Name: 斑马鱼高血糖的急性和慢性模型:评估高血糖对神经发生的影响和放射性标记的分子的生物分布的方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-26T12:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 35 s
Description: 了解斑马鱼急性和慢性高血糖模型的建立方法，评估高血糖对神经发生的影响，并利用PET/CT成像技术追踪放射性标记分子的生物分布。该方法为研究糖尿病中枢神经系统并发症提供了重要的实验工具。

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我们非常感谢留尼汪大学数字应用司（DUN）对视频的编辑工作（特别是 Jean-François Février、Eric Esnault 和 Sylvain Ducasse），感谢 Lynda-Rose Mottagan 提供配音，Mary Osborne-Pellegrin 对配音进行校对，以及感谢 CYROI 平台的支持。本研究得到了留尼汪大学（研究质量奖金、激励机制项目）、留尼汪大区议会、欧洲联盟（CPER/FEDER）以及 Philancia 协会资助项目的资助。ACD 获得了法国国民教育、高等教育与研究部和留尼汪大学（博士合同）提供的博士后奖学金资助。

野生型成年斑马鱼（Danio rerio）在标准光照周期（14/10 小时明/暗）和温度（28 °C）条件下饲养。所有实验均遵循法国及欧洲共同体关于实验动物使用指南（86/609/EEC 和 2010/63/EU），并经当地实验动物伦理委员会批准。
1. 建立斑马鱼急性高血糖模型
<ol>
	<li>通过将400 mg三卡因（MS-222）粉末溶解于97.9 mL水中和2.1 mL 1 M Tris/HCl缓冲液（pH 9）中，配制三卡因储备液。调节pH至7，分装后于-20 °C保存。</li>
	<li>取5 mL三卡因储备液加入100 mL鱼用水中，配制成成年斑马鱼麻醉液（终浓度：0.02%三卡因）。</li>
	<li>将一条斑马鱼（3至6月龄）从养殖缸转移至麻醉液中，直至其停止活动。</li>
	<li>使用剪口的移液器取出鱼体，并用吸水纸迅速擦干。</li>
	<li>称量鱼体重量。</li>
	<li>准备一支含有D-葡萄糖溶于1×PBS中的注射器，按2.5 g/kg体重剂量注射50 µL D-葡萄糖溶液。 
	注意：例如，一条0.6 g重的鱼将接受50 µL 3% D-葡萄糖/PBS溶液。</li>
	<li>将鱼体翻转至背部朝上，将注射器针头插入腹腔内。</li>
	<li>缓慢注入D-葡萄糖/PBS溶液，随后将鱼放回水中。</li>
	<li>观察鱼体直至其完全恢复，然后将其放回养殖缸，直至达到进行血糖测定所需的时间。 
	注意：注射后1.5小时测定血糖水平。</li>
</ol>
2. 建立斑马鱼慢性高血糖模型
<ol>
	<li>准备一个2升的清洁鱼用水水箱。</li>
	<li>将40 g D-葡萄糖溶解于2升鱼用水中，使D-葡萄糖终浓度为111 mM。</li>
	<li>将5至7条成年斑马鱼浸入含D-葡萄糖的水中。</li>
	<li>每2天更换一次含D-葡萄糖的鱼用水，以避免细菌或其他微生物的生长。</li>
	<li>经过14天处理后，在测量血糖水平前，将鱼短暂放入清水中，以去除体外残留的D-葡萄糖。</li>
</ol>
3. 斑马鱼血糖水平的测定
<ol>
	<li>用冰覆盖鱼类以实现快速安乐死。 
	注意：不要使用过量的三卡因（tricaine），因为它会引起血糖水平的显著波动。不要将鱼在冰中放置过久，否则会导致血液凝固。</li>
	<li>用吸水性纸巾擦拭鱼体，彻底去除水分，以避免在测量血糖时造成血液稀释。</li>
	<li>使用解剖镊摘除一只眼睛，并等待眼窝充满血液。</li>
	<li>将血糖试纸插入血糖仪中，然后将试纸插入眼窝内。</li>
	<li>测量血糖水平。</li>
</ol>
4. 高血糖后脑细胞增殖的分析
<ol>
	<li>溶液与缓冲液：要求与制备
	<ol>
		<li>通过将100 mL 10x PBS加入900 mL蒸馏H₂O中，配制1 L的1x PBS2O (dH2O）并混匀。</li>
		<li>用0.2%去垢剂配制1× PBS缓冲液（PBS-T；参见材料表）。 
		注意：配制 1 L PBS-T 时，加入 2 mL 去垢剂（参见 材料表) 加至 1 L PBS 中。</li>
		<li>配制乙醇梯度溶液（100% × 2、95%、85%、70%、50% 和 30%）以及 0.85% NaCl 溶液。</li>
		<li>制备封闭缓冲液：含0.5%至1%脱脂奶粉的PBST缓冲液。 
		注意：配制 200 mL 封闭缓冲液，需将 2 g 脱脂奶粉加入 200 mL PBST 中。</li>
		<li>配制抗原修复缓冲液：柠檬酸钠。 
		注意：配制 1 L 柠檬酸钠缓冲液时，将 2.94 g 二水合柠檬酸三钠盐加入 1 L 去离子水中20. 定容至 1 L 前，调节 pH 至 6。</li>
		<li>配制4%多聚甲醛-PBS缓冲液，将4 g多聚甲醛加入100 mL 1×PBS中，在58–60 °C下加热并搅拌至完全溶解。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>免疫组织化学样品制备：固定与脱水
	<ol>
		<li>测量血糖水平后，从鳃后方切断，将头部与身体分离。 
		注意：或者，可直接取出脑组织并冷冻，用于其他实验，例如 mRNA 提取。</li>
		<li>在4%多聚甲醛（溶于PBS，PFA-PBS）中，4 °C下固定头部过夜。</li>
		<li>第二天，用 PBS 简短清洗头部。</li>
		<li>在显微镜下小心解剖脑组织。用 PBS 冲洗固定后的头部，并用针将头部固定在解剖显微镜下。用镊子去除眼睛和颅骨顶部。小心取出脑组织并置于 1× PBS 中。</li>
		<li>依次用1×PBS洗涤固定脑组织30分钟，0.85% NaCl洗涤30分钟，70% EtOH/0.85% NaCl（v/v）洗涤15分钟，70% EtOH洗涤15分钟（两次），85% EtOH洗涤20分钟，95% EtOH洗涤20分钟，100% EtOH洗涤20分钟（两次）。最后在100% EtOH溶液中过夜孵育。 
		注意：脱水后的脑组织可在4 °C条件下于100%乙醇中保存数月，再进行石蜡包埋。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>免疫组织化学样品制备：石蜡包埋组织的制备
	<ol>
		<li>将脑组织放入小玻璃烧杯中。 
		注意：请勿使用塑料容器，因为甲苯可能损坏某些塑料。</li>
		<li>除去乙醇，并用甲苯替代，以确保脑组织完全浸入甲苯中。用甲苯进行两次，每次30分钟的浸泡。</li>
		<li>除去甲苯，将脑组织放入包埋盒中。将封闭的包埋盒置于58–60 °C的熔融石蜡系列烧杯中（每个烧杯中30分钟）。打开包埋钳加热装置。完成石蜡浸透后，取出包埋盒，将少量液态石蜡倒入模具中。</li>
		<li>将融化的石蜡倒入模具中，并将脑组织放入其中。使用预热的包埋镊子，以脑组织的前后方向为参考，调整其位置。将模具置于包埋机的冷却部位，使石蜡凝固。</li>
		<li>出于技术原因，将脑组织沿前后轴摆放。脱模后修整石蜡块，并将其固定于包埋盒中，确保熔化的石蜡方向正确，以便进行横切面切片。</li>
		<li>将石蜡包埋块插入切片机的臂架中。先切去50 µm厚的切片，直至暴露出脑组织样本层面。修整石蜡块以形成梯形切面，并将切片厚度调整为7 µm。使用毛笔收集石蜡带，并将其置于黑色纸张上。每隔3至4个切片，轻轻切割一次。</li>
		<li>将载玻片置于加热板上，并用去离子水覆盖2哦，水。</li>
		<li>将切好的带状组织轻轻置于水面上。当石蜡带充分展开或铺平后，用吸水纸吸去水分。最后几滴水用机械方法去除。将载玻片上的水去除后，置于约30–40 °C的加热板上干燥至少3小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>免疫组织化学实验步骤
	<ol>
		<li>将切片依次放入三个盛有二甲苯的容器中，每个容器7分钟，以去除石蜡。</li>
		<li>将切片置于两个盛有100%乙醇的容器中，每容器中孵育2分钟，随后依次放入95%乙醇、85%乙醇、70%乙醇和30%乙醇中，各30秒。最后将切片短暂放入dH₂O中2O 和 PBS 中各洗涤两次，每次 5 分钟。</li>
		<li>将切片置于柠檬酸盐缓冲液中，在微波炉中孵育（500 W，2 分钟），直至缓冲液开始沸腾。室温下静置 15 分钟，使切片自然冷却。</li>
		<li>用 PBST 洗涤三次，每次 5 分钟，然后在含 1% 脱脂奶粉的 PBST 中封闭 45 分钟。加入一抗，4℃孵育过夜（例如&#160;增殖细胞核抗原（PCNA）用于增殖细胞染色；以封闭缓冲液按1/100稀释）即&#160;PBST，1% 脱脂牛奶</li>
		<li>用 PBST 洗涤三次，每次 5 分钟，然后将切片与适当的二抗在室温下孵育 90 分钟（例如&#160;山羊抗小鼠 Alexa Fluor 488（1:200）用封闭缓冲液稀释，并加入 DAPI（1:500）。</li>
		<li>用PBST洗涤三次，每次5分钟，然后用荧光封片剂（见材料表）封片。</li>
		<li>使用落射荧光显微镜和/或共聚焦显微镜分析染色结果。</li>
		<li>在至少三只不同动物的兴趣区域中，对至少连续三个脑切片进行脑细胞增殖的定量分析。 
		注意：或者，可按照先前所述方法，将脑组织包埋在琼脂糖中，随后进行振动切片和游离漂浮免疫组织化学。24.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>研究高血糖对脑修复机制的影响 
	注意：也可在端脑刺伤损伤后，按照先前所述方法，在急性与慢性高血糖条件下进行脑修复的研究。24,25,26简要地：
	<ol>
		<li>用三卡因麻醉成年斑马鱼。</li>
		<li>将鱼置于解剖显微镜下并打开光源。</li>
		<li>用一只手握住鱼。</li>
		<li>用另一只手将一支30 G注射器垂直插入颅骨，进入右侧端脑半球的内侧区域。</li>
		<li>将鱼放回新鲜的鱼用水、添加D-葡萄糖（111 mM）的水或对照鱼用水中。让鱼在损伤后存活7天。 
		注意：其余步骤请参见第4步。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 通过PET/CT成像斑马鱼中放射性标记分子的生物分布：氟脱氧葡萄糖（[18F]-FDG）用于分析葡萄糖代谢
<ol>
	<li>准备一个含有20 MBq [18F]-FDG生理盐水溶液的50 µL注射器。</li>
	<li>将注射器放置在辐射防护屏后。</li>
	<li>使用三卡因麻醉成年斑马鱼。</li>
	<li>将鱼放置在辐射防护屏后。</li>
	<li>将[18F]-FDG注射至腹腔内。用一小片纸巾擦拭注射部位，以防止检测到可能从鱼体腹部渗出的残留[18F]-FDG。</li>
	<li>使用放射性同位素活度计测量注射器及纸巾上剩余的放射性活度，以计算确切的注射剂量。</li>
	<li>将鱼置于一片新的、浸有三卡因的小型吸水纸上并轻轻包裹。将鱼连同吸水纸一起放置在PET/CT成像仪的载物床上。</li>
	<li>将载物床插入PET/CT成像系统，并启动数据采集。</li>
	<li>继续进行PET/CT数据采集。</li>
	<li>操作结束后，将鱼放回少量新鲜鱼水中。 
	注：或者，在注射[18F]-FDG后，可将鱼放回少量新鲜水中静置10分钟至1小时，以促进[18F]-FDG的扩散，之后再次麻醉鱼体以进行PET/CT成像。</li>
</ol>

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</ol>

未披露任何潜在的利益冲突。

本研究描述了在斑马鱼中建立高血糖急性和慢性模型的多种方法。这些方法的主要优势在于：（1）可减少研究中使用的哺乳动物数量；（2）操作简便且实施快速；（3）经济高效。因此，此类模型可用于在大量动物中研究高血糖对多种生理过程的影响，包括动脉粥样血栓形成、心血管功能障碍、视网膜病变、血脑屏障渗漏以及稳态和再生性神经发生。本文详细介绍了在正常或损伤诱导条件下，开展高血糖对脑细胞增殖影响研究的具体操作流程。
慢性高血糖处理的一个关键局限性在于，在某些实验中，部分斑马鱼在长期浸入D-葡萄糖水（111 mM，持续14天）后并未表现出高血糖。Dorsemans及其同事（2016年）此前估计，有反应和无反应的鱼类比例分别为83%和17%。这种差异可能与个体鱼的年龄、性别以及通过生成更多胰腺β细胞来代偿高血糖的能力不同所致的易感性差异有关34,35。对于急性高血糖模型，注射后1.5小时血糖水平较为均一，表明该方法具有良好的可重复性。
<p class="jove_content"...

高血糖是指血糖水平过高。尽管它可能反映一种急性应激状态，但高血糖也是一种常导致糖尿病诊断的状况，糖尿病是一种胰岛素分泌和/或作用抵抗的慢性疾病。2016年，全球患有糖尿病的成年人数量已达4.22亿，每年有150万人死于该疾病，使其成为一个重大的健康问题1。事实上，未受控制的糖尿病会导致多种生理紊乱，影响心血管系统、肾脏以及周围和中枢神经系统。
有趣的是，急性和慢性高血糖可能改变认知功能，并促进痴呆和抑郁症的发生2,3,4,5,6。此外，高血糖患者在发生缺血性脑卒中后，其功能预后、神经功能恢复及生存率均较差7,8,9,10,11。另有研究显示，高血糖/糖尿病通过影响神经干细胞活性以及新生神经元的分化、迁移和存活，进而影响成体神经发生——即新神经元生成的过程2,12。
与哺乳动物不同，硬骨鱼类（如斑马鱼）在整个大脑中均表现出强烈的神经发生活性，并在成年期展现出卓越的脑修复能力13,14,15,16。值得注意的是，这种能力的实现得益于神经干细胞/前体细胞（包括放射状胶质细胞和成神经细胞）的持续存在17,18,19。此外，斑马鱼近年来已逐渐成为研究代谢紊乱（包括肥胖症和高血糖/糖尿病）的模型生物20,21,22。
尽管斑马鱼是研究高血糖和神经发生的公认模型，但很少有研究探讨高血糖对脑内稳态和认知功能的影响12,23。为了确定高血糖对基础状态及损伤诱导的脑细胞增殖的影响，通过腹腔注射D-葡萄糖建立急性高血糖模型。此外，通过将斑马鱼浸入添加D-葡萄糖的水中复制慢性高血糖模型12。斑马鱼在科研中具有诸多优势：价格低廉、易于饲养、在发育早期阶段身体透明，且其基因组已被测序。在本研究背景下，斑马鱼还具备若干额外优势：（1）其生理过程与人类相似，使其成为生物医学研究的重要工具；（2）由于其广泛而强烈的神经发生活性，可用于快速评估高血糖对脑内稳态和神经发生的影响；（3）作为一种替代模型，有助于减少科研中哺乳动物的使用数量。最后，斑马鱼还可用于通过PET/CT技术测试放射性标记分子及潜在治疗剂的生物分布情况。
以下实验方案的总体目标是直观展示如何建立斑马鱼急性与慢性高血糖模型，利用斑马鱼评估高血糖条件下脑组织的重塑，并通过PET/CT监测放射性标记分子（此处为[18F]-FDG）。

<table><tbody><tr><td>1 mL 鲁尔锁注射器</td><td>BD, USA</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>4',6'-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>D8417</td><td></td></tr><tr><td>7 mL 小型平口实验室容器</td><td>Dutscher, France</td><td>080171</td><td></td></tr><tr><td>D-葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>67021</td><td></td></tr><tr><td>数码相机</td><td>Life Sciences, Japan</td><td>Hamamatsu ORCA-ER</td><td></td></tr><tr><td>一次性底模&amp;nbsp;</td><td>Simport, Canada</td><td>M475-2</td><td></td></tr><tr><td>驴抗兔 Alexa Fluor 488</td><td>Life Technologies, USA</td><td>A21206</td><td></td></tr><tr><td>包埋中心</td><td>Thermo Scientific, USA</td><td>Shandon Histocentre 3</td><td></td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>Nikon, Japan</td><td>Eclipse 80i</td><td></td></tr><tr><td>氟脱氧葡萄糖（&lt;sup&gt;18&lt;/sup&gt;F-FDG）</td><td>Cyclotron, France</td><td></td><td></td></tr><tr><td>血糖仪测试条</td><td>LifeScan, France</td><td>One-Touch 143 Ultra</td><td></td></tr><tr><td>羊抗鼠 Alexa Fluor 594</td><td>Life Technologies, USA</td><td>A11005</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;活体&lt;/em&gt;成像系统</td><td>TriFoil Imaging, Canada</td><td>Triumph Trimodality&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>切片机</td><td>Thermo Scientific, USA</td><td>Microm HM 355 S</td><td></td></tr><tr><td>单克隆小鼠抗PCNA抗体</td><td>DAKO, USA</td><td>克隆 PC10</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛（PFA）</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>P6148-500G</td><td></td></tr><tr><td>多克隆兔抗GFAP抗体</td><td>DAKO, USA</td><td>Z033429</td><td></td></tr><tr><td>载玻片干燥台</td><td>Electrothermal, USA</td><td>MH6616</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸三钠二水合物&amp;nbsp;</td><td>Prolabo, France</td><td>27833.294</td><td></td></tr><tr><td>无菌针头</td><td>BD Microlance 3</td><td>30 G 1/2 ; 0.3 mm&amp;times; 13 mm</td><td></td></tr><tr><td>学生型 Dumont #5 镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>学生外科剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>91400-14</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus Gold 载玻片</td><td>Thermo Scientific, USA</td><td>FT4981GLPLUS</td><td></td></tr><tr><td>手术显微镜</td><td>Leica, France</td><td>M320-F12</td><td></td></tr><tr><td>组织包埋盒</td><td>Simport, Canada</td><td>M490-10</td><td></td></tr><tr><td>组织包埋介质</td><td>LeicaBiosystems, USA</td><td>39602004</td><td></td></tr><tr><td>甲苯</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>244511</td><td></td></tr><tr><td>三卡因 MS-222</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>吐温 X-100</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>X100-500 mL</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield 封片剂&amp;nbsp;</td><td>Vector Laboratories, USA</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>二甲苯</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>534056</td><td></td></tr><tr><td>鱼类品系</td><td>AB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;磷酸盐缓冲盐水（10X PBS），pH 7.4（配制1升）&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>配制10X PBS时，加入以下盐类，并用蒸馏水定容至1升&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;氯化钾（分子量：74.55 g/mol）：2.00 g&lt;/em&gt;</td><td>&lt;em&gt;Sigma-Aldrich, Germany&lt;/em&gt;</td><td>&lt;em&gt;746436&lt;/em&gt;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;磷酸二氢钾（分子量：136.09 g/mol）：2.40 g&lt;/em&gt;</td><td>&lt;em&gt;Sigma-Aldrich, Germany&lt;/em&gt;</td><td>&lt;em&gt;795488&lt;/em&gt;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;氯化钠（分子量：58.44 g/mol）：80.00 g&amp;nbsp;&lt;/em&gt;</td><td>&lt;em&gt;Sigma-Aldrich, Germany&lt;/em&gt;</td><td>&lt;em&gt;S9888&lt;/em&gt;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;磷酸氢二钠（分子量：141.96 g）：14.40 g&lt;/em&gt;</td><td>&lt;em&gt;Sigma-Aldrich, Germany&lt;/em&gt;</td><td>&lt;em&gt;795410&lt;/em&gt;</td><td></td></tr></tbody></table>

斑马鱼中高血糖的急性和慢性模型：评估高血糖对神经发生及放射性标记分子生物分布影响的方法

Acute and Chronic Models of Hyperglycemia in Zebrafish: A Method to Assess the Impact of Hyperglycemia on Neurogenesis and the Biodistribution of Radiolabeled Molecules

高血糖是一种导致心血管和脑功能障碍的主要健康问题。例如，高血糖与卒中后神经系统并发症风险增加相关，并被证实会损害神经发生过程。有趣的是，成年斑马鱼最近被确立为模拟高血糖/糖尿病以及研究基础性和再生性神经发生的相关且有用的模型。本研究提供了建立高血糖斑马鱼模型的方法，以探讨高血糖在稳态和脑修复条件下对脑细胞增殖的影响。急性高血糖通过向成年斑马鱼腹腔注射D-葡萄糖（2.5 g/kg体重）建立。慢性高血糖则通过将成年斑马鱼浸入含D-葡萄糖（111 mM）的水中持续14天来诱导。文中描述了针对上述不同方法的血糖水平测定技术。此外，还演示了研究高血糖对基础性和再生性神经发生影响的方法，包括端脑的机械损伤操作、脑组织解剖、石蜡包埋及切片机切片，以及免疫组织化学实验流程。最后，本文还介绍了利用斑马鱼作为研究放射性标记分子（此处为[18F]-FDG）在体内分布情况的相关模型，并采用PET/CT进行检测的方法。

采用本文所述方法，对成年斑马鱼进行腹腔注射D-葡萄糖（2.5 g/kg体重），注射后1.5小时，其血糖水平显著升高（图1A）。注射24小时后，D-葡萄糖处理组与PBS对照组斑马鱼的血糖水平相似12。对于慢性处理，将斑马鱼浸入含D-葡萄糖的水溶液（111 mM）中，经14天处理后出现高血糖状态（图1B），该结果与先前研究一致12,22。
为了研究高血糖对脑细胞增殖的影响，在诱导斑马鱼急性及慢性高血糖后，对其脑组织进行了PCNA免疫组织化学检测。尽管急性高血糖并未影响脑细胞的增殖12，但慢性高血糖显著降低了脑室周围神经干细胞的增...

本研究描述了在斑马鱼中建立急性与慢性高血糖模型的方法。目的是研究高血糖对生理过程的影响，例如稳态神经发生及损伤诱导的神经发生。本研究还强调了利用斑马鱼结合正电子发射断层扫描/计算机断层扫描（PET/CT）技术追踪放射性标记分子（此处为[18F]-FDG）的应用。

高血糖是一种主要的健康问题，可导致心血管和脑功能障碍。例如，它与神经系统损伤风险增加相关……

以下实验方案的总体目标是评估高血糖条件下大脑的重塑情况，并追踪斑马鱼体内放射性标记的分子。高血糖的特征是血液中葡萄糖浓度过高。慢性高血糖可能由糖尿病引起，并导致多种血管功能障碍，进而引发心肌梗死、脑卒中或糖尿病足溃疡等临床并发症。此外，应激引起的急性高血糖可能促进缺血性卒中的出血性并发症。斑马鱼是研究人类疾病及其对中枢神经系统影响的有趣模型。尤其值得注意的是，成年斑马鱼大脑具有强烈的神经发生能力和卓越的脑修复机制，相较于哺乳动物更为显著，因此斑马鱼是研究急性应激和高血糖条件下脑重塑的良好模型。它还允许研究放射性标记分子以及潜在治疗剂的生物分布。所有实验均按照法国和欧洲共同体关于动物研究使用的指南进行，并经当地动物实验伦理委员会批准。用渔网轻柔地捕获一条鱼。将鱼放入少量三卡因麻醉剂中，麻醉剂在水中稀释至终浓度为0.02%。待鱼停止活动后，用剪口的移液管小心取出，并轻轻置于吸水纸上，尽量去除水分。称量鱼的体重，以准备注射用的 D-葡萄糖溶液，剂量为每公斤体重 50 微升，浓度为 2.5 克/升。例如，一条 0.6 克重的鱼将接受 50 微升的 3% D-葡萄糖 PBS 溶液。将鱼置于背侧卧位，并用一只手固定。用另一只手将注射器针头插入腹腔，缓慢注入D-葡萄糖PBS溶液。拔出针头，将鱼放回鱼用培养水中。观察鱼直至其完全恢复。通常在1.5小时后测量其血糖水平。为了模拟慢性高血糖状态，准备一个2升的D-葡萄糖溶液，终浓度为111毫摩尔。具体操作为：称取40克D-葡萄糖，放入一个空的容器中。向水箱中加入两升鱼用水，并放入最多七条鱼。每两天更换一次葡萄糖溶液，以避免细菌或其他微生物的生长。通过持续14天的D-葡萄糖处理，可建立慢性高血糖模型。用渔网捕获一条鱼，并将其置于冰上。用冰覆盖鱼体，以实现快速安乐死。取鱼并擦拭鱼体，以去除可能稀释血液样本的水滴。用解剖镊取下眼球，等待眼窝充满血液。将血糖试纸插入血糖仪，再将试纸插入眼窝中。记录血糖浓度数值。对于急性高血糖，腹腔注射 d-葡萄糖可导致血糖水平显著升高，如注射后1个半小时所示。对于慢性高血糖，将鱼浸入 d-葡萄糖溶液中可导致血糖水平显著升高，如处理14天后所示。操作结束后，用解剖剪将身体与头部分离，并将头部置于用PBS稀释的4%多聚甲醛中，用于免疫组织化学实验。4°C下孵育过夜。或者，也可直接取出脑组织并冷冻，用于其他实验，例如mRNA提取。次日，用PBS冲洗固定后的头部样本，并在解剖显微镜下用针固定维持。取下另一只眼睛，用镊子轻轻打开颅骨顶部。然后小心取出脑组织，置于1x PBS中。固定的脑组织经一系列浓度递增的乙醇逐步脱水，随后浸入甲苯中两次，每次30分钟。将脑组织放入包埋盒中，并小心盖上盖子。将包埋盒置于58至60摄氏度的熔融石蜡中。在脑组织石蜡包埋过程中，打开温控镊子加热装置。将包埋盒放入干净的石蜡浴中。石蜡浸渍

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科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

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了解斑马鱼急性和慢性高血糖模型的建立方法，评估高血糖对神经发生的影响，并利用PET/CT成像技术追踪放射性标记分子的生物分布。该方法为研究糖尿病中枢神经系统并发症提供了重要的实验工具。

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