Name: 人类诺沃克病毒的表面上检测拭子采样方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-06T10:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: 学习使用宏泡沫拭子采样法检测环境硬表面上的诺如病毒，该方法可提高病毒回收率并支持疫情溯源与污染动态评估。此方案为微生物学和环境科学研究提供了可靠的实验工具。

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作者无致谢。

1. 现场拭子采样
<ol>
	<li>戴上一副干净的手套。</li>
	<li>使用卷尺或直尺测量采样区域的尺寸，切勿触碰表面。尽量准确估算面积，并填写报告表（补充表1）。</li>
	<li>检查拭子采样 kit 是否有泄漏，并对样本运输袋和拭子采样 kit 进行标记。</li>
	<li>按以下方式在采样区域移动拭子：水平方向擦拭一次，垂直方向擦拭一次，对角线方向擦拭一次。采样表面面积不得超过 700 cm2。</li>
	<li>将每根拭子放入试管中，并牢固拧紧管盖。</li>
</ol>
2. 拭子的储存与运输至实验室
<ol>
	<li>将拭子在 4 °C 下保存，最长可保存 48 小时。如需更长时间保存，请将拭子置于 -20 °C（或 -70 °C）保存。</li>
	<li>将试管置于 0-4 °C 环境中即使用冰袋并在运输过程中置于保温容器内，于采集后24-48小时内送至实验室。</li>
</ol>
3. 病毒浓缩、病毒RNA提取与纯化
注意：除非另有说明，所有离心步骤均使用台式离心机，在室温下以 5,000 × g 离心 5 分钟。使用通用核酸提取缓冲液（UNEX 缓冲液）时需格外小心。请佩戴护目镜或面罩。
<ol>
	<li>为每个样本标记一个15 mL离心管和一个RNA Midi柱。每次实验均需包含一个阴性提取对照。</li>
	<li>为准备10根拭子的裂解液，将25 mL UNEX缓冲液与25 mL PBST（含0.02% Tween-80的pH 7.2 PBS）混合。</li>
	<li>向50 mL裂解液中加入50 µL的大肠杆菌噬菌体MS2悬液（106 PFU/µL）。</li>
	<li>将一根拭子放入15 mL离心管中，加入5 mL裂解液，混匀并在室温下孵育10分钟。</li>
	<li>向每根离心管中加入5 mL 100%乙醇，涡旋振荡10秒。</li>
	<li>小心地从15 mL离心管中取出拭子（管内含有UNEX缓冲液），轻轻挤压拭子管壁以去除多余液体，然后弃去拭子。剩余液体体积应为9–10 mL之间。</li>
</ol>
4. 中型柱法病毒核酸提取
<ol>
	<li>小心将步骤 3.6 中的 4.5 mL UNEX/乙醇混合液转移至一个中量柱上，离心并弃去滤液。</li>
	<li>将相同混合液的另外 4.5 mL 加入同一中量柱中，离心并弃去滤液。</li>
	<li>第一次洗涤时，向中量柱中加入 3.5 mL 70% 乙醇，离心并弃去滤液。</li>
	<li>第二次洗涤时，再向中量柱中加入 3.5 mL 70% 乙醇，离心并弃去滤液。</li>
	<li>干燥离心步骤：对中量柱进行离心，以彻底去除残留的乙醇（乙醇残留可能对病毒 RNA 回收产生不利影响）。</li>
	<li>将中量柱放入一个新的 15 mL 离心管中。向中量柱中加入 250 µl 洗脱缓冲液；静置 1 分钟后再进行离心，以获得最高的病毒 RNA 回收率。</li>
	<li>将提取的核酸在 -70 °C 下保存，或立即进入步骤 5。</li>
</ol>
5. 使用RNA纯化与浓缩试剂盒浓缩病毒核酸
<ol>
	<li>向上一步骤4.7中洗脱的250 µL RNA中加入500 µL RNA结合缓冲液，涡旋振荡10秒。</li>
	<li>加入750 µL 100%乙醇，涡旋振荡10秒。</li>
	<li>为每个样本标记一个离心柱。将750 µL样本加入离心柱中。</li>
	<li>在12,000 x g离心力下离心离心柱1分钟，弃去穿流液。</li>
	<li>将剩余的750 µL样本加入同一离心柱中，在12,000 x g离心力下离心1分钟。</li>
	<li>预洗步骤：向每个离心柱中加入400 µL RNA Prep缓冲液，在12,000 x g离心力下离心1分钟，弃去穿流液。</li>
	<li>第一次洗涤：向每个离心柱中加入800 µL RNA洗涤缓冲液，在12,000 x g离心力下离心1分钟，弃去穿流液。</li>
	<li>第二次洗涤：向离心柱中加入400 µL RNA洗涤缓冲液，在12,000 x g离心力下离心1分钟，弃去穿流液。</li>
	<li>干燥离心：将离心柱在12,000 x g离心力下离心2分钟，以彻底去除残留的洗涤缓冲液。</li>
	<li>小心地将离心柱转移至一支洁净的1.5 mL微量离心管中。</li>
	<li>向离心柱中加入25 µL洗脱缓冲液，室温孵育1分钟。此步骤可提高病毒RNA的回收率。</li>
	<li>在10,000 x g离心力下离心1分钟，收集RNA。</li>
	<li>可直接进入RT-qPCR步骤（步骤6），或将RNA在-70 °C保存。</li>
</ol>
6. 基因型组I和II诺如病毒及大肠噬菌体MS2的多重RT-qPCR检测（补充表2）
<ol>
	<li>清洁工作台面、移液器和离心机时使用RNase去污染溶液，以减少可能的污染。</li>
	<li>在冰上解冻RT-qPCR试剂。在冰上解冻RNA（在单独的区域/房间内进行）。</li>
	<li>确定反应数量，并额外增加至少10%的反应数（例如 如果需要进行10个反应，则配制11个反应的预混液。</li>
	<li>涡旋混合各母液组分（25x RT-qPCR 酶除外），持续 5 秒。用手指轻弹管壁，小心混匀酶液。</li>
	<li>将主混合液组分短暂离心5秒。</li>
	<li>根据试剂盒说明书配制用于诺如病毒GI和GII实时RT-PCR检测的主混合液，并在1.5 ml微量离心管中加入诺如病毒特异性寡核苷酸引物和探针（补充材料 表3).</li>
	<li>用移液器上下吹打5-10次混匀主混合液（不建议使用涡旋振荡）。将22 µL主混合液分装至实时荧光定量PCR 96孔板的每个孔中。</li>
	<li>涡旋混匀RNA样品5秒，并通过短暂（5秒）离心收集。</li>
	<li>向RT-qPCR板中加入3 µL样本RNA以及GI和GII阳性对照（按照模板操作） 表2）。在无模板对照（NTC）孔中加入 3 µL 无核酸酶水。</li>
	<li>用光学粘性膜密封实时检测板。</li>
	<li>将实时检测板在1,300 × g条件下小心离心1分钟，以去除孔中可能存在的气泡或液滴。</li>
	<li>设置实时荧光定量PCR仪，并设定以下扩增循环条件：（1）反转录步骤：45 °C 反应10 min；（2）Taq DNA聚合酶激活：95 °C 反应10 min；（3）45个循环：95 °C 变性15 s，60 °C 延伸60 s。</li>
</ol>
7. 擦拭样本中诺如病毒的定量
<ol>
	<li>检查阳性和阴性对照的结果，以验证 RT-qPCR 结果（补充表3).</li>
	<li>确定每条标准曲线是否符合补充材料中给出的可接受值 表 2 并使用公式1计算标准曲线的整体标准偏差。 
	（公式 1）% 效率 = 100 × 10(平均 Ct 值 - 截距) / 斜率.</li>
	<li>如果PCR仪的软件未计算每条标准曲线的斜率，则需手动确定斜率和R2使用统计软件通过回归分析计算数值例如 Excel、SPSS 或 SAS）。此外，根据公式 I 计算标准曲线的扩增效率百分比（% efficiency）</li>
	<li>根据符合规定标准曲线，记录热循环仪软件计算的所有测试样本的RNA拷贝数 补充表4重新运行任何带有标准曲线的样本 t不符合标准或出现假阳性对照的结果。检查作为内参对照添加的大肠杆菌噬菌体MS2的Ct值，以监测PCR抑制情况。</li>
	<li>通过将第7.2步计算得到的RNA拷贝数乘以总RNA洗脱液体积（25至50 µL）与用于RT-qPCR反应的RNA体积（3至5 µL）的比值，确定每个样本的RNA总拷贝数。或者，通过将RNA总拷贝数除以物体表面积（cm²），计算RNA密度。2) 进行分析。</li>
</ol>
8. 通过半巢式常规 PCR 扩增对实时 RT-PCR 阳性样本进行基因分型
<ol>
	<li>为RT-PCR检测的每对引物制备第一轮主混合液（补充表 2 和 5）。</li>
	<li>将5 µL诺如病毒阳性RNA加入20 µL主混合液中。</li>
	<li>在以下条件下运行RT-PCR：(1) 42 °C下反转录30分钟；(2) 95 °C激活Taq DNA聚合酶15分钟；(3) 95 °C变性30秒、50 °C退火30秒、72 °C延伸60秒，共40个循环。40个循环后，在72 °C继续延伸10分钟。</li>
	<li>为RT-PCR检测的每对引物制备第二轮主混合液（补充表 2 和 5）。</li>
	<li>在每个反应管中加入23 µL主混合液和2 µL第一轮RT-PCR产物（理想情况下，第一轮产物应使用无RNase水稀释至1/10）。</li>
	<li>重复步骤8.3。</li>
	<li>用100 mL 1×Tris-乙酸盐-EDTA缓冲液（40 mM Tris，20 mM乙酸，1 mM EDTA，pH 8.3）配制2%琼脂糖凝胶。将混合物在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解，冷却至60–70 °C后，每100 mL凝胶加入10 µL核酸染料，混匀后倒入模具并插入梳子。让凝胶静置至少30分钟使其凝固。</li>
	<li>将每份RT-PCR产物15 µL与3 µL 6×上样缓冲液混合。每样取15 µL上样，在100 V电压下电泳1小时。</li>
	<li>从凝胶中切下适当大小的目标RT-PCR片段（GI型为330 bp，GII型为341 bp），使用商品化的凝胶回收试剂盒纯化RNA。纯化后的PCR产物可用于Sanger测序。</li>
</ol>

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</ol>

作者无利益冲突。本报告中的发现和结论仅代表作者观点，不一定代表美国疾病控制与预防中心的官方立场。

诺如病毒对人类的50%感染剂量介于18至10之间3 病毒颗粒20因此，即使表面存在低水平污染，也可能对公共卫生构成风险。本研究评估了拭子采样方案的多个方面，包括：1）不同拭子材料，2）运输过程中拭子的储存条件，3）病毒RNA浓度，以及4）使用大肠杆菌噬菌体MS2作为内部提取对照。
直到最近，仅对棉质、聚酯、尼龙和抗静电擦拭材料制成的拭子进行了性能评估，并建议用于现场检测13,14,15,21,22。其中，ISO 15216 检测方案推荐使用棉质拭子从食品制备表面和物体表面检测诺如病毒和甲型肝炎病毒23。然而，关于棉质拭子在实际现场条件下对大面积...

全球范围内，人诺如病毒是流行性和散发性急性胃肠炎的主要病因1,2,3。该病毒具有极强的传染性，可通过人与人之间的直接接触传播，也可通过接触受污染的食物、水或环境表面间接传播。诺如病毒可长期排出体外，且已有文献证实其在环境表面可长期存活1,2,3。在排病毒高峰期，每克粪便可释放数十亿个病毒颗粒，而呕吐物中所含的病毒颗粒数量也足以引起感染4,5,6,7,8,9,10。此外，病毒可在无生命表面与人类皮肤之间轻易转移2,11,12。因此，对环境污染状况的监测有助于疫情调查，并可评估清理和消毒措施的有效性。
已有多种环境采样方案被用于检测轮状病毒、大肠杆菌噬菌体MS2、猫杯状病毒（FCV）和细菌噬菌体P2213,14,15,16。然而，这些研究中描述的验证条件，包括快速干燥（&#160;&#60;1小时）和较小的表面面积（25 × 100 cm2），可能无法充分代表实际现场环境。此外，环境表面预期的污染水平较低，因此需要能够检测极少量病毒颗粒的检测方案。
我们开发了一种基于大孔泡沫的环境表面采样方法，用于诺如病毒的检测与分型。该方法已在多次诺如病毒暴发事件中得到验证。本方案包括：1）如何从环境表面采集拭子样本；2）在样本采集及运送至实验室过程中，如何最大限度地保持样本完整性；3）实验室中对诺如病毒进行检测与分型的方法。

<table><tbody><tr><td>&lt;强&gt;试剂盒的通用名称&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;大泡沫拭子&lt;/strong&gt;</td><td>预润湿 EnviroMax 棉签套装&amp;nbsp;</td><td>Puritan</td><td>2588060PFUW</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;RNA裂解缓冲液&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td>CDC UNEX 缓冲液</td><td>Microbiologics</td><td>货号 MR0501</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;RNA提取离心柱&lt;/strong&gt;</td><td>中型层析柱</td><td>Omega Biotek</td><td>货号 R6664-02</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;RNA纯化离心柱&lt;/strong&gt;</td><td>Zymol RNA 纯化浓缩试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Zymo Research</td><td>货号 R1016</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;实时荧光定量RT-PCR试剂盒&lt;/strong&gt;</td><td>AgPath试剂盒 一步法RT-PCR试剂盒</td><td>Life Technologies</td><td>货号 4387391</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;常规RT-PCR试剂盒&lt;/strong&gt;</td><td>Qiagen 一步法 RT-PCR 试剂盒</td><td>Qiagen试剂盒</td><td>货号 210212</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;凝胶回收试剂盒&lt;/strong&gt;</td><td>Qiagen QIAquick 胶回收试剂盒</td><td>Qiagen试剂盒</td><td>货号 28704 或 28706</td></tr><tr><td></td><td>大肠杆菌噬菌体MS2</td><td>ATCC</td><td>货号 15597-B1</td></tr><tr><td></td><td>RNA截断转录本</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>实时荧光定量PCR平台</td><td>应用生物系统公司</td><td>Model ABI 7500</td></tr><tr><td></td><td>光学96孔反应板</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>货号 4316813</td></tr><tr><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.thermofisher.com/order/catalog/en/US/adirect/%20https:/www.thermofisher.com/order/catalog/en/US/adirect/lt?cmd=catProductDetail&amp;&showAddButton=true&amp;&productID=4306311&amp;& _bcs_ = H4sIAAAAAAAAAI1RTWvDMAz9Nb4srDg2yXpNW3rZVyHbuRhHSQx2HWwnJf9 + UkO6scMYGEmWnqX3 
5Mec8e0p + GbUKWZMlFkNYTIa4h / 5PqWByYqJI57r9bpJPQTnWxPRb7R3mB4jGrig6b0DdD40WOyTs9iBCUmHb1MYge78iYi06ZznPEd0exacF6LkD5h + NRr4yg1II0DH5C6rmh6imSA7GuuInsIq5TUyjD6Yf / KU1Zav3NBrlZT13cr8s0ajGhNAJ4xsYvKoXcPkAYEHEwer5jrNFuWVdF1ieajNpbPwAhPYvUrQ + TAjAt88w4zlm8Ly / YRha2yiyeUSUJM35ajHt + ZiUS0KuWNityrHkLSjuyHUDbkgfuxgbfwxD9Q0vydo9rrs4te675 / TKhvpd74AhB0C9yUCAAA =&amp;amp;returnURL=http%3A%2F%2Fwww.thermofisher.com%3A80%2Forder%2Fcatalog%2Fen%2FUS%2Fadirect%2Flt%3Fcmd%3DcatDisplayStyle%26catKey%3D101%26filterType%3D1%26OP%3Dfilter%26filter%3Dft_1101%252Ff_2005260*">MicroAmp 透明粘性膜&amp;nbsp;&lt;/a&gt;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>货号 4306311</td></tr></tbody></table>

表面人诺如病毒检测的拭子采样方法

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

诺如病毒是全球范围内流行性和散发性胃肠炎的主要病因。由于大多数感染是通过人与人之间的直接接触传播，或通过环境表面或食物间接传播，因此在诺如病毒暴发期间，被污染的物体表面和无生命表面是病毒传播的重要媒介。
我们开发并评估了一种使用宏孔泡沫拭子从硬质表面检测和分型人诺如病毒的方案。与纤维头拭子或防静电擦拭布相比，宏孔泡沫拭子可从面积达700 cm2的马桶座圈表面回收病毒（回收率范围为1.2–33.6%）。该方案包括从拭子中提取病毒以及利用离心柱进一步浓缩病毒RNA的步骤。总计217份从诺如病毒胃肠炎暴发的邮轮和长期护理机构表面采集的拭子样本中，有127份（58.5%）经RT-qPCR检测呈GII型诺如病毒阳性。其中29份（22.8%）成功完成了基因分型。综上所述，采用我们所开发的方案检测环境表面的诺如病毒，有助于在暴发期间评估环境污染程度，并在无法获得临床样本时实现病毒检测；同时也有助于监测环境干预措施的有效性。

图1展示了拭子采样流程的流程图。该流程包括四个主要步骤：1）样本采集，2）样本储存与运输，3）病毒RNA的纯化与浓缩，以及4）反转录定量PCR检测与基因分型。
<img alt="核酸提取流程图；诺如病毒检测和基因分型的逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）设置。" src="/files/ftp_upload/55205/55205fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：环境表面样本中诺如病毒检测的最终方案流程图 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55205/55205fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<p class="jove_content" ...

开发并评估了一种基于大泡沫材料的采样方法，用于检测和定量环境硬质表面上的诺如病毒。

人类诺如病毒是全球范围内流行性和散发性胃肠炎的主要病因。大多数感染通过直接途径传播，例如……

本研究基于大泡沫材料的表面采样方法的总体目标是确定诺如病毒暴发的病因、全面评估环境中病毒污染的动态变化，以及评价针对诺如病毒的环境整治措施的有效性。本方案详细说明了如何从环境表面采集拭子样本、这些拭子应如何保存和运输，以及推荐采用何种实验室方案对拭子中的诺如病毒进行检测与分型。相较于以往方法，本诺如病毒环境拭子采样方案的显著改进在于：我们已确定了最佳的拭子材料类型、明确了从硬质表面可回收的诺如病毒量，并证实该方案可有效用于较大面积表面的采样。在本视频中，我的两位高级科研人员 Geun Woo Park 和 Preeti Chhabra 将演示用于诺如病毒检测与分型的拭子采样流程。开始采样时，进入采样区域，用拭子在采样区域水平方向划一次，垂直方向划一次，对角线方向划一次。将每根拭子分别放入独立的试管中，并拧紧管盖。对不锈钢表面、马桶座圈表面和门把手表面进行取样。接下来，为每个样本标记一个15毫升离心管和一个RNA Midi柱。每次实验均需包含一个阴性提取对照。准备一个空瓶用于收集通用核酸提取（UNEX）缓冲液废液。为10个拭子制备裂解液时，将25毫升UNEX缓冲液与25毫升PBST混合。向50毫升裂解液中加入50微升大肠杆菌噬菌体MS2悬液。将拭子放入一个15毫升的离心管中，加入5毫升裂解液。在溶液中充分混匀拭子，然后将混合物在室温下孵育。向每根试管中加入5毫升100%乙醇，并涡旋振荡试管10秒。小心地将拭子从15毫升离心管中取出，轻轻在管壁上挤压以去除多余的液体，然后丢弃拭子。准确转移4.5毫升UNEX乙醇混合液至Midi柱上，离心柱子。离心后，弃去滤液。将相同混合物的另外4.5毫升上样至同一层析柱，然后离心该层析柱。弃去滤液。第一次洗涤时，向中量柱中加入3.5毫升70%乙醇，并离心层析柱。离心后弃去滤液。第二次洗涤时，向中量柱中加入3.5毫升70%乙醇。离心后弃去滤液。对于干燥离心步骤，将中量柱离心以彻底去除乙醇残留。将中量柱放入一个新的15毫升离心管中。在中量柱上加入250 µL洗脱缓冲液，静置1分钟后离心，以获得最高的病毒RNA回收率。向250微升RNA中加入500微升RNA结合缓冲液，涡旋混合10秒。加入750微升100%乙醇，再涡旋10秒。接下来，为每个样品标记一个离心柱。将750微升样品加入离心柱中，离心。弃去穿流液。将剩余的750微升样品加入另一离心柱中，离心柱。离心。预洗步骤中，向每个离心柱中加入 400 微升 RNA 提取缓冲液，然后离心。弃去流出液。第一次洗涤时，向每个离心柱中加入 800 微升 RNA 洗涤缓冲液，然后离心柱子。弃去流出液。第二次洗涤时，向每个离心柱中加入 400 µL RNA 洗涤缓冲液，然后离心。弃去流出液。进行干燥离心，将离心柱放入离心机中离心，以彻底去除洗涤缓冲液的残留。小心地将离心柱转移至一个洁净的1.5毫升微量离心管中。向离心柱中加入25 µL洗脱缓冲液，并在室温下孵育1分钟，以提高从离心柱中回收病毒RNA的效率。通过在10,000 × g下离心旋转柱1分钟来收集RNA。随后直接进行实时PCR。在继续进行多重实时RTPCR之前，使用RNase去污染溶液清洁工作台面、移液器和离心机。将实时 PCR 试剂在冰上解冻。在另一区域将样本 RNA 在冰上解冻。确定反应数量，并额外准备至少 10% 的试剂用于配制混合液，以补偿移液过程中的损耗。接下来，将各组分的预混液分别涡旋振荡5秒。通过轻弹管壁小心混匀酶溶液。将预混液各组分短暂离心5秒。然后，根据试剂盒说明书配制用于检测诺如病毒G1和G2的RTPCR反应主混合液，并在1.5毫升微量离心管中加入诺如病毒特异性的寡核苷酸引物和探针。接着，通过移液器上下吹打七次混匀主混合液。将22微升主混合液分装至实时荧光定量PCR板的每个孔中。将样本RNA涡旋振荡5秒，并通过5秒离心收集管内液体。向实时PCR板中加入3微升样本RNA阳性对照以及G1和G2 RNA转录本的10倍系列稀释液。向无模板对照（NTC）孔中加入3微升无核酸酶水。使用光学粘合膜密封反应板。将反应板小心地以1,300 ×g离心1分钟，以去除反应孔中可能存在的任何气泡或液滴。随后，设置实时PCR仪并输入热循环条件。确定G1和G2转录本的标准曲线。利用各自的标准曲线将Ct值转换为RNA拷贝数。根据总RNA洗脱液体积与用于实时检测的RNA总量之比，计算每个样本中的RNA总拷贝数。为了使用半巢式常规RTPCR对诺如病毒阳性样本进行基因分型，首先配制第一轮RTPCR的预混液，并将20微升等分试样加入预先标记的PCR管中。向每管中加入5微升RNA。第一轮RTPCR完成后，通过将23微升等分试样分装至新管中，配制半巢式第二轮PCR的预混液。最后，向每管中加入2 μL第一轮PCR产物。基于大泡沫材料的拭子采样方法已在一艘报告有疑似诺如病毒胃肠炎病例的邮轮所采集的样本中进行了实地测试。在17份诺如病毒阳性的拭子样本中，有4份可进行基因分型，且所有样本均具有相同的G2序列。通过病毒载量测定，可评估污染严重的表面，例如马桶座圈。通过实时荧光定量逆转录PCR检测循环阈值（Ct值）与样本测序能力之间的关系。总共217份拭子样本中有127份检测出G2型诺如病毒呈阳性。Ct值在24至27之间和28至31之间的拭子样本的基因分型率分别为100%和72.2%。相比之下，Ct值在32至36之间和37至40之间的拭子样本中，仅有22%和1.6%成功测序。如我们所证实，本方案可用于确定诺如病毒暴发期间的环境污染程度，在无法获得临床样本时检测暴发的可能原因，以及评估清洁措施的有效性。为了获得最准确的结果，严格遵循本方案以最大限度地减少不同样本间结果的差异至关重要。

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科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

人类诺沃克病毒的表面上检测拭子采样方法

本文描述了一种一步法逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测方法，用于检测儿童粪便样本中的诺如病毒分离株并进行基因组别鉴定，该方法采用针对诺如病毒基因组中最保守区域——开放读码框1（ORF1）与开放读码框2（ORF2）连接区的特异性引物和TaqMan探针。同时详细介绍了一种非商业化的、经济高效的RNA提取方法。...

通过TaqMan一步法RT-PCR检测儿童粪便中的诺如病毒并进行基因群分型

本视频演示了一种用于定量人诺如病毒类病毒颗粒（VLPs）与人肠道细菌结合的检测方法。将细菌悬液与VLPs混合并孵育，以形成VLP-细菌复合物。随后用荧光标记的VLP特异性抗体对复合物进行标记，再通过基于流式细胞术的可视化和定量分析，确定结合VLP的细菌百分比。...

一种定量检测人诺如病毒样颗粒与肠道细菌结合能力的实验方法

EPA 方法 1615 使用带正电滤膜来浓缩环境水和饮用水中的肠道病毒和诺如病毒。本论文描述了用于方法 1615...

EPA 方法 1615. 通过培养法和反转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）检测水中肠道病毒和诺如病毒的存在。I. 病毒样品的采集

本文介绍了一种利用水牛绿色猴肾细胞系检测可培养病毒总量的方法。该方法为检测环境水和饮用水中感染性病毒的存在情况提供了一种标准化的工具。...

EPA 方法 1615：通过培养法和反转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）检测水中肠道病毒和诺如病毒的存在。第二部分：总可培养病毒检测

本文介绍了一种利用反转录-定量PCR方法对环境水和饮用水中肠道病毒和诺如病毒进行定量的实验流程。采用美国环境保护署方法1615（EPA Method...

EPA 方法 1615. 通过培养法和反转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）检测水中肠道病毒和诺如病毒的存在情况。第三部分：通过 RT-qPCR 检测病毒

利用病毒基因组扩增的常规检测方法受限于无法区分具有感染性与非感染性的病毒颗粒。本文旨在提供详细的实验方案，介绍利用适配体结合、动态光散射和透射电子显微镜等替代方法，以辅助区分具有感染性的诺如病毒颗粒。...

替代方法 体外 病毒衣壳结构完整性的测定方法

本实验方案的目的是定量分析真核病原体人诺如病毒与细菌的结合能力。在完成初步的病毒-细菌结合实验后，采用流式细胞术检测整个细菌群体中与病毒结合的细菌。...

利用流式细胞术定量人诺如病毒样颗粒与共生细菌的结合

一项公民科学项目旨在招募圣迭戈居民，以采集环境样本用于检测严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）。项目开发了一个多语言的基于网络的平台，通过用户友好的移动设备界面提交数据。实验室信息管理系统支持采集数千份地理分布多样的样本，并实现对结果的实时追踪。...

对城市环境进行拭子采样——从环境储存库中采样与检测 SARS-CoV-2 的流程

本方案描述了一种基于胶带的简易方法，用于采集番茄及其他新鲜农产品表面样本，随后进行完整的细胞快速检测 沙门氏菌 使用荧光 原位...

基于胶带黏附取样与荧光技术的联用方法 原位 杂交法用于快速检测 沙门氏菌 在新鲜农产品上

运动能够诱导免疫细胞发生凋亡。现有的检测方法存在多种局限性，尤其是血液样本在分析前所需的分离和处理时间较长。本文展示了一种快速且微创的方法，用于分析运动诱导的淋巴细胞凋亡。...

指尖采血法用于测定运动诱导的淋巴细胞凋亡

学习使用宏泡沫拭子采样法检测环境硬表面上的诺如病毒，该方法可提高病毒回收率并支持疫情溯源与污染动态评估。此方案为微生物学和环境科学研究提供了可靠的实验工具。

表面人诺如病毒检测的拭子采样方法

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