局部场荧光显微技术：在完整心脏中成像细胞信号

本局部场荧光显微成像技术的总体目标是利用分子探针检测在完整心脏水平难以触及的心脏区域中的细胞内钙离子水平或膜电位。该方法有助于解答与心脏骤停和缺血相关的关键心血管科学问题。该技术的主要优势在于，可在保持细胞电学、力学及代谢耦合状态的完整器官内，直接从细胞事件中测量心脏的生理特性。

首先，准备好水平式兰格多夫装置。将新配制的台罗德溶液装入60毫升注射器中，并连接装置的所有相关管路。装液后，排除所有气泡。

然后，用来自浸没式塑料曝气石的纯氧气对已加载的溶液进行平衡。接着，将不可吸收的外科缝线绕在针头周围，当其连接到装置上时，可作为灌注导管用于逆向灌注心脏。

接下来，在注射肝素并处死动物后，采集心脏。首先用乙醇清洁胸部。本演示以小鼠为例，但相同的操作步骤也适用于鹦鹉心脏的采集。

接下来，使用解剖剪在下腹部做一切口，然后沿两侧向上剪至颈部。随后，小心剪开膈肌，注意避开心脏。现在，将切开的组织向后拉开并用针固定。

接下来，去除肺脏及周围组织以暴露心脏。暴露后，使用镊子将心脏取出，注意不要挤压。通过剪断主动脉将心脏从动物体内分离，并尽可能保留较长的主动脉段与心脏相连。

然后，将心脏放入含有1毫升台氏液的小型称量皿中。在解剖显微镜下，使用镊子和剪刀迅速去除心脏周围的血液和脂肪组织。使用不可吸收的外科缝线和针，将主动脉连接至兰格多夫装置的水平接口。

使用两把精细镊子固定结。然后，打开阀门释放Tyrode溶液，开始逆行灌注。清理周围组织并吸除碎片，以保持灌流室水平清洁，同时使心脏稳定10分钟。

新鲜配制染料。对于 Rhod-2 AM，将 20 微升 20% Pluronic 和 DMSO 加入厂家提供的 50 微克染料中。用移液器吹打混匀，避免产生气泡。

然后，将液化的染料转移至一个透明玻璃小瓶中，并加入一毫升台氏液。通过15到20分钟的超声处理，充分溶解染料以形成均匀混合物。接着，使用蠕动泵在室温下灌注该配制好的染料。

首先，将染料加入染料室中，然后夹紧所有连接到多通管的管路，并将夹子置于多通管上方，以防止倒流。接着，打开泵，并立即关闭60毫升注射器下方的三通阀。将连接在泵吸液端的小管置于心脏附近，以便在染料灌注后进行循环回收。

取一根细针，从心尖处刺入以释放压力。然后让心脏灌注染料30分钟。在此期间，必须密切观察染料液面高度，避免气泡进入组织，否则会导致缺血和组织损伤。

灌注染料后，用Tyrode溶液逆行灌注心脏。移除多通管上方的夹子，打开阀门，然后让心脏稳定10分钟。

逆行灌注期间，用台氏液填充水平槽，并打开帕尔帖装置，使浴液温度升至 37 摄氏度。为实验准备光纤光源时，首先将光纤放入一支 2 毫升移液器中，然后将移液器固定在显微操作器上。

使用显微操作器将光纤轻轻压向侧脑室表面。接着，设置波形发生器以输出宽度为1毫秒的方波脉冲。并将心脏刺激器设定为外部同步模式，并连接至波形发生器。

在两个刺激器输出端的每一个上，连接一根末端焊接有针灸针的导线。将两根针灸针连接到心脏心尖部位，相距约三毫米。只有在针灸针放置到位后，才启动刺激器，以避免意外电击。

现在，为了记录心外膜信号，将软件中的采样频率调整为 10 千赫兹。为了采集心内膜信号，请遵循相同的步骤，但使用 23 号针头在靠近室间隔的侧心室处刺一个小孔。然后，利用显微操作器将第二根光纤置于心内膜中。

为了评估透壁功能，比较了从心内膜和心外膜记录的动作电位形态。采用CLFFM技术，在用di-8-ANEPPS处理心脏后进行荧光记录。心内膜的动作电位时程较长，尤其在1相更为明显。

动作电位的持续时间被定义为动作电位复极化至某一程度所需的时间。当将各个持续时间进行归一化并沿零相位对齐以实现重叠后，便可进行比较。在第一相期间确实存在显著差异。

接下来，使用 Rhod-2 AM 监测细胞内钙离子水平。为了比较细胞内钙离子的区域差异，评估了钙瞬变的动力学特征。相比之下，心内膜的钙瞬变达峰时间比其他区域长约两毫秒。

总体而言，心内膜的钙瞬变动力学显著慢于心外膜。掌握该技术后，可用于记录心脏中难以触及区域的细胞内钙瞬变和动作电位。装置中的兰格多夫（Langendorff）部分使得向心脏灌注不同化学物质并评估其对心脏特性的影响变得非常便捷。