一种基于荧光的淋巴细胞检测方法，适用于小分子高通量筛选

本基于荧光的淋巴细胞检测方法的总体目标是鉴定新的小分子免疫调节剂。该方法有助于回答免疫学领域中关于淋巴细胞活化与抑制机制的关键问题。该表型功能检测的主要优势在于可适用于药物发现。

演示该实验操作的是本实验室的研究生 Ahmed Fouda。在无菌操作台内，用 70% 乙醇对一只 6 至 8 周龄的雌性 Nurr77 GFP 小鼠的皮毛进行消毒，并将动物置于右侧卧位。接着，在左上腹部区域的皮肤和肌肉上做一切口，找到脾脏并将其取出，立即将组织置于冰上的脾细胞培养基中。

当所有脾脏采集完毕后，将组织转移至一个含有5毫升预温脾细胞培养基的10厘米²细胞培养皿中，使用无菌注射器活塞将组织研磨至溶液浑浊。在脾细胞培养基中充分研磨后，将细胞悬液通过70微米细胞滤网过滤至一个50毫升离心管中，以去除碎片，然后离心获得单细胞悬液。将沉淀重悬于2至3毫升红细胞裂解缓冲液中，20至30秒后加入5毫升RPMI或其他合适的缓冲液终止反应。

然后通过另一次离心收集细胞，并将沉淀重悬于 2 毫升脾细胞培养基中用于细胞计数。为分离 T 细胞，再次离心细胞，并将沉淀重悬于无血清 RPMI 培养基中，细胞浓度为每毫升 1 × 10⁷ 个细胞。将细胞转移至 5 毫升聚苯乙烯管中，并预留 100 微升脾细胞 aliquot，用于后续纯度评估。

接着，向细胞中加入每毫升50微升的正常大鼠血清，再加入每毫升50微升的T细胞分离抗体混合液，轻轻混匀。10分钟后，将细胞与链霉亲和素偶联的磁珠孵育2.5分钟。然后向细胞中加入无血清培养基，使终体积达到2.5毫升，并将试管放入细胞分离磁铁中静置3分钟。

孵育结束后，将试管置于磁铁上，一次性将上清液倒入新的聚苯乙烯试管中。随后可对T细胞进行计数。将T细胞以每孔2.5 × 10⁵个细胞的浓度接种至圆底96孔板中，每孔含有200 μL新鲜脾细胞培养基。

向相应的孔中加入重组白细胞介素-7以及CD3/CD28磁珠，并将培养板放入细胞培养箱中。12小时后，轻轻吹打每孔中的细胞悬液，以分散任何磁珠-细胞聚集体。随后将每孔中的细胞悬液分别转移至单独的5 mL聚苯乙烯管中。

当所有细胞收集完毕后，将每管细胞依次放入分离磁铁中静置五分钟，在磁铁中将上清液小心倾入新的聚苯乙烯管中，此操作在每次孵育结束时进行。随后通过离心收集细胞，并将沉淀重悬于新鲜的脾细胞培养基中，调整细胞浓度至每毫升含 2 × 10⁶ 个细胞。对于小分子高通量筛选，将 40 µL 细胞悬液加入 384 孔板的每个孔中，随后在细胞培养孵箱中，根据实验设计对相应孔加入选定的药物或对照溶剂，进行指定时间的处理。

在进行 GFP 分析前 30 分钟，用适当浓度的 Hoechst 溶液对细胞进行染色，并通过轻柔的移液操作使染料充分分散。所有孔均染色后，离心培养板以使细胞聚集于孔底，并在室温下静置 15 分钟。按照制造商的说明加载培养板。

然后，将物镜倍数设为40倍或更高。将相机四设置用于紫外灯，相机一设置用于488激光。将培养板加载至高内涵筛选系统。

接下来，将自动共聚焦高内涵筛选系统设置为每孔读取6到10个视野，每个视野在488纳米和紫外光下进行两次连续读数。CD3阳性T细胞约占小鼠脾脏细胞的30%，基础GFP表达率为10%。经CD3/CD28 T细胞受体磁珠刺激后，GFP表达阳性细胞比例增加5至6倍。

同样，CD19阳性B细胞占脾细胞总数的50%至55%，其基础GFP表达水平与未活化的T细胞相似。有趣的是，使用抗小鼠IgG、IgM以及重组CD40L刺激B细胞受体，仅引起GFP表达的轻微增加。如上所述经磁珠分离后，分离得到的CD3阳性T细胞仍表现出10%的基础GFP表达水平。

然而，CD3/CD28 磁珠刺激可显著上调 GFP 反应。类似地，在 B 细胞磁珠分离后，纯化的活化 B 细胞相较于脾细胞中的活化 B 细胞表现出更高的 GFP 表达水平。在此代表性实验中，对 4398 种化合物进行的初筛高通量筛选发现了多个 T 细胞活化的激活剂和抑制剂。

但经刺激的T细胞中观察到的GFP表达水平，比未刺激的T细胞高出20倍，从而能够建立一个作用窗口区，在此区域内可轻松检测到GFP抑制性化合物。若操作得当，掌握该技术后可在36至48小时内完成实验。

进行此操作步骤时，重要的是要记住在每一步之后对细胞进行计数。完成本操作后，可进一步采用 ELISA 或蛋白质印迹等其他方法，以回答其他相关问题。该技术将为啮齿类动物中的药物发现与免疫调节研究奠定基础。

观看本视频后，您应能够充分理解如何分离并激活来源于 Nurr77 GFP 小鼠培养板的 T 细胞或 B 细胞。