斑马鱼中高血糖的急性和慢性模型：评估高血糖对神经发生及放射性标记分子生物分布影响的方法

以下实验方案的总体目标是评估高血糖条件下大脑的重塑情况，并追踪斑马鱼体内放射性标记的分子。高血糖的特征是血液中葡萄糖浓度过高。慢性高血糖可能由糖尿病引起，并导致多种血管功能障碍，进而引发心肌梗死、脑卒中或糖尿病足溃疡等临床并发症。

此外，应激引起的急性高血糖可能促进缺血性卒中的出血性并发症。斑马鱼是研究人类疾病及其对中枢神经系统影响的有趣模型。尤其值得注意的是，成年斑马鱼大脑具有强烈的神经发生能力和卓越的脑修复机制，相较于哺乳动物更为显著，因此斑马鱼是研究急性应激和高血糖条件下脑重塑的良好模型。

它还允许研究放射性标记分子以及潜在治疗剂的生物分布。所有实验均按照法国和欧洲共同体关于动物研究使用的指南进行，并经当地动物实验伦理委员会批准。用渔网轻柔地捕获一条鱼。

将鱼放入少量三卡因麻醉剂中，麻醉剂在水中稀释至终浓度为0.02%。待鱼停止活动后，用剪口的移液管小心取出，并轻轻置于吸水纸上，尽量去除水分。

称量鱼的体重，以准备注射用的 D-葡萄糖溶液，剂量为每公斤体重 50 微升，浓度为 2.5 克/升。例如，一条 0.6 克重的鱼将接受 50 微升的 3% D-葡萄糖 PBS 溶液。将鱼置于背侧卧位，并用一只手固定。

用另一只手将注射器针头插入腹腔，缓慢注入D-葡萄糖PBS溶液。拔出针头，将鱼放回鱼用培养水中。观察鱼直至其完全恢复。

通常在1.5小时后测量其血糖水平。为了模拟慢性高血糖状态，准备一个2升的D-葡萄糖溶液，终浓度为111毫摩尔。具体操作为：称取40克D-葡萄糖，放入一个空的容器中。

向水箱中加入两升鱼用水，并放入最多七条鱼。每两天更换一次葡萄糖溶液，以避免细菌或其他微生物的生长。通过持续14天的D-葡萄糖处理，可建立慢性高血糖模型。

用渔网捕获一条鱼，并将其置于冰上。用冰覆盖鱼体，以实现快速安乐死。取鱼并擦拭鱼体，以去除可能稀释血液样本的水滴。

用解剖镊取下眼球，等待眼窝充满血液。将血糖试纸插入血糖仪，再将试纸插入眼窝中。记录血糖浓度数值。

对于急性高血糖，腹腔注射 d-葡萄糖可导致血糖水平显著升高，如注射后1个半小时所示。对于慢性高血糖，将鱼浸入 d-葡萄糖溶液中可导致血糖水平显著升高，如处理14天后所示。操作结束后，用解剖剪将身体与头部分离，并将头部置于用PBS稀释的4%多聚甲醛中，用于免疫组织化学实验。

4°C下孵育过夜。或者，也可直接取出脑组织并冷冻，用于其他实验，例如mRNA提取。次日，用PBS冲洗固定后的头部样本，并在解剖显微镜下用针固定维持。

取下另一只眼睛，用镊子轻轻打开颅骨顶部。然后小心取出脑组织，置于1x PBS中。固定的脑组织经一系列浓度递增的乙醇逐步脱水，随后浸入甲苯中两次，每次30分钟。

将脑组织放入包埋盒中，并小心盖上盖子。将包埋盒置于58至60摄氏度的熔融石蜡中。在脑组织石蜡包埋过程中，打开温控镊子加热装置。

将包埋盒放入干净的石蜡浴中。石蜡浸渍结束后，取出包埋盒。向模具中倒入一些液态石蜡。

打开包埋盒，将脑组织放入模具内的熔融石蜡中。使用预热的包埋钳调整脑组织的方向。用熔融石蜡注满模具，并将其置于包埋机的冷却部位使其凝固。

出于技术原因，应根据前-后轴方向定位脑组织。脱模石蜡块后，对其进行修整，并用熔化的石蜡将其固定在组织盒上，确保方向正确，以便进行横切。将石蜡块放入切片机的臂架中，切取 50 µm 厚的切片，直至达到脑组织样本层面。

然后，修整石蜡包埋块以获得梯形，将切片厚度调整为七微米。用细毛笔收集石蜡带，并置于黑纸上。每隔三到四张切片，将石蜡带剪断一次。

将载玻片置于加热板上，加入蒸馏水覆盖。轻轻将切片放置于载玻片的水面上，并加热至40摄氏度。当石蜡带充分展开后，用吸水纸吸去水分。

如图所示，机械去除最后的液滴。在进行本方案中所述的免疫组织化学操作前，让载玻片至少干燥两个小时。免疫组织化学染色完成后，使用落射荧光显微镜或共聚焦显微镜观察载玻片，以研究高血糖对脑细胞增殖的影响。

脑细胞定量分析至少在连续三个切片或一个特定感兴趣区域上进行。此处，代表增殖细胞的 PCNA 阳性细胞呈绿色显示。如图所示，慢性高血糖导致侧脑室和后脑室周围腹侧端脑、背侧端脑以及尾部下丘脑区域中被 PCNA 抗体标记为绿色的增殖细胞数量减少。

或者，为了研究高血糖对损伤诱导神经发生的影响，可在慢性高血糖处理期间对端脑进行刺伤损伤操作。具体操作为：对经过七天处理的斑马鱼进行麻醉，并将其置于解剖显微镜下。将一支30号针头垂直穿过颅骨，插入右侧端脑半球的中心位置。

完成此操作后，应将鱼放回其水族箱中，饲养至所需时间。在此实验中，鱼在含 d-葡萄糖的水中存活七天后被处死。端脑刺伤损伤在损伤后七天会显著上调损伤半球的细胞增殖。

我们的数据显示，慢性高血糖通过降低端脑刺伤损伤后细胞增殖，显著抑制脑部修复过程。斑马鱼也可用于研究放射性标记分子在体内的生物分布。在此，我们决定研究斑马鱼个体中的葡萄糖代谢。

应先将鱼麻醉，并置于用麻醉剂浸湿的组织上。然后将鱼放置在放射防护窗后方。准备含有50 µL氟代脱氧葡萄糖的注射器。

将鱼置于背部位置，通过腹腔注射50微升浓度为20兆贝可勒的FDG。随后将鱼放置在另一块浸有麻醉剂的组织上，轻轻包裹后，置于PET扫描仪的成像臂上。

将鱼臂插入PET扫描仪中，并进行成像操作。在此处可以观察到，FDG不仅在注射部位被检测到，还在鱼头部明显可见，尤其是在大脑中，以及沿着整个脊髓分布。在本研究中，我们提供了两种不同的方法用于建立斑马鱼的急性与慢性高血糖模型，并证明了高血糖在正常状态及损伤诱导条件下均会损害脑细胞的增殖能力。

综上所述，斑马鱼可作为研究高血糖对中枢神经系统有害影响的相关模型，同时也可通过PET扫描评估放射性标记分子的生物分布。