利用功能操作母源基因产物 体外 斑马鱼卵母细胞成熟

本实验方案的总体目标是在体外培养斑马鱼卵母细胞，并在受精前根据需要对母源基因产物进行功能性操控。该方法有助于解答发育生物学领域中的关键问题，特别是关于母源物质对胚胎发育重要性的问题。该技术的主要优势在于能够对卵母细胞进行体外培养，随后完成受精并产生可存活的胚胎。

并且，如有需要，可对受精后立即在早期胚胎中发挥作用的母源基因产物进行功能操控。首先，在体外培养操作前8至10天，使用渔网将多对所需品系的单条雄鱼与单条雌鱼转移至交配缸中，置于交配缸内过夜。

在让鱼类交配至次日下午后，使用渔网将产卵的雌鱼分离，并将其放入单独的水族箱中。每天两次喂食由等量丰年虾和鱼粮薄片组成的混合饲料。在无菌条件下，向50毫升锥形管中加入20毫升含L-谷氨酰胺、pH为7.0的Leibovitz's L-15培养基。

然后，使用10 N氢氧化钠将其调节至pH 9.0。将9毫升L-15培养基分别加入两个50毫升的锥形管中。随后，将其中一个管标记为DHP，另一个管也标记为DHP。

在 DHP 管中，加入 10 微升 DHP、490 微升 DH2O 和 500 微升 10% BSA。在 DHP 管中，加入 100 微升 10 毫克/毫升的庆大霉素、400 微升 DH2O 和 500 微升 10% BSA。进行卵母细胞解剖时，首先在 DH2O 中配制 0.2% 三卡因储备液，并用 1 摩尔 Tris（pH 9.0）缓冲至 pH 7.0。

将此溶液保存在 4 摄氏度。在实验场所每日光照周期结束前 0 至 4 小时内，于 250 毫升烧杯中加入 20 毫升 0.2% 三卡因储备液（pH 7.0）和 80 毫升鱼用水，并混匀。必须在鱼类适应的光照周期结束后的四小时内启动该操作，这一点至关重要。

否则，卵母细胞将无法正常成熟。使用勺子从三卡因溶液中取出已处死的鱼，并用鱼用水短暂冲洗。然后将鱼放在纸巾上以吸去多余的水分。

使用洁净的剃须刀片在胸鳍水平处将已处死的鱼断头。然后用解剖剪在鱼体腹侧从前端向肛门区域做一纵向切口。将鱼置于解剖显微镜下的培养皿中，并使用透射光照明。

然后，使用一对解剖镊子分离卵巢组织，并将组织转移至一个直径35毫米、高10毫米的培养皿中，该培养皿内含有4毫升Leibovitz's L-15培养基（DHP）。接着，用解剖镊子轻轻地将卵母细胞从卵泡组织中分离。挑选处于早期第4阶段的卵母细胞，这些卵母细胞接近最大体积，其特征为细胞质呈深色不透明，且卵母细胞内偏心位置存在一个清晰可见的生发泡（germinal vesicle, GV）。

弃去较早阶段的卵母细胞以及透明的成熟第5阶段卵子。使用玻璃巴斯德吸管将早期第4阶段的卵母细胞转移至另一个35 mm × 10 mm的塑料培养皿中，该培养皿内含有4 mL Leibovitz's L-15培养基及DHP。尽量减少将不含DHP的培养基转移至含有DHP溶液的培养皿中。

若注射 mRNA，在注射前立即使用 RNA 级反渗透水和 0.2 摩尔氯化钾将 mRNA 稀释至终浓度为 0.1 摩尔氯化钾的溶液。若注射 Morpholino 寡核苷酸（MO），在注射前立即使用 RNA 级反渗透水和 0.2 摩尔氯化钾将 MO 稀释至所需浓度，使终浓度为 0.1 摩尔氯化钾。随后，用精细镊子手动固定卵母细胞，使用拉制的玻璃毛细移液管制成的针头，向野生型四期卵母细胞中注射约一纳升溶液。

将未成熟且已注射的卵母细胞继续在 DHP 培养基中于 26.5 摄氏度下孵育。每隔约 30 分钟检查一次，确保卵母细胞保持完整，并通过逐渐变得透明来正常成熟。使用巴斯德吸管移除发生裂解的卵母细胞。

然后将它们丢弃到实验室废弃液杯中，以保持培养基的质量。根据卵母细胞裂解的程度，用大约一半体积的新鲜 DHP 培养基更换培养液，以维持溶液澄清。当大多数卵母细胞变得透明，且生发泡（GV）不再明显时，使用超细镊子在卵母细胞与滤泡膜之间间隙较大的区域撕开滤泡膜。

剥去部分膜结构，同时按住已剥离的部分，将卵母细胞从膜中滚出。另一个关键步骤是去除滤泡膜。如果该层未完全去除，将会影响受精及绒毛膜的扩张。

将去滤泡的卵母细胞用少量培养基转移至含有数滴DHP培养液的培养皿中，并立即进行受精。在卵母细胞成熟步骤即将结束时、去滤泡之前，取五条雄鱼的精巢，用500 µL Hank's溶液制备精子悬液。向含有去滤泡卵母细胞的DHP培养液中加入10至50 µL精子悬液。

然后等待10秒。使用移液器向卵母细胞中加入几滴E3培养基。等待1分钟后，用E3培养基浸没培养皿。

在让受精胚胎发育一段时间后，使用配备透射光光学系统的解剖显微镜观察卵裂阶段的发育进程，以确认受精成功，具体方法如前文所述的受精与分期操作。通过GFP的表达可见，体外培养的卵母细胞在卵母细胞发育过程中，仅需两小时即可从外源mRNA合成蛋白质。然而，只有在卵子发生第四阶段开始培养条件的卵母细胞，才能发育为成熟的第五阶段卵母细胞。

在本实验中，注射野生型aurora B mRNA可挽救其对应基因cellular island突变所引起的表型效应。对照组的胚胎也被允许发育，以展示相应的突变表型。通过注射翻译阻断型Morpholino可成功模拟已知的突变表型，例如将lrmp-MO注射入卵母细胞后，可模拟对应突变futile cycle的突变表型。

也可以将编码mRNA注射到野生型或突变型卵母细胞中，以在早期胚胎内观察相应的表达产物。例如，如图所示，Sass6-mCherry蛋白定位于由中心体标记物Gamma tubulin标记的焦点处。一旦掌握该技术，若操作得当，可在大约5至6小时内完成。

在进行该操作时，重要的是要记住不要急于完成步骤，应在去卵泡和受精前确保卵母细胞充分成熟。完成该操作后，还可进行其他方法，如胚胎固定，以回答更多科学问题，例如目的基因的功能挽救，或RNA及蛋白质的定位分析。

该技术建立后，为早期胚胎发生领域研究人员探索母源基因产物在斑马鱼中的作用奠定了基础。观看本视频后，您应能够充分理解如何通过斑马鱼卵母细胞的体外成熟来对母源基因产物进行功能性操控。