝光时间均由仪器自动设定。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

已有多种检测方法被用于开发灵敏且可靠的高通量筛选（HTS）检测技术，包括比色法、发光法和荧光法。尽管比色法操作简便，但需要多次添加化学试剂，这些试剂可能干扰或破坏待测细胞。23 此外，该方法无法对生物学反应进行动态评估，因为药理学效应仅在特定终点进行测定。此外，若采用自动化高通量筛选，则该方法可能需要昂贵的机械臂设备。这些因素导致比色法检测因操作繁琐且灵敏度较低，难以满足高通量筛选的目标。23 尽管发光法已被提出作为比色法的替代方案，但这类发光检测在高通量筛选中的应用通常受限于需要裂解细胞。即使已开发出其他非裂解方案，生物发光信号的强度仍可能受到多种因素的阻碍，例如荧光素的吸收、辅因子的可利用性、pH值以及培养基或缓冲液的透明度，从而导致检测到的生物发光信号与细胞实际活性变化之间出现偏差。24 因此，大多数检测依赖于荧光方法。事实上，基于荧光的检测最初是利用一些小分子、高荧光性的有机化合物开发的，这些化合物可在细胞激活后监测多种细胞过程。总之，荧光检测具有更高的灵敏度，并且可轻松适用于高通量筛选...

高通量筛选（HTS）是一种已被证实的策略，广泛用于发现新的治疗分子或将美国食品药品监督管理局（FDA）批准的药物重新定位至新的医学适应症。1 到目前为止，HTS 的成功可通过大量已发现的药物得以衡量。例如，用于治疗乳腺癌的酪氨酸激酶抑制剂拉帕替尼（lapatinib）、作为降血糖药物使用的二肽基肽酶-4（DPP-4）抑制剂西格列汀（sitagliptin），以及用于治疗慢性髓性白血病的口服 Bcr-Abl 酪氨酸激酶抑制剂达沙替尼（dasatinib），均为最初通过 HTS 发现的众多获批药物中的几个实例。2 尽管近年来制药行业在新化学实体的发现方面遭遇瓶颈，但通过增加具有调节性生物学/生物化学特性的临床前候选化合物数量，可提高药物发现的成功概率。因此，开发适用于表型筛选的新型 HTS 检测方法，有望为发现新的药物候选分子提供重要的药理学工具。3,4,5,6 此外，由于近年来在技术上的重大变革，包括定制设计的灵活机器人系统、新型检测技术以及广泛的微型化，HTS 现在能够以更快的速度进行。2,7 表型筛选（又称正向药理学）日益受到关注的原因之一，在于人们认为：相较于对分子靶点（基于靶点的筛选/生化反应）所作的过度简化的还原论假设，关注功能性效应更有可能展现出临床疗效。因此，表型筛选有望揭示目前无法治疗疾病的新的潜在治疗化合物及分子通路。2
为了准确识别特定分子靶点或细胞功能的抑制剂或激活剂，需要一种高灵敏度且可靠的检测方法，以区分 真正有效的 命中与假阳性。那么，什么样的检测才算优质？特定检测的质量首先必须通过信噪比（通过Z因子反映）来判断。8 其次，应明确筛选的目标效应或目的。例如，与专门用于评估配体-受体结合的检测方法相比，基于细胞的功能性方法在受体筛选中可能具有显著优势。原因是后者无法区分激动剂与拮抗剂配体。9 相比之下，基于细胞的方法可能更为有效，因为可以在生物学表型（增殖、细胞周期阻滞、凋亡和/或分化）中直接评估受体功能。然而需要注意的是，生化检测相较于表型检测具有显著优势，因其可作用于特定的细胞内靶点。经过良好优化的生化检测通常比表型筛选具有更小的数据离散度，并有助于简化后续与药物分子作用机制相关的研究。然而，基于靶点或生化检测的主要缺点在于，当在生物系统中进行测试时，可能会增加假阳性结果的出现频率，这些假阳性可能影响非特异性靶点（即在生化检测中原本研究的特异性丧失）。10 尽管设定明确的阴性与阳性结果分界阈值可最大限度减少初筛中的假阳性数量，但采用能够模拟天然细胞环境（如完整细胞、完整组织或整体动物）的生理相关体系，仍是实验设计的核心。因此，表型筛选能够在不预先了解化合物活性或作用机制的情况下，针对尚无明确药物靶点的疾病，发现具有理想生物学效应或表型效应的先导化合物。11
本研究旨在开发并测试一种基于两个关键组分的优化且可重复的表型筛选方法：一种 commercially available 小鼠模型和一类聚集的化合物亚家族。关于动物模型，该检测依赖于从小鼠品系（Nur77GFP）中分离的淋巴细胞，该品系携带含细菌人工染色体的表达盒，其中绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的表达由 Nur77 启动子驱动。12 该刺激的关键特征在于，Nur77 是一个即刻早期基因，在 T 细胞受体（TCR）或 B 细胞受体（BCR）受到刺激后会迅速上调。12 至于筛选方法本身，采用了一种策略，旨在避免对简单类似物进行筛选，同时最大限度地缩短评估大型化合物库（&#62;105 种化合物）所需的时间。为此，研究人员利用药物化学家通过虚拟筛选工具选定的化合物数据库，以已知活性种子结构为参考，识别拓扑结构相似的化合物。该策略使我们能够对 4,398 种化合物进行筛选，这些化合物代表了总数超过 136,000 种化学实体的完整化合物库。

<table><tbody><tr><td>Nur77&lt;sup&gt;GFP&lt;/sup&gt; 小鼠</td><td>杰克逊实验室</td><td>小鼠品系编号 016617</td><td>本单位动物设施内自建繁殖种群&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>96 孔 U 型培养板，无菌</td><td>VWR International</td><td>10062-902</td><td>使用磁珠活化 T 细胞</td></tr><tr><td>70 &amp;micro;m 细胞筛，无菌</td><td>康宁公司</td><td>352350</td><td>制备脾细胞悬液</td></tr><tr><td>5 ml 聚苯乙烯圆底试管，无菌</td><td>康宁公司</td><td>352058</td><td>制备脾细胞悬液</td></tr><tr><td>50 ml 聚丙烯锥底离心管，无菌</td><td>VWR International</td><td>89039-656&amp;nbsp;</td><td>制备脾细胞悬液</td></tr><tr><td>10 ml 无针头注射器，无菌</td><td>贝克顿·迪金森公司</td><td>305482</td><td>研磨脾脏</td></tr><tr><td>T-25 培养瓶</td><td>Greiner Bio-One</td><td>690 175</td><td>用于 B 细胞活化期间的培养</td></tr><tr><td>5 ml 细胞培养皿，无菌</td><td>Greiner Bio-One</td><td>627 160</td><td>研磨脾脏</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（10,000 U/mL）</td><td>WISENT 公司</td><td>450-200-EL&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>脾细胞培养基组分</td></tr><tr><td>RPMI 1600 含碳酸氢钠和 L-谷氨酰胺</td><td>WISENT 公司</td><td>350-002-CL&amp;nbsp;</td><td>脾细胞培养基组分</td></tr><tr><td>MEM 非必需氨基酸</td><td>WISENT 公司</td><td>321-010-EL&amp;nbsp;</td><td>脾细胞培养基组分</td></tr><tr><td>HEPES 游离酸 1 M</td><td>WISENT 公司</td><td>330-050-EL&amp;nbsp;</td><td>脾细胞培养基组分</td></tr><tr><td>丙酮酸钠溶液（100 mM）</td><td>WISENT 公司</td><td>600-110-EL&amp;nbsp;</td><td>脾细胞培养基组分</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）&amp;nbsp;</td><td>WISENT 公司</td><td>080-910&amp;nbsp;</td><td>脾细胞培养基和流式细胞术缓冲液组分</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>WISENT 公司</td><td>311-010-CL</td><td>流式细胞术缓冲液组分</td></tr><tr><td>2-巯基乙醇（55 mM）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>21985-023</td><td>脾细胞培养基组分</td></tr><tr><td>T 细胞分离试剂盒</td><td>Stemcell Technologies</td><td>19851</td><td>用于分离 T 细胞</td></tr><tr><td>B 细胞分离试剂盒</td><td>Stemcell Technologies</td><td>19854</td><td>用于分离 B 细胞</td></tr><tr><td>小鼠 T 细胞激活剂 CD3/CD28 超顺磁性磁珠</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>11452D</td><td>用于活化 T 细胞&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>细胞分离磁铁</td><td>Stemcell Technologies</td><td>18000</td><td>用于分离 T 细胞并去除磁珠&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>AffiniPure F(ab')&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 片段 山羊抗小鼠 IgG + IgM (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch 实验室有限公司</td><td>115-006-068</td><td>用于刺激 B 细胞</td></tr><tr><td>重组小鼠 IL-7</td><td>Peprotech</td><td>217-17&amp;nbsp;</td><td>支持 T 细胞在活化期间的存活</td></tr><tr><td>重组 CD40L</td><td>R&amp;D Systems</td><td>8230-CL/CF</td><td>用于刺激 B 细胞</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD3 抗体</td><td>BD Pharmingen</td><td>561799</td><td>用于流式细胞术中 T 细胞染色</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD19 抗体</td><td>BD Pharmingen</td><td>553786</td><td>用于流式细胞术中 B 细胞染色</td></tr><tr><td>Biomek FX&lt;sup&gt;p&lt;/sup&gt;</td><td>PerkinElmer 公司</td><td>A31842</td><td>用于 24 小时孵育后重悬细胞</td></tr><tr><td>Opera Phenix 高内涵筛选系统</td><td>PerkinElmer 公司</td><td>HH14000000</td><td>用于分析 GFP/Hoechst 信号</td></tr></tbody></table>

一种基于荧光的淋巴细胞检测方法，适用于小分子高通量筛选

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

高通量筛选（HTS）目前是鉴定能够调节生化反应或细胞过程的化学实体的主要手段。随着生物技术的进步以及小分子在转化医学中的巨大潜力，药物发现领域已发展出多种创新方法，这也解释了近年来对HTS应用兴趣的重新兴起。在药物筛选研究中，肿瘤学领域目前最为活跃，但在识别靶向移植相关并发症或自身免疫性疾病的新型免疫调节化合物方面，尚未取得重大突破。本文介绍了一种新颖的 体外 基于荧光的鼠源性淋巴细胞检测法，可轻松适用于新型免疫调节化合物的鉴定。该检测方法采用转基因小鼠来源的T细胞或B细胞，其中Nur77启动子在T细胞或B细胞受体受到刺激后驱动GFP表达。由于GFP强度反映了靶细胞的激活状态/转录活性，本检测方法提供了一种研究特定化合物对细胞/生物学反应影响的新工具。例如，曾开展一项初筛实验，在未添加特异性刺激物的情况下，对4,398种化合物进行了检测。 &#34;目标假设&#34;，从而鉴定出160种具有免疫调节活性的潜在候选化合物。因此，该检测方法适用于在进一步研究之前，针对大型化合物库开展药物发现项目。 体外/体内 验证性研究。

高通量筛选实验的设计
在设计本荧光检测方法时，考虑了两个重要因素。首先，我们需要模拟一种生理条件，在该条件下，T细胞或B细胞的活化代表一种疾病状态（例如 移植物抗宿主病）。其次，细胞活化程度的评估应采用灵敏且定量的方法。目前，荧光检测是高通量筛选读数的主要选择之一，因其符合上述需求。10,16 由于在 Nur77 激活后可获得稳定的 GFP 信号读数GFP来源的T细胞或B细胞刺激均 体外 或 体内,12 我们的检测利用该策略区分非活化与活化细胞，作为筛选免疫调节化合物的工作模型。
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本研究介绍了一种基于荧光的新方法，该方法使用来自转基因小鼠的淋巴细胞。该方法适用于对具有抑制或促进淋巴细胞活化能力的小分子进行高通量筛选（HTS）。

高通量筛选（HTS）目前是鉴定能够调节生化反应或……的化学物质的主要方法。

本基于荧光的淋巴细胞检测方法的总体目标是鉴定新的小分子免疫调节剂。该方法有助于回答免疫学领域中关于淋巴细胞活化与抑制机制的关键问题。该表型功能检测的主要优势在于可适用于药物发现。演示该实验操作的是本实验室的研究生 Ahmed Fouda。在无菌操作台内，用 70% 乙醇对一只 6 至 8 周龄的雌性 Nurr77 GFP 小鼠的皮毛进行消毒，并将动物置于右侧卧位。接着，在左上腹部区域的皮肤和肌肉上做一切口，找到脾脏并将其取出，立即将组织置于冰上的脾细胞培养基中。当所有脾脏采集完毕后，将组织转移至一个含有5毫升预温脾细胞培养基的10厘米²细胞培养皿中，使用无菌注射器活塞将组织研磨至溶液浑浊。在脾细胞培养基中充分研磨后，将细胞悬液通过70微米细胞滤网过滤至一个50毫升离心管中，以去除碎片，然后离心获得单细胞悬液。将沉淀重悬于2至3毫升红细胞裂解缓冲液中，20至30秒后加入5毫升RPMI或其他合适的缓冲液终止反应。然后通过另一次离心收集细胞，并将沉淀重悬于 2 毫升脾细胞培养基中用于细胞计数。为分离 T 细胞，再次离心细胞，并将沉淀重悬于无血清 RPMI 培养基中，细胞浓度为每毫升 1 × 10⁷ 个细胞。将细胞转移至 5 毫升聚苯乙烯管中，并预留 100 微升脾细胞 aliquot，用于后续纯度评估。接着，向细胞中加入每毫升50微升的正常大鼠血清，再加入每毫升50微升的T细胞分离抗体混合液，轻轻混匀。10分钟后，将细胞与链霉亲和素偶联的磁珠孵育2.5分钟。然后向细胞中加入无血清培养基，使终体积达到2.5毫升，并将试管放入细胞分离磁铁中静置3分钟。孵育结束后，将试管置于磁铁上，一次性将上清液倒入新的聚苯乙烯试管中。随后可对T细胞进行计数。将T细胞以每孔2.5 × 10⁵个细胞的浓度接种至圆底96孔板中，每孔含有200 μL新鲜脾细胞培养基。向相应的孔中加入重组白细胞介素-7以及CD3/CD28磁珠，并将培养板放入细胞培养箱中。12小时后，轻轻吹打每孔中的细胞悬液，以分散任何磁珠-细胞聚集体。随后将每孔中的细胞悬液分别转移至单独的5 mL聚苯乙烯管中。当所有细胞收集完毕后，将每管细胞依次放入分离磁铁中静置五分钟，在磁铁中将上清液小心倾入新的聚苯乙烯管中，此操作在每次孵育结束时进行。随后通过离心收集细胞，并将沉淀重悬于新鲜的脾细胞培养基中，调整细胞浓度至每毫升含 2 × 10⁶ 个细胞。对于小分子高通量筛选，将 40 µL 细胞悬液加入 384 孔板的每个孔中，随后在细胞培养孵箱中，根据实验设计对相应孔加入选定的药物或对照溶剂，进行指定时间的处理。在进行 GFP 分析前 30 分钟，用适当浓度的 Hoechst 溶液对细胞进行染色，并通过轻柔的移液操作使染料充分分散。所有孔均染色后，离心培养板以使细胞聚集于孔底，并在室温下静置 15 分钟。按照制造商的说明加载培养板。

a-fluorescence-based-lymphocyte-assay-suitable-for-high-throughput

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