Name: 通过Acufection和它的皮肤研究中的应用的经济型DNA递送系统的开发 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: 了解Acufection技术在小鼠皮肤中递送质粒DNA的经济型方法，用于研究免疫相关基因在皮肤炎症中的功能作用。该方法为开发银屑病等皮肤病新疗法提供了高效且低成本的基因表达平台。

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本研究由科技部资助（MOST 103-2633-B-002-002；104-2320-B-002-048）。我们感谢台湾大学的Betty Wu-Hsieh博士和李简国博士、斯坦福大学的Leigh Zerboni、夏威夷大学的Peter Hoffmann博士对稿件的审阅，感谢台湾大学简昀的实验技术协助，以及感谢中国台湾中央研究院农业生物技术研究中心魏文赐博士提供的技术指导。

本研究使用8至12周龄的雌性小鼠。C57/BL6野生型（WT）小鼠和IL-15缺陷型（Il15-/-）小鼠分别购自中国台湾国家实验动物中心（NLAC）和Taconic Farm。IL-15缺陷型（Il15-/-）与IL-15优势型（Il15+/- 和 Il15+/+）在Il15+/-杂合子交配后的第二代中呈现1:3的比例。通过PCR分析确认Il15-/-小鼠的基因型。小鼠饲养于台湾大学医学院实验动物中心（LAC）的特定病原体阴性（SPF）设施中。所有动物实验操作，包括麻醉剂材料与方法，均依照台湾大学医学院及公共卫生学院机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准的动物实验方案（动物实验许可证明书编号：20130225）进行。
1. 针灸针的准备
注意：针灸针是由针柄和针尖组成的医疗器械（图1A）。针灸针的直径范围为0.2 mm（36 G）至0.35 mm（28 G）。我们选用最细的针尖，以避免刺破皮肤时可能造成的过度细胞损伤。0.2 mm直径的针有4种不同长度，分别为13 mm（0.5英寸）、25 mm（1.0英寸）、40 mm（1.5英寸）和50 mm（2.0英寸）。在C57BL/6小鼠皮肤上进行针体摆动操作时，使用一束10根、长度为13 mm的针可提供最佳的手感和操作舒适性。若将该方法应用于体型更大的动物皮肤，或由手部较大的研究人员操作时，相关参数可作相应调整。
<ol>
	<li>从无菌、无热原的包装中取出针灸针。&#160;将针放置在无菌敷布上。</li>
	<li>使用粘性标签胶带将10根针捆绑成一束（图1B）。 
	注意：这10根针在几何上排列成圆柱形。为方便操作，可在使用粘性胶带前先用一块石蜡膜固定针的排列，确保所有针尖位于同一平面上。使用针束而非单根针可增加针与皮肤的接触面积，从而促进DNA的最大程度导入。</li>
</ol>
2. 大量无内毒素质粒DNA的制备
<ol>
	<li>用质粒DNA转化感受态细菌细胞。</li>
	<li>挑取单个细菌菌落，接种于3 mL含有抗生素的LB培养基中，于37 °C摇床过夜培养。</li>
	<li>将细菌培养物按1:100比例稀释至250 mL含抗生素的LB培养基中，于37 °C摇床过夜扩大培养。</li>
	<li>使用高质量、无内毒素的质粒提取试剂盒，按照制造商说明书大量制备DNA。 
	注意：Acufection实验需要高纯度和大量质粒DNA。建议使用高质量、无内毒素且经柱纯化的质粒DNA。</li>
	<li>用无菌水洗脱DNA，并分装后于-20 °C保存，直至用于Acufection。 
	注意：避免DNA反复冻融，以确保质粒DNA表达的一致性。</li>
	<li>将质粒DNA用无菌PBS稀释至1 mg/mL，用于Acufection。</li>
</ol>
3. 针刺感染操作步骤
注意：不同基因所需的最适 DNA 用量以及目标皮肤表面的面积可能有所不同，需进一步优化。刺入力度以及松解皮肤角质层的次数也可能因皮肤厚度不同而有所变化。这些条件必须在通过定量反转录 PCR 评估基因转导后基因转录本的表达水平后，谨慎确定。
<ol>
	<li>称重小鼠，并通过腹腔注射给予三溴乙醇（400 μg 每克体重）。 
	注意：2,2,2-三溴乙醇是一种曾常用于小鼠的注射用麻醉剂。溶液配制方法为将非药用级2,2,2-三溴乙醇（2.5 g）溶于含2.5% 2-甲基-2-丁醇的蒸馏水（200 mL）中。</li>
	<li>使用兽用眼科软膏涂抹眼睛，以预防麻醉期间眼睛干燥。 
	注意：麻醉效果将在1 - 2分钟内产生。手术前通过夹捏脚趾反射检查，以确认麻醉深度足够。</li>
	<li>剃除背部 flank 皮肤的毛发，并涂抹脱毛膏以溶解毛干中的角蛋白。 
	注意：使用脱毛膏去除毛发将有助于DNA向皮肤内的灌注。</li>
	<li>使用浸水的棉球擦去脱毛膏。 
	注意：脱毛膏可溶于水。彻底清除脱毛膏可避免表面油腻，确保更佳的刺破效果。</li>
	<li>使用浸有70%乙醇的无菌棉签对皮肤表面进行消毒。</li>
	<li>用预先测量好的模板在脱毛皮肤上标记目标区域（1 cm × 1 cm）。注意：标记目标部位有助于在限定区域内上下移动针束，这对于确保向特定表面积递送等量DNA至关重要，可减少实验间变异。</li>
	<li>将10 μL质粒DNA（10 μg）滴加至标记的皮肤区域。 
	注意：不同基因和表达载体类型所需的转染DNA用量有所不同。在开展目标实验前，应仔细滴定确定最佳DNA用量。10 μL液体体积较小，滴加于脱毛处理后的皮肤表面时不易滚落，便于穿刺操作。实验中应设置对照组小鼠，注射10 μL空载体DNA，以便与转染目标基因的小鼠进行比较。</li>
	<li>持针束图1B）并在标记的皮肤表面以垂直上下运动的方式穿刺100次，或持续穿刺至PBS中的DNA液体在皮肤表面的湿润痕迹消失为止。注意：皮肤表面可能出现轻微发红，应避免造成出血的深部切割。穿刺次数根据PBS（10 μL）中DNA液体在皮肤表面完全干燥的实际状况灵活确定。我们选择在30秒内穿刺100次，因为该参数在既往经acufection递送基因的实验中结果最为稳定。若条件允许，同一组针具最多可重复用于6个目标皮肤穿刺区域（每个区域1 cm × 1 cm）。每次acufection操作之间需用70%乙醇和PBS冲洗针具。当针具变钝或更换不同质粒DNA时，必须更换新针具，以防止交叉污染。</li>
	<li>将针刺处理后的小鼠置于加热垫上，保持体温直至苏醒。</li>
	<li>当小鼠恢复足够的意识后，将其放回笼中。注意：将经针刺处理的小鼠与未经针刺处理的小鼠分笼饲养（每笼少于5只）。</li>
	<li>将水瓶放回原位，并将笼盒放回独立通气笼架（IVC）中。</li>
</ol>
4. 术后护理
<ol>
	<li>手术后前48小时内，应密切观察小鼠是否出现不适症状，包括行为改变（如躁动、激动或进食障碍）或外观异常（如毛发粗糙或弓背姿势）。</li>
</ol>
5. IL-15ΔE7感染皮肤的咪喹莫特（IMQ）治疗
注意：转染后第3天可检测到目的基因的转录表达和蛋白产生。转染了目的质粒的小鼠可在转染后第3天接受不同类型刺激物的处理。本文以咪喹莫特（IMQ）乳膏处理IL-15ΔE7转染小鼠皮肤为例进行说明。IMQ是一种咪唑并喹啉胺类化合物，已被批准用于治疗外生殖器及围产期疣13。局部应用IMQ可在小鼠体内诱导出类似人类银屑病的皮肤病变，表现为皮肤脱屑、表皮增生以及真皮中性粒细胞浸润12,14,15。
注意：质粒载体包含全长小鼠 IL-15 cDNA，由延伸因子-1α（pEF）启动子调控，其两侧带有 IL-2 信号肽以及位于C末端的 FLAG 标签（pEF-IL-15，5859个碱基对），构建方法如 Bamford et al.16 所述。该质粒用作 IL-15 模板，通过重叠延伸扩增（SOE-PCR）方法删除 IL-15 基因第7外显子第33至48位残基的前16个氨基酸，从而构建 IL-15ΔE7（pEF-IL-15ΔE7，5,811个碱基对）17。成功转化 IL-15ΔE7 的细菌克隆通过限制性酶切消化验证，并进行DNA测序确认12,18。大量无内毒素质粒DNA的制备方法见本方案第2步。
<ol>
	<li>通过腹腔注射三溴乙醇（400 μg 每克体重）对电穿孔小鼠进行麻醉，并在眼睛上涂抹兽用眼科软膏，以防止麻醉期间眼睛干燥。在开始手术操作前，检查脚趾夹捏反射，以确认麻醉深度足够。注意：由于将对 2 cm × 2 cm 的皮肤区域使用咪喹莫特（IMQ），因此在两个目标位点（每个 1 cm × 1 cm）分别进行电穿孔，每次注射 pIL-15ΔE7 质粒 DNA 10 μg 溶于 10 μL PBS 中，共两剂。</li>
	<li>标记覆盖电穿孔区域的 flank 皮肤（2 cm × 2 cm）。</li>
	<li>使用棉签涂抹器将咪喹莫特乳膏局部涂抹于已标记的皮肤表面。注意：步骤 5.1 仅在首次给药时执行（60 mg/剂）。后续连续给药均在未麻醉的小鼠上进行。</li>
	<li>每天使用高清摄像机记录咪喹莫特处理后背部皮肤的变化。注意：由一人固定小鼠，另一人进行拍摄。静态图片在后期拍摄并编辑。</li>
	<li>在咪喹莫特处理后的第 4 天或第 7 天，通过注射过量三溴乙醇（800 μg 每克体重）并辅以颈椎脱臼法处死小鼠。取出皮肤并进行处理（步骤 4.1–4.5）。</li>
</ol>
6. 小鼠皮肤匀浆
<ol>
	<li>使用手术剪从尾部基部开始做一水平切口，向两侧延伸至后肢基部，然后沿体侧垂直向上剪至前肢基部。</li>
	<li>从后向前小心剥离皮肤与下方组织，用剪刀剪下背部皮肤，并将皮肤置于无菌培养皿中。</li>
	<li>使用解剖刀切除目标皮肤区域，并立即在液氮中冷冻。注意：每只小鼠所取皮肤大小保持一致，未处理组为 1 cm × 1 cm，IMQ 处理组为 2 cm × 2 cm，以尽量减少实验间差异。</li>
	<li>将冷冻的皮肤组织置于预冷的双腔研钵中央，使用研杵和铅锤将组织研磨成粉末。</li>
	<li>迅速将研磨后的组织转移至新离心管中，若用于RNA提取，则加入500 μL细胞裂解液；若用于制备蛋白裂解液，则加入50 μL PBS和1×蛋白酶抑制剂混合液。</li>
</ol>
7. H&amp;皮肤切片的#38;E染色与免疫组织化学染色
<ol>
	<li>将皮肤组织放入包埋盒中，并浸入4%多聚甲醛中固定过夜。</li>
	<li>对组织进行包埋和切片，本研究中由国立台湾大学医学院附设医院病理实验室完成。注意：切片厚度为5 μm。将组织切片置于带正电荷的载玻片上。</li>
	<li>在65&#160;°C下加热载玻片15分钟。</li>
	<li>将载玻片放入染色架中，将染色架先后浸入含二甲苯替代液的容器中，每次5分钟，共两次；随后依次浸入100%、95%、80%、75%、60%和50%乙醇溶液中（每种浓度各5分钟）以进行复水。染色前将载玻片浸入自来水中3分钟。</li>
	<li>进行苏木精-伊红（H&E）染色。注意：H &amp;#38; E染色由国立台湾大学医学院附设医院病理实验室根据要求完成。</li>
	<li>进行免疫组织化学染色时，用封闭液在室温下封闭切片5分钟，以减少非特异性背景染色。注意：该封闭液为商业制备，专用于免疫染色技术，不含任何动物血清。</li>
	<li>将载玻片浸入PBS中，以洗去封闭液。</li>
	<li>用PBS按1:10比例稀释封闭液，并加入2%胎牛血清（FBS），配制成稀释液。</li>
	<li>将适当稀释的一抗滴加至切片上，在室温下孵育60分钟。注意：一抗使用上述稀释液进行稀释。本实验中Ki67（克隆号SolA15）和Ly6G（克隆号1A8）抗体的最佳稀释比例分别为1:800和1:200，该浓度下可获得清晰染色且无背景染色。
	<ol>
		<li>在同一染色批次中，使用相同溶液但省略一抗，对一张连续切片进行染色，以对照二抗的非特异性结合。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用含0.1% Tween-20的TBS缓冲液（TBST溶液）洗涤载玻片三次，每次5分钟。每次更换新溶液。</li>
	<li>向每张切片滴加一滴标记聚合物试剂，在室温下孵育40分钟。注意：该标记聚合物为商业制备，由氨基酸聚合物与辣根过氧化物酶及二抗（经还原为Fab'片段）结合而成，可直接用于小鼠组织切片的免疫组织化学染色。</li>
	<li>用TBST溶液洗涤载玻片三次，每次5分钟。每次更换新溶液。</li>
	<li>向组织切片滴加3,3'-二氨基联苯胺四盐酸盐（DAB）溶液，室温孵育直至在明场显微镜下可见棕色沉淀。注意：在辣根过氧化物酶存在下，DAB显色时间约为30分钟。</li>
	<li>将载玻片浸入水中以终止过氧化物酶活性。将载玻片浸入甲基绿溶液中进行细胞核染色。用PBS洗涤载玻片三次，每次5分钟。</li>
	<li>在染色切片上滴加8 μL永久性封片剂，盖上盖玻片。</li>
</ol>
8. 染色组织切片的拍照与分析
<ol>
	<li>可视化 H &amp;在明场显微镜下观察苏木精-伊红（H&E）染色和免疫组化（IHC）组织切片。使用连接显微镜的电荷耦合器件（CCD）相机采集图像。进行定量分析时，可使用成像软件。
	<ol>
		<li>使用扫描仪配合20倍物镜对整张染色切片进行扫描。</li>
		<li>在表皮的1毫米节段内测量表皮厚度，并计数该节段内Ki67免疫反应阳性细胞的数量。 
		注意：定量分析使用显微镜自动化进行 &amp;#38; 图像分析软件。表皮厚度定义为基底层与表皮最外层之间的距离。</li>
		<li>计数真皮区域（230 × 270 μm）内Ly6G免疫反应阳性细胞的数量2 位于局部IMQ处理皮肤正下方的矩形区域。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无财务利益需要披露。

确保经针刺转染的质粒DNA表达的最关键步骤是均匀地振荡并松解皮肤的角质层。在轻柔推动针头而不刺破皮肤的同时，施加的力量应足以使皮肤表面下陷。为了促进10 μL溶液在1 cm × 1 cm表面积上的DNA吸收，针头应在30秒内上下振荡约100次。操作者可通过观察刺入皮肤所需的力量以及获得最佳基因表达水平所需的针刺次数，来确定合适的操作参数。
由于不同基因的表达水平可能存在差异，转染后为达到理想的表达水平，可能需要调整所用质粒DNA的用量。此外，应在实验前通过梯度实验确定质粒DNA的最佳使用量。定量RT-PCR分析结果将有助于确定质粒DNA的最佳用量以及获得可重复结果的最佳条件。
针刺转染过程的精确机制仍有待阐明。尽管外源递送的质粒DNA在剃毛和脱毛皮肤中可发生低水平的转录，但通过针灸针穿刺可显著提高转染效率（图3B）。类比纹身枪多次穿孔的微接种方案11，针刺转染递送的质粒DNA可能通过刮擦角质形成细胞和毛囊细胞膜而得以促进...

皮肤是宿主防御的第一道防线。角质形成细胞（KCs）是人类和小鼠皮肤中的主要细胞类型。在环境刺激（例如阳光、氧气、化学物质和病原体侵入）作用下，KCs被激活，并产生多种促炎性细胞因子和趋化因子，如IL-8、IL-6、IL-1α、IL-1β、TNF-α和GM-CSF1。这些因子共同作用，触发免疫细胞向皮肤募集。加重的皮肤炎症常与多种人类疾病相关，包括急性异位性接触性皮炎和慢性T细胞介导的炎症（例如变应性接触性皮炎和银屑病）2。通过抑制KC的活化来调节皮肤中的促炎反应，是治疗皮肤炎症的一种可行策略。本实验方案描述了一种在表皮中瞬时表达细胞因子基因的新方法，以研究此类处理对皮肤免疫反应的影响。
表皮构成皮肤的最表层，作为物理屏障，可阻止核酸和病原体等外来物质进入皮肤深层。目前已建立多种无针技术用于表皮DNA转导。3,4将溶液中的DNA或与阳离子脂质体或腺病毒载体结合的DNA直接应用于经处理修饰的表皮，处理方法包括去除角质层或使用脱毛试剂。去除角化的上皮层有助于DNA穿越表皮屏障，并与角质形成细胞和朗格汉斯细胞相互作用，从而诱导免疫反应5虽然该方法具有较大的DNA转递表面积且无需使用针头，但仍存在一些缺点，包括需要较大量的DNA（10–100 μg）、皮肤剥离处理较为剧烈，以及在无DNA递送增强剂的情况下，免疫动物诱导免疫反应的效果不稳定。6通过微粒介导将裸DNA递送至皮肤细胞内已被证明在诱导免疫反应方面具有高效性和可重复性7,8一种手持式基因枪已被用于通过加压氦气流，将直径为2 μm、表面包被质粒DNA的金颗粒轰击至皮肤靶部位。9质粒DNA可能被皮肤中的KC和树突状细胞（DCs）摄取，随后在局部表达蛋白，或由DCs将蛋白转运至引流淋巴结10尽管基因枪系统操作简便且所需技术经验有限，但其准备和递送的费用较高 &#34;DNA子弹&#34; (即 金粉、氦气）以及基因枪设备本身限制了其广泛应用。此外，由于需要氦气输送系统，当实验在不同地点进行时，基因枪的运输便利性也受到限制。微接种技术已被证明在基因转移效率上高于单次注射和微粒轰击法。11微接种技术使用纹身枪将DNA递送至皮肤，无需使用微粒珠11采用这种方法使微针在皮肤上振荡，可能会直接刮擦细胞膜，从而同时将DNA转移至多个细胞。然而，使用直径为0.254 mm的微针进行大量注射所引起的疼痛是一个缺点。
此处我们提供一种替代性的DNA递送方法 体内。该 &#34;acufection&#34; 本文所述的实验方案为在小鼠皮肤中递送质粒DNA提供了一种经济且高效的方法。简言之，将十根针灸针（直径0.2 mm，长度13 mm）用胶带捆扎成束。取10 μL含10 μg携带目的转基因质粒DNA的PBS溶液，滴加于经剃毛及脱毛膏处理的小鼠侧腹部皮肤表面。利用针灸针束在皮肤表面（1 cm × 1 cm区域）进行振荡操作，使角质层的角蛋白松动，从而促进滴加于表面的质粒DNA渗入表皮。经检测，皮肤损伤程度极小。通过定量实时PCR（qRT-PCR）和ELISA方法，均证实了转染基因在针灸导入区域皮肤中的表达。在咪喹莫特（IMQ）处理的小鼠模型中，验证了经针灸导入方式递送的IL-15ΔE7对皮肤炎症的免疫调节作用。12虽然电穿孔法在DNA递送方面被证明是一种简便且要求较低的方法 体内不同基因所需的最适DNA量以及皮肤穿刺时间必须经过仔细优化，以获得可重复的实验结果。

<table><tbody><tr><td>Accu Handy 针头</td><td>Accu</td><td>36Gx0.5</td><td>医疗器械</td></tr><tr><td>Nair&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt; 乳液</td><td>Church &amp;amp; Dwight</td><td>N/A</td><td>用于脱毛</td></tr><tr><td>Shandon 二甲苯替代液</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>6764506</td><td>脱石蜡</td></tr><tr><td>Avertin（2,2,2-三溴乙醇）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4,840-2</td><td>麻醉剂</td></tr><tr><td>2-甲基-2-丁醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>152463</td><td>溶解 Avertin 的溶剂</td></tr><tr><td>Difco&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt; LB 肉汤，Miller</td><td>BD</td><td>244620</td><td>用于分子生物学中 &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; 的扩增与维持</td></tr><tr><td>小鼠 IL-15/IL-15R 复合物 ELISA Ready-SET-Go 试剂盒</td><td>eBioscience</td><td>88-7215</td><td>检测 IL-15 蛋白</td></tr><tr><td>抗小鼠 Ly6G 抗体</td><td>BioLegend</td><td>127601</td><td>用于免疫组织化学染色的抗体</td></tr><tr><td>抗小鼠 Ki-67 抗体</td><td>eBioscience</td><td>14-5698-80</td><td>用于免疫组织化学染色的抗体</td></tr><tr><td>Simple Stain 小鼠 MAXPO（大鼠源）</td><td>Nichirei Biosciences</td><td>414341F</td><td>用于阻断小鼠组织上小鼠源抗体染色中的背景信号</td></tr><tr><td>DAB 过氧化物酶（HRP）底物试剂盒</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK-4100</td><td>免疫组织化学染色用过氧化物酶底物</td></tr><tr><td>Ultra V 阻断剂</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>TA-060-UB</td><td>减少非特异性背景染色</td></tr><tr><td>甲基绿</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8884</td><td>细胞核染色</td></tr><tr><td>Vecta Mount&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt;</td><td>Vector Laboratories</td><td>M-5000</td><td>永久保存组织化学染色结果</td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合片剂</td><td>Roche</td><td>04-693-116-001</td><td>抑制细胞裂解液中的蛋白酶活性</td></tr><tr><td>Aldara 乳膏</td><td>3M Pharmaceuticals</td><td>N/A</td><td>5% 咪喹莫特乳膏</td></tr><tr><td>Bessman 组织研磨器</td><td>Spectrum Labs</td><td>189475</td><td>用于粉碎皮肤组织</td></tr><tr><td>ABI7900HT 定量 PCR 仪</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N/A</td><td>实时定量 PCR 检测</td></tr><tr><td>摄像机</td><td>Panasonic</td><td>HDC-SD60</td><td>图像记录</td></tr><tr><td>Axio Scope.A1 显微镜</td><td>ZEISS</td><td>N/A</td><td>明场显微镜观察</td></tr></tbody></table>

基于“针转法”的经济型dna递送系统的开发及其在皮肤研究中的应用

Development of an Economical DNA Delivery System by "Acufection" and its Application to Skin Research

皮肤免疫反应的失调与多种人类皮肤疾病相关。将免疫相关基因直接转移至皮肤组织，是研究人类疾病小鼠模型中皮肤炎症免疫调控的一种引人注目的方法。本文介绍一种经济高效的方案，可在小鼠皮肤中递送裸DNA并实现外源基因的表达。该方法被称为 &#34;acufection&#34;，表示 acu穿刺介导的DNA转染感染. 进行基因针刺转染时，先将小鼠皮肤浸润于含DNA的磷酸盐缓冲液（PBS）中，随后用一束针灸针轻轻刺破皮肤，以促进DNA吸收并实现细胞转染。质粒DNA可能被皮肤中的角质形成细胞和树突状细胞（DCs）摄取，并表达为蛋白质。针刺造成的机械性穿刺 本身 未引起皮肤损伤或角质形成细胞活化。转染基因的表达在针刺转染后2天即可在皮肤组织中检测到，且在转录和翻译水平均可持续维持至7天。开发该针刺转染技术的主要目的是研究一种此前尚未明确的IL-15异构体。利用该方法，可在皮肤中表达一种外显子7部分缺失的IL-15选择性剪接异构体（IL-15ΔE7），随后使用Toll样受体7（TLR7）激动剂咪喹莫特（IMQ）诱导炎症反应。通过针刺转染在皮肤中递送的IL-15ΔE7可抑制IMQ诱导的皮肤炎症中角质形成细胞的增殖、表皮增厚以及中性粒细胞的募集。随着人们对皮肤炎症调控机制的研究兴趣日益增加，本文所述方案为基因枪系统或微粒轰击法进行DNA递送提供了一种经济且多功能的替代方法。 在体它可能有助于发现皮肤中一个新基因的功能，或用于研究皮肤疾病的新疗法。

尽管在使用针灸针穿刺后一小时内可见一定程度的发红，但皮肤在第2天即恢复正常，且在穿刺后至第7天未观察到任何不良皮肤反应（图2A）。与未处理皮肤相比，苏木精-伊红（H&amp;E）分析显示，针刺仅引起极轻微的表皮正角化及轻微的真皮浸润（图2B）。针刺部位皮肤与未处理皮肤的表皮厚度（图2C）以及Ki67+细胞数量（图2D）相当，表明针灸针穿刺未导致表皮明显的组织破坏或细胞增殖。与注射器针头（直径1.067 mm）12相比，使用针灸针穿刺后第2天趋化因子CXCL-1和促炎性细胞因子IL-6的表达水平降低，并在第5天持续下降（图3A）。为验证经皮转染（acufection）在小鼠皮肤中对外源基因的表达效果，将表达IL...

本方案是一种在小鼠皮肤中表达裸质粒DNA的经济有效替代方法。该方案的总体目标是将免疫相关基因递送至皮肤组织，以阐明特定基因在皮肤炎症中的功能作用。

基于“针转法”的经济型DNA递送系统的开发及其在皮肤研究中的应用

皮肤免疫反应的失调与多种人类皮肤疾病相关。将免疫相关基因直接导入皮肤组织是一种……

本实验的总体目标是将免疫相关基因递送至皮肤组织，以阐明特定基因在皮肤炎症中的功能作用。该方法有助于揭示新基因在皮肤中的功能，进而推动银屑病等皮肤疾病新疗法的开发。该技术的主要优势在于，它提供了一种经济有效的方法，可在小鼠皮肤中表达质粒DNA。准备质粒DNA时，用先前转化并筛选出的细菌菌落接种3毫升添加抗生素的LB培养基。将培养物在37摄氏度下于摇床中过夜培养。在过夜培养后，将细菌培养物稀释于250毫升LB培养基中，并添加抗生素以扩大培养。在37摄氏度下振荡培养过夜。使用高质量的无内毒素质粒提取试剂盒制备大量DNA。将获得的质粒DNA用无菌PBS稀释至终浓度为1毫克/毫升。麻醉小鼠后，将其眼睛涂抹兽用眼科软膏以防止干燥。然后剃除动物背部的毛发。使用脱毛膏溶解残留毛干中的角蛋白。脱毛后，用浸水的棉球擦去脱毛膏。用无菌棉签蘸取70%乙醇对皮肤表面进行消毒，并用预先准备好的模板标记目标皮肤区域。将含有10微克质粒DNA的10微升DNA溶液涂抹于目标皮肤区域。进行小鼠针刺时，将针刺装置垂直于皮肤，反复穿刺指定部位，持续30秒内穿刺100次，或直至涂抹于皮肤上的溶液完全吸收。为实现质粒DNA在皮肤组织中的有效表达，应注意避免刺入过深，并确保DNA溶液充分吸收。完成操作后，将小鼠置于加热垫上以维持其体温，直至从麻醉中恢复。当小鼠意识充分恢复后，将其放回笼中，并提供水和食物。在操作后的最初48小时内，需密切观察小鼠是否出现不适症状，包括行为改变或外观异常。用记号标记之前已用IL-15deltaE7处理过的、面积为2厘米×2厘米的侧腹皮肤区域。然后使用棉签将咪喹莫特乳膏局部涂抹于指定皮肤区域。为监测咪喹莫特处理后背部皮肤的每日变化，由一名研究人员进行记录，另一名研究人员则牢固固定小鼠，并将处理区域暴露于高清摄像机视野中。观察治疗部位皮肤是否出现银屑样鳞屑、斑块或红斑。按照前述方法处死小鼠后，使用血清学剪刀在尾根部做一横向切口，并沿两侧向后肢根部方向横向扩大切口。随后沿体侧做纵向切口，分别延伸至四肢根部。从动物尾部向头部方向小心剥离皮下组织上的皮肤。使用剪刀切除背部皮肤，并将获取的样本转移至无菌培养皿中。用手术刀切取适当大小的目标皮肤组织样本。然后立即在液氮中速冻。为研磨皮肤组织，将冷冻样品置于预先冷却的双室组织研磨器中央，该研磨器配有手柄和研杵，用铅锤敲击研钵以粉碎样品。立即将研磨后的组织转移至含有适用于后续分析所需试剂的新离心管中。按照文本方案中详述的步骤，将福尔马林固定石蜡包埋的皮肤切片置于65摄氏度下加热15分钟，开始染色程序。将切片浸入二甲苯中两次，每次5分钟。随后通过梯度乙醇进行脱蜡复水。最后，在染色前用自来水冲洗载玻片3分钟。进行免疫组织化学染色时，首先用防水笔在组织周围画一个圆圈，然后将切片与封闭液孵育，以消除非特异性背景染色。封闭后，用PBS冲洗载玻片。接下来，将稀释后的一抗溶液用移液器加至切片上，室温孵育60分钟。用TBST缓冲液将切片洗涤三次，每次5分钟。然后在切片上覆盖一滴标记聚合物溶液，室温孵育40分钟。随后，用 TBST 每次五分钟，洗涤载玻片三次，每次更换洗涤液。然后向组织切片上加入 100 µL DAB 溶液，在室温下反应，直至在显微镜下观察到棕色产物。然后用水洗涤切片以终止过氧化物酶活性。将切片在甲基绿溶液中复染，该溶液可特异性结合DNA，染色时间为五秒。随后将切片在PBS中洗涤三次，每次五分钟。在染色切片上滴加八微升封片介质，并盖上盖玻片。最后，按照文中的实验方案对切片进行成像。图中所示为对照小鼠，以及在拍照前分别针刺处理一小时、两天、五天或七天的小鼠。如图所示，针刺感染（acufection）操作未引起明显的皮肤损伤。此外，针刺感染对皮肤厚度或Ki67阳性细胞数量均无影响，进一步证实该操作不会导致组织破坏或表皮细胞增殖。使用qRT-PCR检测CXCL-1和IL-6的表达，结果证实了在电穿孔处理下观察到的角质形成细胞活化程度极低。另一方面，qRT-PCR和ELISA结果显示，经IL-15基因电穿孔处理的小鼠皮肤中IL-15的表达显著升高。最终，通过电穿孔将IL-15deltaE7基因递送至皮肤组织，可防止咪喹莫特处理小鼠出现皮肤脱屑和中性粒细胞浸润。若操作熟练且方法得当，该操作可在12分钟内完成。在进行该操作时，需注意每次电穿孔均应准备新的针束，并使用一批高质量的质粒DNA。在完成此操作后，可进一步采用其他方法（如病毒感染）来回答更多科学问题，例如研究新基因在调节抗病毒免疫反应中的功能。该技术的建立将为免疫学领域的研究人员探索皮肤中的免疫反应开辟道路。观看本视频后，您应能够充分掌握如何以经济有效的方式诱导质粒DNA在小鼠皮肤中表达。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

通过“Acufection”和它的皮肤研究中的应用的经济型DNA递送系统的开发

本视频方案描述了一种基于盒式结构的 体外 利用表皮角质形成细胞和去细胞化人真皮构建人类类器官皮肤的培养技术。该模型可模拟其功能与生理特性 体内...

基于支架的三维皮肤类器官培养：一种在脱细胞真皮基质上再生人类表皮的体外培养技术

该视频展示了一种通过微针针灸将编码白细胞介素-15的质粒DNA直接导入白细胞介素-15缺陷型小鼠模型皮肤组织的方法。这些微针可在皮肤最外层产生微小穿孔，促进质粒DNA被皮肤组织中的表皮细胞（包括角质形成细胞）吸收并实现转染。...

经皮穿刺介导的免疫相关基因递送至小鼠皮肤组织

皮肤纹身是一种有效且安全的DNA疫苗皮内递送方法。在此实验中，通过纹身将编码EGFP的DNA质粒递送至实验小鼠的皮肤，随后利用共聚焦显微镜检测皮肤细胞中EGFP的表达情况。...

皮肤纹身作为一种新型DNA疫苗递送方法

本研究展示了体细胞向多能性的重编程 体内 不会形成畸胎瘤。我们采用水动力尾静脉注射编码山中因子的质粒DNA来诱导 体内...

体内 通过过表达山中因子将成体体细胞重编程为多能性

本文的目的是提供一种全面且详细的方案，介绍如何利用表皮角质形成细胞和去活性的人类真皮生成基因修饰的人类类器官皮肤。...

利用去细胞化人真皮生成基因修饰的类器官皮肤培养物

通过胚胎显微注射将核酸递送至全球重要农业害虫昆虫地中海实蝇 Ceratitis capitata

本文展示了如何进行吸收性微活检技术，以及如何利用所获取的样本进行RNA提取，从而以微创的方式实现皮肤和血液的简单且同步采样。...

吸收性微活检取样与RNA提取用于微创同步血液和皮肤分析

本文介绍一种利用DNA编程黏附技术在单细胞分辨率下对细胞进行微图案化的实验方案。该方案采用台式光刻平台在玻璃载片上构建DNA寡核苷酸的图案，随后使用 commercially available...

使用DNA进行细胞简单、经济且模块化图案化的技术

本文介绍了三种禽类胚胎皮肤外植体培养的实验方案，可用于研究组织间的相互作用、4D成像延时电影（三维加时间）、分子功能的全局或局部干扰，以及系统生物学表征。...

利用禽类皮肤外植体研究组织模式形成与器官发生

本文介绍了垂直排列碳纳米纤维（VACNFs）的微加工方法、将VACNFs转移至柔性基底的技术，以及在刚性和柔性基底上将VACNFs应用于植物以实现生物分子和染料递送的方法。...

利用刚性或柔性基底上的垂直排列碳纳米纤维阵列向植物递送生物分子和染料

了解Acufection技术在小鼠皮肤中递送质粒DNA的经济型方法，用于研究免疫相关基因在皮肤炎症中的功能作用。该方法为开发银屑病等皮肤病新疗法提供了高效且低成本的基因表达平台。

基于“针转法”的经济型DNA递送系统的开发及其在皮肤研究中的应用

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