Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

该方案的总体目标是进行斑马鱼卵母细胞的体外成熟，如果需要，在受精前对母体基因产物进行功能纵。这种方法可以帮助回答发育生物学领域的关键问题，这些问题与母体对胚胎的贡献的重要性有关。该技术的主要优点是在体外培养卵母细胞，然后受精并产生有活力的胚胎。

而且，如果需要，允许对受精后立即在早期胚胎中起作用的母体基因产物进行功能作。首先，在体外培养作前 8 到 10 天，使用渔网将所需菌株的多组单雄鱼和单条雌鱼转移到交配池中。将它们放在交配池中过夜。

在第二天下午让鱼交配后，用渔网将交配期间产卵的雌性分开，并将它们放入单独的水箱中。每天两次用含有大约等量盐水虾和鱼片的食物混合物喂养这些雌性。在无菌条件下，将 20 mL 含 L-谷氨酰胺 （PH 7.0） 的 Leibovitz's L-15 培养基添加到 50 mL 锥形管中。

然后，使用 10 正常氢氧化钠使其达到 PH 9.0。将 9 mL L-15 培养基添加到两个单独的 50 mL 锥形管中。然后，标记一个管 DHP 和另一个 DHP。

在 DHP 管中，加入 10 微升 DHP、490 微升 DH2O 和 500 微升 10% BSA。在 DHP 管中，添加 100 微升每毫升 10 毫克庆大霉素、400 微升 DH2O 和 500 微升 10% BSA。为了进行卵母细胞解剖，首先在 DH2O 中制备 0.2% 三卡因原液，用一颗摩尔 tris PH 9.0 缓冲至 PH 7.0。

将此溶液保持在 4 摄氏度。在设施中的每日光照周期结束前 0 至 4 小时，在 250 毫升烧杯中，加入 20 毫升 0.2% 三卡因原液（PH 7.0）到 80 毫升鱼水中并混合。在鱼习惯的一天光照周期结束后的四个小时内开始该程序至关重要。

否则，卵母细胞将无法正常成熟。用勺子从三卡因溶液中收集安乐死的鱼，然后在鱼水中短暂冲洗。然后，将鱼放在纸巾上以吸收多余的水分。

使用干净的剃须刀片在胸鳍水平处将安乐死的鱼斩首。然后，用解剖剪刀在鱼的腹侧做一个纵向切口，从前端延伸到肛门区域。将鱼放在培养皿上，在有入射光的解剖显微镜下。

然后，使用一对解剖镊子分离卵巢部分，并将组织转移到 35 x 10 毫米的培养皿中，其中含有 4 毫升 Leibovitz 的 L-15 Meidum，DHP。现在，用解剖钳轻轻地将卵母细胞与卵泡块分离。对早期的四个卵母细胞进行分类，它们几乎处于最大大小，其特征是深色不透明的细胞质和明显可见的生发囊泡或 GV，位于卵母细胞内不对称。

丢弃早期的卵母细胞和半透明的成熟 5 期卵子。使用玻璃牧场移液器将早期的四个卵母细胞转移到第二个 35 x 10 毫米的塑料培养皿中，该培养皿含有 4 毫升 Leibovitz L-15 培养基和 DHP。将最少量的 min-DHP 培养基转移到含有 plus DHP 溶液的培养皿中。

如果注射 mRNA，在注射前，使用 RNA 级反渗透水和 0.2 摩尔氯化钾将 mRNA 稀释成 0.1 摩尔氯化钾的最终溶液。如果在注射前立即注射吗啉代或 MO，请使用 RNA 级反渗透水和 0.2 摩尔氯化钾将 MO 稀释至所需浓度，以达到 0.1 摩尔氯化钾的最终浓度。然后，进行注射时，用细镊子手动握住卵母细胞，并使用由拉动的玻璃毛细管移液管制成的针头，将大约 1 纳升注射到野生型 4 期卵母细胞中。

继续在 26.5 摄氏度的 DHP 培养基中孵育未成熟和注射的卵母细胞。大约每 30 分钟检查一次，以确保卵母细胞保持完整，并通过逐渐变得半透明来适当成熟。使用牧场移液器去除任何裂解的卵母细胞。

并将它们丢弃在实验室废烧杯中，以保持培养基的质量。根据卵母细胞裂解的量，用大约一半体积的新鲜 DHP 培养基更换培养基以保持溶液澄清。当大多数卵母细胞变得半透明并且 GV 不再明显时，使用超细镊子在卵泡膜上撕裂，在卵母细胞和膜之间空间增加的区域。

剥去一部分膜，在按住去皮部分的同时，将卵母细胞从膜中滚出。另一个关键步骤是去除滤泡膜。如果该层没有完全去除，受精和绒毛膜扩增将受到阻碍。

将最小体积培养基中的去卵母细胞转移到含有几滴培养 DHP 培养基的培养皿中，然后进行受精。在卵母细胞成熟步骤接近尾声时，在去卵泡之前，使用 5 名男性的睾丸在 500 微升 Hank 溶液中制备精子溶液。在 DHP 培养基中向脱脂卵母细胞中加入 10 至 50 微升精子溶液。

然后，等待 10 秒钟。使用移液管向卵母细胞中加入几滴 E3 培养基。等待一分钟，然后使用 E3 培养基淹没板。

让受精胚胎发育后，使用带有透射光光学元件的解剖显微镜观察卵裂阶段的进展，以确保成功受精，如前所述，受精和分期。从 GFP 的表达可以看出，来自体外培养的卵母细胞能够在短短两个小时内在整个卵母细胞发育过程中从外源 mRNA 中产生蛋白质。然而，只有在卵子发生第四阶段启动培养条件的卵母细胞才能发育成成熟的第五阶段卵母细胞。

在本实验中，注射的野生型 aurora B mRNA 挽救了其相应基因细胞岛突变的表型效应。也允许来自对照组的胚胎发育以显示相应的突变表型。注射翻译阻断吗啉可以成功表型复制已知的突变表型，如将 lrmp-MO 注射到卵母细胞中所示，它模拟了相应突变徒劳循环的突变表型。

mRNA 编码也可以注射到野生型或突变型卵母细胞中，以观察早期胚胎中的相应产物。例如，如此处所示，Sass6-mCherry 蛋白定位于由中心体标志物 Gamma 微管蛋白标记的病灶。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在大约 5 到 6 小时内完成。

在尝试此程序时，重要的是要记住不要急于进行该程序，并在去卵泡和受精之前让卵母细胞适当成熟。按照这个程序，可以执行其他方法，如固定胚胎，以回答其他问题。例如挽救您感兴趣的基因，或 RNA 或蛋白质的定位。

该技术发展后，为早期胚胎发生领域的研究人员探索母系基因产物对斑马鱼的贡献铺平了道路。观看此视频后，您应该对如何通过斑马鱼卵母细胞的体外成熟在功能上纵母体基因产物有很好的了解。