Name: 产妇基因产品的官能化操作使用体外卵母细胞成熟 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: 学习斑马鱼卵母细胞体外成熟技术，用于发育生物学研究中的母源基因产物功能操作。该方法支持在受精前对母源基因进行精准调控，助力解析早期胚胎发育的分子机制。

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我们感谢Pelegri实验室成员以及鱼类设施管理人员，他们在推动本项目进行中起到了关键作用。本项目得到了以下资助：NIH R56 GM065303 和 NIH 2 T32 GM007133 资助 E.L.W.；NIH 5 F31 GM108449-02 和 NIH 2 T32 GM007133 资助 C.C.E.；NIH RO1 GM065303 资助 F.P.。

所有斑马鱼的饲养和操作均严格遵循相关国家和/或地方动物福利机构所规定良好的动物实验规范，所有动物实验均获得相应伦理委员会批准（威斯康星大学麦迪逊分校认证编号 A3368-01）。动物在 26.5 °C 的标准条件下饲养。 
1. 雌性个体的预选
注意：成年雌性个体中的卵母细胞通常涵盖从I到V期的不同发育阶段（图2通过成功的自然交配清除雌性个体体内已有的卵母细胞，可提高卵母细胞发育阶段的同步性，因为新发育的卵母细胞会以群体形式出现3,14大约在清除后的8天内，大多数卵母细胞处于早期IV阶段，这是启动的最适时期 体外 成熟。这种同步化处理可提高能够完成整个过程的卵母细胞的产量 体外 成熟，便于实验操作。参见之前的描述13 有关成对交配鱼类的设置及鱼用水成分的详细信息（此处为14 g海盐和150 g NaHCO₃）3 每 1,000 升反渗透水中，pH 值为 6.5–8.5（推荐范围：6.8–7.5），电导率为 180–360 μS。参见 Brand 等13 有关更多配方。
<ol>
	<li>八到十天前 体外 培养操作中，使用鱼网将所需品系的单条雄鱼和单条雌鱼转移至交配缸中。可设置多组配对。将鱼留在交配缸中过夜，使其在当晚至次日下午期间进行交配。</li>
	<li>使用鱼网将交配后产卵的雌鱼分离，并放入单独的水族箱中。每天两次投喂含有等量丰年虾和鱼粮薄片的混合食物。投喂量应以可供摄食约20分钟为宜，但不应超过此时间。</li>
</ol>
2. 成熟培养基的制备
注意：在实验当天配制成熟培养基 体外 成熟实验，在取出卵母细胞后1小时内进行（见第3节）。
<ol>
	<li>在无菌条件下，向50 mL锥形管中加入20 mL含L-谷氨酰胺、pH为7.0的Leibovitz L-15培养基。用10 N NaOH调节pH至9.0。</li>
	<li>将9 mL pH为9.0的Leibovitz L-15培养基分别加入两个独立的50 mL锥形管中。将其中一管标记为&#34;+DHP&#34;，另一管标记为&#34;-DHP&#34;。</li>
	<li>在+DHP管中加入10 µL的17α-20β-二羟基-4-孕烯-3-酮（DHP）、490 µL的dH2O和500 µL的10%牛血清白蛋白（BSA）。</li>
	<li>在-DHP管中加入100 µL的10 mg/mL庆大霉素、400 µL的dH2O和500 µL的10% BSA。</li>
</ol>
3. 卵母细胞的解剖与启动 体外 培养
注意： 体外 培养实验在雌鱼通过自然交配产卵后8-10天，选取已预先筛选的雌鱼进行。使用当天配制的成熟培养基（见第2节）。若在鱼类昼夜周期接近结束时开始解剖（由养殖设施中预设的人工照明条件确定），卵母细胞可正常成熟。13，可能模拟了自然交配过程中发生的现象。这意味着，如果鱼类饲养在具有标准光照周期的设施中，该方案的大多数步骤必须在傍晚进行例如， 从下午6点开始第3.2步，实验场所的光照周期为上午8点至晚上10点，但若相应调整光照周期，也可采用其他工作时间段。
<ol>
	<li>用去离子水（dH2O）配制0.2%三卡因储备液，并用1 M Tris缓冲液（pH 9.0）调节pH至7.0，4 °C保存。该溶液可提前配制。</li>
	<li>在实验设施每日光照周期结束前0–4小时开始实验。取250 mL烧杯，加入20 mL 0.2%三卡因储备液（pH 7.0）和80 mL鱼用水，混匀。</li>
	<li>将预先挑选的雌鱼转移至三卡因溶液中，通过过量暴露实施安乐死。在鳃部运动停止后，继续将雌鱼留在三卡因溶液中15分钟。</li>
	<li>使用勺子从三卡因溶液中取出已安乐死的鱼，用鱼用水短暂冲洗，然后放置于纸巾上以吸去多余水分。</li>
	<li>使用洁净的剃须刀片在胸鳍水平处将鱼头切除。使用解剖剪在鱼体腹侧做纵向切口，从身体前段延伸至肛门区域。</li>
	<li>将鱼置于解剖显微镜下带有入射光的培养皿中。使用解剖镊子将卵巢组织转移至含有4 mL Leibovitz's L-15培养基加DHP的35 × 10 mm培养皿中。 
	注：卵巢内含有发育中的卵母细胞，在体腔内部呈现为不透明且成团块状的结构。</li>
	<li>使用解剖镊子轻轻将卵母细胞从滤泡组织中分离。挑选早期IV期卵母细胞（图2B；生发泡破裂前，接近最大体积，细胞质呈深色不透明，生发泡清晰可见且位于卵母细胞的偏心位置）。弃去更早期的卵母细胞（图2A）以及透明的成熟V期卵子（类似于图2C所示，但在DHP处理前存在于卵巢中）。 
	注：选择早期IV期卵母细胞进行体外成熟培养，因为这是在in vitro培养条件下能够发育为成熟V期卵母细胞的最早阶段（图2C和D）3。由于IV期卵母细胞正处于活跃合成产物的阶段，在此阶段进行操作可通过RNA注射实现外源产物的表达，或通过引入吗啉代寡核苷酸（MOs）降低基因功能。</li>
	<li>使用玻璃巴斯德吸管将早期IV期卵母细胞转移至另一个含有4 mL Leibovitz's L-15培养基加DHP的35 × 10 mm塑料培养皿中。尽量减少将不含DHP的培养基带入含DHP的培养皿中。</li>
</ol>
4. 卵母细胞显微注射
注意：正在进行的IV期卵母细胞分离 体外 成熟过程可通过显微注射引入用于功能操控的试剂或表达带标签蛋白。试剂（如mRNA和MOs，见第4节）的显微注射通常在卵母细胞进行时实施 体外 在去滤泡前，于含DHP的培养基中进行成熟。若需要在卵母细胞成熟前有更充足的时间进行操作，也可在成熟前于不含DHP的培养基中进行注射，并至少维持2小时，随后再转移至含DHP的培养基中。
<ol>
	<li>使用标准表达试剂盒制备mRNA。将其以100–500 pg/µL的浓度储存于-80 °C，用于注射时在RNA级水中稀释至终浓度50–500 pg/µL（推荐使用200 pg/µL）。根据制造商说明书，将MOs（吗啉代寡核苷酸）配制为4 ng/µL的水溶液，并以终浓度2 ng/µL（或根据实验确定的浓度）进行注射。 
	注：注射通常在去滤泡前于+DHP培养基中进行（见第5节中的说明）。</li>
	<li>若注射mRNA，在注射前立即用RNA级反渗水和0.2 M KCl稀释mRNA，使终溶液中KCl浓度为0.1 M。</li>
	<li>若注射MOs，在注射前立即用反渗水和0.2 M KCl将MOs稀释至所需浓度，使终溶液中KCl浓度为0.1 M。</li>
	<li>用精细镊子手动固定卵母细胞，使用拉制玻璃毛细移液管制成的针头，向野生型IV期卵母细胞中注射约1 nL溶液。
	<ol>
		<li>通过加热并拉制玻璃毛细管来制备玻璃针头，装载待注射溶液后，用镊子轻折针尖，具体操作可参考斑马鱼早期胚胎标准注射方案15。 
		注：针头应具有渐进式锥形而非突然变细的结构，这有助于灵活选择针尖断裂位置，并减少对注射胚胎的损伤。使用与胚胎注射相同的针头和溶液时，可通过预设显微注射仪的压力参数来调节注射体积。该参数可通过在显微镜载物台校准玻片（0.01 mm）上的矿物油滴中进行模拟注射确定：调整显微注射仪设置，使注入液滴的直径达到预期值，具体方法见先前文献描述15。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 卵母细胞成熟与去滤泡
注意：在卵母细胞成熟过程中，卵母细胞会逐渐变得透明，从而可以评估培养条件是否成功。
<ol>
	<li>继续将未成熟（以及适当情况下已注射的）卵母细胞在含+DHP的培养基中于26.5 °C下孵育，定期（每30分钟）观察，确保卵母细胞保持完整，并通过逐渐变得透明来正常进行成熟（见图2C）。
	<ol>
		<li>用巴斯德移液管移除任何破裂的卵母细胞，并将其丢弃至实验室废液杯中，以维持培养基的质量。根据卵母细胞裂解程度，更换约一半体积的新鲜含DHP培养基，以保持溶液澄清。</li>
		<li>静置 体外 成熟过程持续进行，直至大部分卵母细胞变得透明且生发泡不再可见（在DHP处理下约需2小时，参见 图2C 与D相比。在解剖显微镜下使用透射光光学系统观察。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>去除每个成熟卵母细胞最外层的卵泡膜。使用超细镊子在卵母细胞与卵泡膜之间间隙较大的区域将卵泡膜撕开一小口。剥开部分膜后，固定住已剥离的部分，将卵母细胞从膜中滚出。 
	注意：在此过程中，底层的绒毛膜通常会与卵子保持紧密连接；卵子激活后，其会扩展形成胚胎的保护层。</li>
	<li>将去滤泡的卵母细胞用少量培养液（通常将约5-10个成熟卵母细胞转移至不足20 µL的液滴中）移入含有数滴含DHP培养液的培养皿中，随后进行受精操作。</li>
</ol>
6. 受精作用 体外 培养的卵母细胞
注意：置于冰上的精子溶液（于下方步骤中制备）可保持其活性约 2 小时。
<ol>
	<li>在卵母细胞成熟步骤即将结束时、去滤泡之前，使用五只雄性个体的睾丸组织，在500 µL Hanks'溶液中制备精子悬液，具体方法如前所述16,17。</li>
	<li>将10–50 µL精子悬液加入去滤泡的卵母细胞中，置于含+DHP的培养基中。静置10秒。</li>
	<li>使用移液器向卵母细胞中加入数滴胚胎培养液（E3培养基）。等待1分钟后，用E3培养基充满培养皿。 
	注意：E3培养基的成分为：5 mM NaCl、0.17 mM KCl、0.33 mM CaCl2、0.33 mM MgSO4，以及1–5%亚甲蓝13。</li>
	<li>重复步骤5.3、6.2和6.3，以获得更多的受精胚胎。</li>
	<li>让受精胚胎继续发育。使用配备透射光光学系统的体视显微镜观察卵裂阶段的发育进程，以确认受精成功，具体观察方法如前所述关于受精17和胚胎分期18的描述。</li>
</ol>

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</ol>

作者无竞争性财务利益。

上述方案用于在受精前对母源基因产物进行操作，从而可研究早期斑马鱼胚胎中的母源基因产物。以往研究已能够使卵母细胞成熟 体外4；本方案已修改，以允许后续的受精过程 体外 成熟卵母细胞8这进而允许注入试剂，以实现对早期胚胎中母源遗传产物的功能性操控和可视化观察3通过该方法获得的胚胎具有存活能力，可发育为可育成体。在初步实验中，约半数受精胚胎在发育第5天仍具活力，依据为该阶段 swim bladder 的充气情况；其中约半数进一步发育为健康且具有繁殖能力的成体（未发表观察结果）。
在该实验方案中，有几个关键步骤需要考虑。如果雌鱼近期已交配，但交配时间不少于8 dpp（交配后天数），则可以获得较多处于合适发育阶段（早期IV期）并能启动成熟的卵母细胞。使用近期未交配的鱼可能导致卵子退化14，从而无法完成成熟过程。交配不足8天的雌鱼，其卵子大多处于III期或更早阶段，因此在体外无法正常成熟。in vitro。而在交配后第8天的雌鱼卵巢中，处于早期IV期的卵母细胞比例最佳。这些卵母细胞可通过其不透明的外观以及生发泡（GV）位于偏心位置来识别（图2B）。卵母细胞的分期也可借助尺寸测量辅助判断：将卵母细胞置于显微镜下的带刻度微米载玻片上，并参照标准分期指南进行比较（表1）。然而，早期IV期卵母细胞的大小已接近成熟卵母细胞的最大尺寸（成熟卵母细胞表现为相对透明且无生发泡；图2C），结合上述形态特征通常可轻易识别，因此一般无需进行卵母细胞的直接尺寸测量。
体外 成熟过程必须在雌性卵母细胞供体所适应的光周期结束后的数小时内开始。若在光周期的早晨时段进行培养，卵母细胞将无法正常成熟，表现为受精率低下。这种昼夜节律依赖性的原因在于 体外 卵母细胞成熟方法的机制尚不明确，但可能反映了潜在的昼夜节律偏好 体内 卵子发生过程中伴随基因表达周期性变化的卵母细胞成熟21卵母细胞无法成功进行成熟或受精的常见原因 体外 尽管卵母细胞分期正确，但卵母细胞成熟失败的一个可能原因是DHP已过期。DHP激素通常在一年后失效，为确保有效的成熟效果，工作批次应在使用9个月内更换。
当实验目的为功能性操控母源产物时，卵母细胞注射是另一个关键步骤。该操作的要求不同于受精后0-30分钟（mpf）受精卵的标准注射。卵母细胞注射的一个关键因素是必须在不会引起卵子过早激活的条件下进行注射，例如使用Leibovitz's L-15培养基22,23。由于卵母细胞嵌于卵巢组织中，其注射本身也带来特殊挑战。上述方案建议首先将卵母细胞从卵巢中分离，然后用镊子单独夹持每个分离后的卵母细胞进行注射。该技术效果良好，可在最小操作的前提下预先筛选处于合适发育阶段的卵母细胞。也可采用其他替代方法，例如：i）将卵母细胞置于标准注射用琼脂糖槽中15，槽的垂直壁可在注射过程中支撑卵母细胞（在此替代方法中，需将卵母细胞转移至注射板，并始终保持在体外成熟（in vitro maturation）培养基中）；ii）使卵母细胞仍附着于卵巢组织上，在注射时用镊子夹持卵巢组织以避免接触已注射的卵母细胞（在此方法中，注射后需将卵母细胞分离，以便于后续DHP处理，并利于去滤泡化，后者对体外受精（IVF）至关重要）。尽管存在这些特殊挑战，IV期卵母细胞仍可轻易被注射针穿透，这可能是因为此阶段的绒毛膜尚未完全发育9。
当前成熟方案的一个局限性在于 体外 卵母细胞成熟启动时间早于IV期时，无法创造促进卵母细胞正常发育的成熟条件。卵母细胞在达到520 µm直径时，即进入III期（卵黄发生期，对应340至690 µm范围），才具备对DHP产生反应并启动成熟的能力。9然而，III期卵母细胞的培养所获得的卵母细胞不具备受精能力3仅选择那些卵母细胞 体外 培养从第 IV 阶段开始（图2B）可发育为成熟的第V期卵母细胞（图 2C 和 D这可能与以下事实有关：III期对卵黄发生和卵母细胞生长至关重要9因此， 体外 本文所述的卵母细胞成熟程序仅适用于起始群体为IV期卵母细胞（B），不适用于较早期阶段的卵母细胞（I–III期）； 图e 2A）。出于相同原因，该操作仅限于在第四阶段或更晚时期表达的基因。对于其产物在更早时期表达的基因，其功能操控可能仍需依赖遗传学方法（见下文）。对 体外 培养成熟技术未来可能允许在更早阶段启动卵母细胞培养，从而增强该方法的效能 体外 成熟化方法
该方法的另一个局限性在于，去滤泡化是后续受精步骤所必需的操作，但目前仍是整个流程中的限速步骤。滤泡膜是一层包裹在发育中卵母细胞周围的透明结构，其去除过程较为繁琐。若此膜未被完全清除，卵子将无法充分激活并完成受精。这一点可通过受精后卵膜未能正常扩张，以及胚胎出现位置不规则的沟状结构（假性卵裂）得以证实，这些特征是未受精胚胎的典型表现。11酶解去卵泡法，例如使用胶原酶的方法，如在 非洲爪蟾，已尝试过。然而，据我们经验，该技术并未成功，因此我们依赖于手工去卵泡。由于手工去卵泡费力且耗时，难以在之后获得大量受精卵 体外 卵母细胞成熟。由于人工去卵泡操作存在时间上的限制，目前我们每次仅对少量去卵泡的成熟卵细胞进行受精，每批约5–10个卵细胞。若在该流程中引入酶法去卵泡，可能会显著提高其产量和整体操作的便捷性。
尽管在受精后产生的胚胎 体外-成熟的卵母细胞可发育为可存活的成体，我们注意到在 体外 受精后，部分胚胎无法正常或及时分裂。我们目前正在筛选那些繁殖过程中包含多轮传代的品系 体外 卵母细胞成熟，这可能导致通过该方法获得的胚胎发育模式更为稳健。
该实验步骤已成功实现对多种突变体蛋白定位的清晰挽救或可视化观察24,25然而，对于某些基因而言，其产物表达的调控可能至关重要，因此通过注射mRNA所表达的产物可能导致结果出现变异26。同样重要的是要注意所有的对照组（例如， 注射了与实验所用试剂性质相似但预计不会产生效应的试剂的胚胎，例如对照吗啉代寡核苷酸（control MOs）或仅编码惰性蛋白（如GFP）的RNA，因为潜在的变异性可能导致错误结论。
一种涉及 体外 操作后受精在母源沉积产物的研究中尤为有用，因为将RNA、吗啉寡核苷酸（MOs）或蛋白质注射到已受精卵中的常规方法，可能无法有效降低卵内已积累的产物水平。其他新近发展的方法，如CRISPR介导的突变体构建，也可有效实现母源表达基因的突变条件。26然而，该方法需要培育多代鱼类。 体外 卵母细胞成熟技术可实现快速的功能操控，用于研究母源表达基因的功能，包括母源效应突变的挽救与表型模拟，以及早期胚胎中RNA和蛋白质的表达。

在动物发育过程中，母体会将基因产物（例如 RNA、蛋白质及其他生物分子）沉积到卵细胞中；这些产物对于受精后立即发生的早期细胞过程至关重要1,2。当采用常规方法将试剂注射到已受精的卵细胞中时，通常难以有效操控母源产物的表达与功能3。这是因为大多数RNA和蛋白质是在卵子发生过程中由卵母细胞产生的，因此在成熟卵细胞中已经存在预先加载的母源产物。这些预先存在的产物对基因靶向试剂（如吗啉代反义寡核苷酸，MOs）介导的功能敲低具有抗性，因为MOs作用于mRNA，而无法影响受精时卵细胞中已存在的蛋白质。此外，许多早期胚胎过程在受精后迅速发生，以至于通过向受精卵注射RNA所产生的蛋白质产物来不及发挥作用，因为RNA翻译生成蛋白质的速度可能不足以影响胚胎发育的最初事件。出于同样原因，通过向受精卵注射mRNA表达的带标签蛋白融合体，也可能无法及时生成，因而难以在早期胚胎中其发挥活性作用时进行可视化观察。虽然可在卵细胞激活前对排出的成熟卵母细胞进行注射，但该方法也面临类似的技术难题：此类成熟卵细胞中已预先加载了母源蛋白质，并且在卵细胞激活之前不会进入翻译活跃状态（即 无法由外源转录本产生蛋白质）。因此，针对在早期胚胎发育中起作用的母源基因产物的操控，通常需要在卵母细胞成熟过程中的卵子发生阶段进行。
作为克服这些障碍的一种方法， 体外 成熟化方法已建立，可使斑马鱼的卵母细胞从IV期发育至卵子形成。早期方法允许 体外 成熟，但所产生的成熟卵子不具备受精能力4随后，将培养条件从中性调整至pH 9.0，以模拟鱼类物种卵巢液中的碱性pH环境5,6，实现了可靠的 体外 体外受精（IVF）后 体外 成熟7,8确实， 体外-成熟的卵母细胞可产生能够存活至成年且具有生育能力的可存活胚胎3,8该改进方法已进一步优化，可用于对母源基因进行功能操控、通过外源表达在斑马鱼卵子发生过程中表达带标签的蛋白质，以及在成熟期IV卵母细胞中通过吗啉代寡核苷酸（MO）介导的功能性基因敲低。3 (图1).
斑马鱼的卵子发生过程包含多个特征性阶段，最终形成成熟的卵母细胞9（参见表1以快速了解卵子发生的各个阶段）。简而言之，卵母细胞发育始于I期卵母细胞，并在减数第一次分裂前期的双线期发生停滞。这些卵母细胞通过活跃的转录（在IA和IB期启动）、皮层泡（也称为皮层颗粒，于II期启动）的形成以及卵黄发生（在III期启动）而生长。卵母细胞的生长在IV期完成，此时减数第一次分裂恢复，导致卵母细胞核（即生发泡，GV）解体。随后，减数分裂再次停滞于减数第二次分裂中期。IV期卵母细胞生长的完成及减数分裂的停滞，最终形成成熟的V期卵子9。滤泡膜的去除发生在卵母细胞释放至卵巢腔的过程中10，这对受精和卵子的正常激活至关重要。一旦卵子在自然交配过程中从母体排出，即被激活。在斑马鱼中，仅接触水就足以引发卵子的完全激活，无论是否存在精子11。
体外 目前的条件允许从早期IV阶段的卵母细胞发育成熟——该阶段卵母细胞可通过其大小（690–730 µm）、具有一个位于偏心位置的大生发泡（GV），以及由于卵黄蛋白积累而呈现完全不透明的外观来识别。图2B）至成熟阶段V的卵母细胞，其特征是核膜完全解体，且由于卵黄蛋白的加工而呈现半透明外观12 (图 2C）。在此方法中，从雌性个体中取出包含处于不同发育阶段卵母细胞的完整卵巢。在17α-20β-二羟基-4-孕烯-3-酮（DHP）作用下，促使卵母细胞发育，DHP是一种有效的诱导成熟激素。8在此期间，可通过显微注射表达载体对成熟中的卵母细胞进行操作例如， 封口的， 体外-转录的mRNA）或反向遗传学试剂（例如， MOs）。卵泡层不会在成熟期结束时自发脱落，因此必须手动去除。去卵泡层后， 体外 通过将卵子暴露于水（存在于胚胎发育E3培养基中）以诱导卵子激活，从而实现受精13 以及精子溶液。所获得的受精卵将进行胚胎发育，可用于评估处理方法对母源基因功能的调控能力，并实现对标记的母源产物的可视化与分析。图3).

<table><tbody><tr><td>斑马鱼交配盒</td><td>Aqua Schwarz</td><td>SpawningBox1</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma</td><td>63138</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Western Chemical</td><td>Tricaine-D (MS 222)</td><td>FDA 批准（ANADA 200-226）</td></tr><tr><td>Tris 碱</td><td>Sigma</td><td>77-86-1</td><td>用于配制 1 M Tris pH 9.0</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma</td><td>920-1</td><td>用于配制 1 M Tris pH 9.0</td></tr><tr><td>细网鱼网（4 - 5 英寸）</td><td>PennPlax</td><td>（ThatFishThatPlace # 212370）</td><td>可在 ThatFishThatPlace 购买</td></tr><tr><td>塑料勺</td><td></td><td></td><td>大多数普通商店均有售</td></tr><tr><td>解剖剪</td><td>Fine Science Tools</td><td>14091-09</td><td></td></tr><tr><td>解剖镊</td><td>Dumont</td><td>SS</td><td>可从 Fine Science Tools 购买</td></tr><tr><td>体视显微镜（带透射光源）</td><td>Nikon</td><td>SMZ645</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>反射光源（LED 臂）</td><td>Fostec</td><td>KL1600 LED</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>直径 10 cm 的培养皿</td><td></td><td></td><td>任意厂家</td></tr><tr><td>1.5 mL 离心管</td><td></td><td></td><td>任意厂家</td></tr><tr><td>冰桶</td><td></td><td></td><td>任意厂家</td></tr><tr><td>窄型刮刀</td><td>Fisher</td><td>14-374</td><td></td></tr><tr><td>凹面玻璃载片</td><td>Corning Inc</td><td>722085（Fisher 货号 13-748B）</td><td>可从 Fisher Scientific 购买</td></tr><tr><td>纸巾</td><td></td><td></td><td>任意厂家</td></tr><tr><td>Kimwipes 擦镜纸</td><td>Kimberly-Clark</td><td>06-666-11</td><td>可从 Fisher Scientific 购买</td></tr><tr><td>计时器秒表</td><td></td><td></td><td>任意厂家</td></tr><tr><td>洗瓶</td><td>Thermo Scientific</td><td>24020500</td><td>可从 Fisher Scientific 购买</td></tr><tr><td>250 mL 烧杯（2 个）</td><td>Corning Inc.</td><td>1000250</td><td>可从 Fisher Scientific 购买</td></tr><tr><td>Leibovitz's L-15 培养基</td><td>Thermofisher</td><td>11415064</td><td></td></tr><tr><td>NaOH&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>221465</td><td>用于调节 pH</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2058</td><td></td></tr><tr><td>17α-20β-二羟基-4-孕烯-3-酮（DHP）</td><td>Sigma</td><td>P6285</td><td></td></tr><tr><td>庆大霉素</td><td>Sigma</td><td>G1272</td><td></td></tr><tr><td>显微注射装置</td><td>Eppendorf</td><td>FemtoJet</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>注射针毛细管</td><td>FHC</td><td>30-30-1</td><td>或同等产品，硼硅酸盐材质，外径 1.0 mm × 内径 0.5 mm，含纤维，长度 100 mm</td></tr><tr><td>拉针仪</td><td>Sutter Instruments</td><td>Model P-87</td><td>任意厂家</td></tr><tr><td>移液器（1 - 20 &amp;micro;L 量程），带吸头</td><td></td><td></td><td>任意厂家</td></tr><tr><td>移液器（20 - 200 &amp;micro;L 量程），带吸头</td><td></td><td></td><td>任意厂家</td></tr><tr><td>移液器（100 - 1000 &amp;micro;L 量程），带吸头</td><td></td><td></td><td>任意厂家</td></tr><tr><td>15 mL 锥形离心管</td><td></td><td></td><td>任意厂家</td></tr><tr><td>50 mL 锥形离心管</td><td></td><td></td><td>任意厂家</td></tr><tr><td>带橡胶球的 10 mL 塑料移液管</td><td></td><td></td><td>任意厂家</td></tr><tr><td>带橡胶球的 20 mL 塑料移液管</td><td></td><td></td><td>任意厂家</td></tr><tr><td>显微镜载物台校准片（0.01 mm）</td><td>AmScope</td><td>MR095</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>养鱼用水试剂：</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Instant Ocean 海盐</td><td>Drs. Foster &amp; Smith</td><td>&amp;nbsp;CD-116528</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠（细胞培养级）</td><td>Sigma</td><td>S5761-1KG</td><td></td></tr><tr><td>E3 培养基试剂：</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S5886-1KG</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405-500G</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;，二水合物</td><td>Sigma</td><td>C7902-500G</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;，七水合物</td><td>Sigma</td><td>63138-250G</td><td></td></tr><tr><td>亚甲蓝</td><td>Sigma</td><td>M9140-25G</td><td></td></tr><tr><td>鱼饲料：</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>冷冻卤虫</td><td>Brine Shrimp Direct</td><td>FBSFKG50</td><td></td></tr><tr><td>Tetramin 薄片饲料</td><td>Drs. Foster &amp; Smith</td><td>16623</td><td></td></tr></tbody></table>

利用功能操作母源基因产物 体外 斑马鱼卵母细胞成熟

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

动物胚胎发育最早阶段发生的细胞事件由母源性基因产物驱动，这些产物在卵母细胞发育过程中被沉积到其中。由于这些事件依赖于母源性产物，而这些产物通常在受精后很快发挥作用——且在受精前已存在于卵细胞内，因此涉及向受精卵注射试剂以实现基因表达或功能下调的标准方法通常无效。相反，此类操作必须在卵子发生期间、即在母源性产物积累之前或期间进行。本文详细描述了一种用于 体外 未成熟斑马鱼卵母细胞的成熟及其后续过程 体外 受精，产生可存活至成体的 viable 胚胎。该方法可在卵子发生过程中对母源产物进行功能操控，例如表达产物以实现表型拯救和标记构建体的可视化，以及通过反向遗传学工具降低基因功能。

为了确定上述操作是否成功，可在卵裂阶段观察胚胎，以确认是否出现典型的早期胚胎卵裂模式18，并在受精后24小时（hpf）观察，以确认基本体轴结构的正常发育。该方法可在卵母细胞发育期间通过注射试剂（如mRNA和MO）来操控母源产物，从而实现功能研究。
母源产物的功能研究操作：
编码野生型和突变型产物的 mRNA 可注射到 体外 成熟卵母细胞，以检测减数分裂及早期胚胎发育阶段母源基因功能操作的影响。例如，可向野生型胚胎中注射野生型mRNA，以检测产物过表达的效应，或注射突变RNA，以检测潜在的显性（例如， 功能获得性和反式显性）效应在这些过程中的作用。卵母细胞中的 体外 培养的卵母细胞在整个卵子发生过程中均能利用外源mRNA合成蛋白质，这一点已通过注射mRNA后绿色荧光蛋白（GFP）的表达得到证实；然而，只有在卵子发生第IV阶段开始培养的卵母细胞才能发育至成熟的第V阶段卵母细胞（图2B-2D，另见 Nair 等3）。通过注射mRNA表达野生型产物，对于拯救母体效应突变以在定位克隆过程中验证基因身份也具有重要作用3,24在此情况下，将野生型 mRNA 注射到纯合突变型雌性的卵母细胞中，以检测野生型产物是否能够挽救突变表型。该遗传学挽救示意图如下所示 图 3A-3C，其中注射 AurB mRNA 被证明可挽救其对应基因突变所导致的表型效应， 细胞岛 (cei) (图3A-3C）。对照组的胚胎也被允许继续发育，以展示相应的突变表型。3也可将突变RNA注入突变型卵母细胞，通过比较其与野生型产物引起的拯救程度，检测突变产物是否保留部分功能。
从mRNA注射到发育中的卵母细胞后，蛋白质表达似乎几乎没有延迟。无论卵母细胞处于何种发育阶段，注射相应的mRNA后2小时内即可观察到强烈的GFP表达。3 (图2B-2D；另见 Nair 等3）。mCherry:Sas6 和 Birc5b(Motley):GFP 等产物可在受精后立即观察到，并持续存在于第一次胚胎细胞周期中3,25在卵子发生过程中注射 mRNA 也会产生蛋白质，这种蛋白质无论是否融合了标签基团，均能在受精后立即发挥功能，这一点已在母源产物的研究中得到证实 细胞岛/aurB3, 无效循环/LRMP24, 和 motley/bir5b25翻译阻断型吗啉寡聚物（MOs）在受精后立即产生效应，如futile cycle/Lrmp所示3 胚胎发育的后期阶段，例如 mission impossible/dhx163在发育中的卵母细胞中注射剪接阻断型吗啉代寡核苷酸（splice-blocking MOs）可能不会影响母源功能，这可能是由于IV期卵母细胞中已存在成熟的母源转录本3.
形态缺陷体的制备：
当使用针对已知突变基因的吗啉代寡核苷酸（MO）时，预期所得到的形态异常表型将模拟该基因突变体的表型。将形态异常胚胎与未注射的胚胎以及注射了标准对照吗啉代寡核苷酸的胚胎进行比较。注射翻译阻断型吗啉代寡核苷酸可成功模拟已知的突变体表型。3，如将 Lrmp MO 注入卵母细胞后所表现出的表型与相应突变的突变表型相似所示， 无效循环 （图3D-F）。MO特异性的验证可通过与胚胎注射MO时相同的方法进行（前文已综述）。19,20.
荧光标记融合蛋白的表达：
编码目的基因产物与荧光蛋白融合的mRNA例如， GFP 和 mCherry 也可注射到野生型或突变型卵母细胞中，以在早期胚胎内观察相应产物即， 反映亚细胞定位模式； 图3G 和 3H）。可类似地表达编码包含突变等位基因的相似融合蛋白的mRNA，以检测该突变是否影响潜在的亚细胞定位。
<img alt="斑马鱼体外受精过程；卵母细胞准备、注射及发育示意图" src="/files/ftp_upload/55213/55213fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1： 体外 卵母细胞成熟 示意图显示了所涉及的各个步骤 体外 卵母细胞成熟。在操作前8天预先筛选成年雌性个体，以清除其体内已成熟的卵子，并促进新的卵母细胞发育。从雌性个体中取出含有发育中卵母细胞的卵巢，转移至含有激素DHP的培养液中，以诱导卵母细胞成熟 体外卵母细胞从雌性个体中取出后，在成熟前或成熟过程中可立即注射RNA产物及其他试剂，以功能性操控母源因子。成熟的卵母细胞经人工去滤泡后进行受精。 体外 与精子溶液混合，以获得受精且具有活力的胚胎。 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55213/55213fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="细胞发育阶段 I-V，显微镜图像；突出显示分化过程，比例尺，样本设三个重复。" src="/files/ftp_upload/55213/55213fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2： 体外 卵母细胞成熟及注射mRNA后产物的表达 (A) 从排空后第4天（dpp）的雌性个体卵巢中观察到的I-III期卵母细胞。B）8日龄雌性个体卵巢中观察到的第IV期卵母细胞。生发泡（GV，箭头所示）清晰可见，位于偏心位置。（第III期卵母细胞见于（A）也表现出明显可见的生发泡（GV），但其位于卵母细胞中央。（IV期卵母细胞在（B）的大小与（中成熟卵母细胞的大小相比已接近最大C). (C 和 DV期卵母细胞（成熟卵母细胞）在2小时后 体外 在阶段IV开始成熟条件，如（B）所示，并在成熟过程中注射编码GFP的物质， 体外 转录的mRNA（C，仅可见光；D，可见光与GFP荧光叠加）。在V期卵母细胞中，生发泡已不再明显，且V期卵母细胞的不透明度也低于IV期卵母细胞。注射后的卵母细胞表达GFP蛋白（D）。成熟IV期卵母细胞的去滤泡过程详见实验方案部分。比例尺 = 300 µm所有图示均经许可，转载自 Nair 等3. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55213/55213fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="基因编辑实验结果；β-catenin、α-tubulin 染色；荧光显微镜观察" src="/files/ftp_upload/55213/55213fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：通过操控与可视化母源产物 体外 卵母细胞成熟 (A-C) 突变导致的母体效应表型的挽救 细胞岛/aurora B 通过野生型的注射 aurB mRNA 注入至 IV 期卵母细胞 cei/aurB 卵母细胞。合并图像显示了65 mpf固定胚盘的动物极视图，使用抗-ß-连环蛋白抗体标记细胞膜（绿色），抗-α-微管蛋白抗体标记微管（红色），以及DAPI标记DNA（蓝色）。A) 野生型胚胎中β-catenin的积累，表明合胞体胚层沟正常成熟。BA cei/aurB 未注射的胚胎 cei/aurB IV期卵母细胞显示出部分且初级的沟槽，但这些沟槽不积累β-catenin。C) 一种被挽救的 cei/aurB 胚胎来自一个 cei/aurB 注射了野生型的卵母细胞 aurB mRNA 显示在沟槽处有显著的 β-catenin 积累。D-F) 由母体效应基因突变引起的表型模拟 无效循环/LRMP 从Lrmp吗啉代寡核苷酸注射到IV期卵母细胞后的结果。合并图像显示了70 mpf固定胚盘的动物极视图，使用抗γ-微管蛋白抗体标记中心体（红色），DAPI标记DNA（蓝色）。D在野生型胚胎中，每个细胞核都与γ-微管蛋白（γ-tubulin）相关联，后者是中心粒周围物质的标记物。E) 在母体效应中 fue 突变体中，原核融合失败，导致出现两到三个DNA标记区域，分别对应未融合的亲本原核以及第二次减数分裂的极体。F在Lrmp形态发生素抑制的胚胎中，母源Lrmp功能受到抑制，细胞核同样无法分裂，并且不能与γ-微管蛋白结合。G 和 H) 观察早期胚胎中母源性产物的分布。将外源性 mRNA 注射至 IV 期卵母细胞后，表达的 Sass6-mCherry 蛋白定位于中心粒。合并图像显示受精后 40 分钟固定胚盘的动物极视角，经抗 γ-微管蛋白抗体染色以标记中心体（绿色），mCherry 荧光指示 Sass6 位置（红色），DAPI 标记 DNA（蓝色）。G表达的Sass6-mCherry蛋白定位于核周区域被中心体标志物γ-微管蛋白标记的焦点处（箭头所示）。H同一图像，仅显示Sass6-mCherry和DAPI以增强清晰度。(G和H)中的胚胎为固定样本，但表达产物（如mCherry融合蛋白）的荧光信号也可在活体胚胎中观察到（未展示）。比例尺 = 100 µm 在 A-F 和 10 µm 在G和H中。所有图示均已获Nair许可转载 等3. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55213/55213fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>卵子发生阶段</td>
			<td>卵母细胞直径 (μm)</td>
			<td>关键特征</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1A - 前滤泡期</td>
			<td>7 到 20</td>
			<td>转录活性启动，核仁积累</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1B - 滤泡期</td>
			<td>20 到 140</td>
			<td>染色体去凝集</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>II - 皮质颗粒期</td>
			<td>140 到 340</td>
			<td>皮质颗粒生成</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>III - 卵黄发生期</td>
			<td>340 到 690</td>
			<td>卵质因卵黄前体蛋白和脂质积累而变暗</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>早期 IV - 卵母细胞成熟期</td>
			<td>690 到 730（较低范围）</td>
			<td>生发泡不对称定位</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>早期 IV - 卵母细胞成熟期</td>
			<td>690 到 730（较高范围）</td>
			<td>生发泡消失，停滞于减数第二次分裂中期</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V - 成熟卵母细胞</td>
			<td>~750</td>
			<td>卵质/卵黄变为半透明</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：斑马鱼卵母细胞发育的标志事件。

一种优化的方案 体外 本文介绍了用于操控母源基因产物的斑马鱼卵母细胞的成熟过程。

动物胚胎发育最早阶段发生的细胞事件由母源性基因产物驱动，这些产物在卵子发生过程中被沉积到卵细胞中……

本实验方案的总体目标是在体外培养斑马鱼卵母细胞，并在受精前根据需要对母源基因产物进行功能性操控。该方法有助于解答发育生物学领域中关于母源物质对胚胎发育重要性的关键问题。该技术的主要优势在于能够对卵母细胞进行体外培养，随后完成受精并产生具有活力的胚胎。此外，如有需要，还可对在受精后早期胚胎中起作用的母源基因产物进行功能上的操控。开始实验前8至10天，使用渔网将多对所需品系的单条雄鱼与单条雌鱼转移至交配缸中，置于交配缸内过夜。在让鱼类交配至次日下午后，使用渔网将产卵的雌鱼分离，并将其放入单独的水族箱中。每天两次喂食含有等量丰年虾和鱼粮薄片的混合饲料。在无菌条件下，向50毫升锥形管中加入20毫升含L-谷氨酰胺、pH值为7.0的Leibovitz's L-15培养基。然后，使用10 N氢氧化钠将其调节至pH 9.0。将9毫升L-15培养基分别加入两个50毫升锥形管中。随后，将其中一个管标记为DHP，另一个管也标记为DHP。在 DHP 管中，加入 10 微升 DHP、490 微升 DH2O 和 500 微升 10% BSA。在 DHP 管中，加入 100 微升 10 毫克/毫升的庆大霉素、400 微升 DH2O 和 500 微升 10% BSA。为进行卵母细胞解剖，首先在 DH2O 中配制 0.2% 三卡因储备液，并用 1 摩尔 Tris（pH 9.0）缓冲至 pH 7.0。将此溶液保存在 4 摄氏度。在实验设施每日光照周期结束前 0 至 4 小时内，于 250 毫升烧杯中加入 20 毫升 0.2% 三卡因储备液（pH 7.0）至 80 毫升鱼用水中，并混匀。必须在鱼类适应的光照周期结束后的四小时内启动该操作，这一点至关重要。否则卵母细胞将无法正常成熟。使用勺子从三卡因溶液中取出已处死的鱼，并用鱼用水短暂冲洗。然后将鱼放在纸巾上以吸去多余水分。使用洁净的剃须刀片在胸鳍水平处切断已处死的鱼的头部。然后用解剖剪在鱼体腹侧从前端向肛门区域做一纵向切口。将鱼置于培养皿中，并在具有透射光的解剖显微镜下观察。然后，使用一对解剖镊子分离卵巢组织，并将组织转移至一个直径为35毫米、高度为10毫米的培养皿中，该培养皿内含有4毫升Leibovitz's L-15 Medium, DHP。接着，用解剖镊子轻轻地将卵母细胞从滤泡组织中分离。挑选处于早期第4阶段的卵母细胞，这些卵母细胞接近最大体积，其特征为细胞质呈深色不透明，且在卵母细胞内可明显观察到偏心位置的生发泡（germinal vesicle, GV）。弃去较早阶段的卵母细胞以及透明的成熟第5阶段卵子。使用玻璃巴斯德吸管将早期第4阶段的卵母细胞转移至另一个35 mm × 10 mm的塑料培养皿中，该培养皿内含有4 mL Leibovitz's L-15培养基及DHP。尽量减少将不含DHP的培养基转移至含有DHP溶液的培养皿中。若注射 mRNA，在注射前立即使用 RNA 级反渗透水和 0.2 摩尔氯化钾将 mRNA 稀释至终浓度为 0.1 摩尔氯化钾的溶液。若注射 Morpholino 寡核苷酸（MO），在注射前立即使用 RNA 级反渗透水和 0.2 摩尔氯化钾将 MO 稀释至所需浓度，使终浓度为 0.1 摩尔氯化钾。随后，用精细镊子手动固定卵母细胞，使用拉制的玻璃毛细移液管制成的针头，向野生型四期卵母细胞中注射约 1 纳升溶液。将未成熟且已注射的卵母细胞继续在 DHP 培养基中于 26.5 摄氏度下孵育。每隔约 30 分钟检查一次，确保卵母细胞保持完整，并通过逐渐变得半透明来正常成熟。使用巴斯德吸管移除发生裂解的卵母细胞。然后将其丢弃至实验室废液杯中，以保持培养基的质量。根据卵母细胞裂解的程度，用大约一半体积的新鲜 DHP 培养基更换培养液，以维持溶液澄清。当大部分卵母细胞变得透明，且生发泡（GV）不再明显时，使用超细镊子在卵母细胞与滤泡膜之间间隙较大的区域撕开滤泡膜。剥离部分膜层，同时按住已剥离的部分，将卵母细胞从膜中滚出。另一个关键步骤是去除卵泡膜。如果该层未完全去除，将会影响受精及绒毛膜的扩张。将去滤泡的卵母细胞用少量培养基转移至含有数滴DHP培养液的培养皿中，并立即进行受精。在卵母细胞成熟步骤即将结束时、去滤泡前，取五条雄鱼的精巢，用500 µL Hank's溶液制备精子悬液。向含有去滤泡卵母细胞的DHP培养液中加入10至50 µL精子悬液。然后，等待10秒。使用移液器向卵母细胞中加入几滴E3培养基。等待1分钟后，用E3培养基浸没培养板。在让受精胚胎发育一段时间后，使用配备透射光光学系统的体视显微镜观察卵裂阶段的发育进程，以确认受精成功，具体方法如前所述的受精与胚胎分期操作。通过GFP的表达可见，体外培养的卵母细胞在卵母细胞发育过程中，仅需两小时即可从外源mRNA合成蛋白质。然而，只有在卵子发生第四阶段开始培养条件的卵母细胞，才能发育为成熟的第五阶段卵母细胞。在本实验中，注射野生型aurora B mRNA可挽救其对应基因cellular island突变所引起的表型效应。对照组的胚胎也被允许发育，以展示相应的突变表型。通过注射翻译阻断型Morpholino可成功模拟已知的突变表型，例如将lrmp-MO注射到卵母细胞中，可模拟对应突变futile cycle的突变表型。也可将编码mRNA注射到野生型或突变型卵母细胞中，以在早期胚胎内观察其相应的表达产物。例如，如图所示，Sass6-mCherry蛋白定位于由中心体标记物Gamma tubulin标记的焦点结构。一旦掌握该技术，若操作得当，整个过程可在大约5至6小时内完成。在进行该操作时，重要的是要注意不要急于完成步骤，应在去卵泡和受精前确保卵母细胞充分成熟。完成该操作后，可进一步采用其他方法，例如胚胎固定，以回答更多科学问题，比如目的基因的功能挽救，或RNA及蛋白质的定位分析。该技术建立后，为早期胚胎发生领域研究人员探索母源基因产物在斑马鱼中的作用铺平了道路。观看本视频后，您应能够充分理解如何通过斑马鱼卵母细胞的体外成熟来对母源基因产物进行功能性操控。

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