准备厚生物样品的观察扫描透射电子断层扫描

该程序的总体目标是使用会聚光束扫描透射电子断层扫描获得厚生物标本的三维重建和景深恢复。这种方法可以回答结构生物学领域关于厚生物标本电子断层扫描的关键问题。该技术的主要优点是可以以收敛位模式获取图像，并且可以在大多数专用于层析成像的软件上进行数据处理。

要开始制备细胞培养样品，请将样品以 5000 x g 离心 5 分钟。在整个样品制备过程中使用这些离心参数。弃去上清液，将细胞重悬于一毫升富含 4% 多聚甲醛和 2% 戊二醛的 PBS 中。

在室温下孵育悬浮液 30 分钟。离心混合物，弃去上清液，用 1 毫升 PBS 洗涤沉淀 3 次。使用相同的孵育条件和洗涤程序，将沉淀物放入 1 毫升富含 1% 四氧化锇的 PBS 中，并在 1 毫升富含 2% 乙酸铀酰的 PBS 中孵育。

接下来，将样品冷却至 4 摄氏度。通过在浓度递增的乙醇溶液中连续孵育来脱水沉淀。在整个孵育、离心和洗涤过程中保持 4 摄氏度的样品温度。

脱水沉淀重悬于一毫升纯乙醇中，并在 4 摄氏度下孵育过夜。然后，让样品升温至室温，并离心样品。在室温下将沉淀物置于浓度递增的环氧树脂溶液中孵育。

最后一次洗涤后，将沉淀重悬于 1 毫升纯环氧树脂中，并在室温下孵育过夜。离心样品，去除上清液，然后将沉淀重悬于 200 μL 环氧树脂和固化剂中。将悬浮液转移到胶囊中。

将塑料胶囊在 60 摄氏度下孵育 48 小时以聚合树脂。从培养箱中取出胶囊并验证树脂聚合。在包埋的样品上添加一层环氧树脂和固化剂，并在相同条件下再次孵育胶囊。

将嵌入树脂中的样品倒置安装在样品架中。将样品牢固地固定在超薄切片机的修整块上。在树脂中将塑料胶囊从样品上切开。

将曝光的树脂塑造成金字塔。然后将胶囊和标本架转移到超薄切片机的移动臂上。安装修整刀，在显微镜的引导下，细化金字塔形状。

用组织学刀代替修整刀。在显微镜下，调整胶囊俯仰角，使金字塔垂直于刀口。设置切割速度和样品切片。

将样品切片后，将所选切片转移到滤纸上经过处理的铜网格上。让样品干燥，然后将样品装入电子显微镜中。要设计通过焦距倾斜系列，首先计算电子束景深和样品的最大表观厚度。

根据这些值，选择一个聚焦间隔，并确定在最大表观厚度下对整个样品进行成像所需的聚焦步数。然后，在低放大倍率下，在样品中找到感兴趣的区域。调整偏心高度，以便在旋转样品时 ROI 不会移动。

验证 ROI 是否在整个倾斜范围内保持可见。填写通过焦距倾斜系列参数以进行自动图像收集并获取图像。将图像序列导入图像处理程序中，并在金字塔层次结构中以相同的倾斜角度对齐收集的图像。

通过堆叠对齐的图像来查找每个倾斜角度的对齐方式。浏览堆栈以确保只有聚焦区域从一个图像移动到另一个图像，并根据需要重新对齐图像。验证整个样品的对齐情况后，在高设置下合并聚焦信息，以产生每个倾斜角度具有单个图像的系列。

根据局部最小值或基准标记执行倾斜序列的查找对齐。执行 3-D 重建并检查生成的图像。如果重建看起来模糊或变形，请重新对齐原始图像系列。

使用这种方法对 t. brucei 的样本进行成像和分析。在零度倾斜角度下，可以看到鞭毛袋的几个细节。

在 70 度的较高倾斜角度下，通过焦距系列中收集的每张图像中只有一部分是聚焦的。这个位置在整个系列中都在变化。通过合并焦点部分，可以生成具有较大焦点区域的单个图像。

当突出显示通过焦距倾斜系列的高频区域时，这种效果更加明显。高频信息跨越了大部分组合图像，表明通过焦距倾斜系列已经得到了很好的处理。掌握后，图像处理部分可以在大约 3 到 4 小时内完成，具体取决于所选的对齐和重建参数。

在尝试此过程时，请务必记住，最终重建的质量在很大程度上取决于先前对齐测试的质量。观看此视频后，您应该对如何执行通过焦距倾斜系列的采集和图像处理有很好的了解。