Name: 可视化指南排序的电生理记录使用SpikeSorter (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: 学习使用SpikeSorter软件对多电极阵列记录的神经组织细胞外信号进行尖峰检测与分类。该用户友好型工具提供多种预处理选项，帮助电生理学家简化神经行为数据分析流程。

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感谢所有使用过 SpikeSorter 的个人和团队，以及为文件格式支持提出需求、并就如何改进本软件提供意见和反馈的各位。其中包括 Youping Xiao、Felix Fung、Artak Khachatryan、Eric Kuebler、Curtis Baker、Amol Gharat 和 Dongsheng Xiao。我们感谢 Adrien Peyrache 提供“代表性结果”部分中的假阳性与假阴性图示。

1. 程序设置
<ol>
	<li>前往 <a href="http://www.swindale.ecc.ubc.ca/SpikeSorter">http://www.swindale.ecc.ubc.ca/SpikeSorter</a> 下载程序。将提供的可执行文件复制到您选择的目录中，并阅读随附的文档。 
	注意：无需正式安装或编译。</li>
	<li>在打开任何待排序文件之前，请确保有足够的空闲内存（RAM）以容纳整个记录时长。同时确保在数据文件所在目录中存在一个有效的通道配置文件（具体格式参见文档说明）。</li>
	<li>启动程序后，进入“文件 - 打开”，在弹出的文件打开对话框右下角的下拉列表中选择相应的记录文件格式，选中要打开的文件，然后点击“打开”。</li>
	<li>读取完成后，检查电压记录显示界面。双击该显示区域（或选择“视图 - 电压记录”），将弹出一个对话框，其中包含可控制查看记录波形任意部分的选项。 
	注意：双击其他显示窗口通常也会弹出相应的控制对话框。</li>
	<li>退出对话框后，将鼠标悬停在波形上，可在显示区域左上角查看特定的电压值。使用滚轮可对显示区域的任意部分进行缩放，按住鼠标左键可拖动窗口内容。 
	注意：该显示界面会频繁更新，以反映新检测到的事件，或通过颜色和/或数字标示聚类后的簇分配结果。</li>
	<li>如果记录未经过滤波且包含局部场电位，请通过“预处理 - 变换/滤波”（或点击工具栏中的滤波图标）将其去除。选择“高通巴特沃斯滤波器”，设置合适的截止频率和极点数，然后点击“Do-It!”。滤波完成后，在电压波形窗口中检查新的波形。 
	注意：滤波在傅里叶域中进行，具有非因果性，不会引入波形的相位失真。对于长时间的记录，滤波可能需要数分钟。</li>
	<li>接下来，检查是否存在可能故障并需要屏蔽的通道。进入“预处理 - 通道检查”（或点击通道检查图标），然后查看出现的图表。该图表显示了通道对之间的信号相关性随空间距离变化的情况5。违反此关系的通道可能工作异常。要查看此类异常通道，请点击“单通道净偏差”。
	<ol>
		<li>要屏蔽异常通道，可直接选择通道编号，或从问题列表中选择。退出该对话框时，系统会提示是否保存屏蔽值，点击“是”。 
		注意：生成的文件将与记录数据文件同名，但扩展名为 .msk。此后每次打开同一数据文件时，该屏蔽文件将自动读取。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 事件检测
<ol>
	<li>进入“预处理 - 事件检测”以打开事件检测对话框（图1）。该对话框还提供基于通道噪声水平进行屏蔽的选项（尽管这些通道通常已在之前的测试中被识别）。例如，一个被有意接地的通道可能具有非常低的噪声水平。</li>
	<li>使用右上方的滑块检查特定通道的噪声水平。仔细观察电压显示也可能揭示需要屏蔽的静默或异常嘈杂的通道。</li>
	<li>选择事件检测的阈值方法。点击该分组框中的帮助按钮可获取有关选项的更多信息。推荐使用“可变”阈值法，阈值设为噪声水平的4.5X–6X7。使用左上方的控件选择用于此目的的噪声水平计算方式。</li>
	<li>从下拉列表中选择检测方法。“动态多相滤波”是推荐的方法。此方法需要指定一个时间窗口。将窗口设置为典型峰电位宽度的大约一半。过窄的值会偏向于检测更窄的峰电位，但影响通常不大。建议设置为0.15–0.5 ms范围内12。 
	注意：显示的数值为采样间隔（采样频率的倒数）的整数倍。</li>
	<li>选择对齐方式。选择最能识别待分类峰电位中单一、时间上局域化特征的选项，例如，如果许多峰电位具有多个正向峰，则“正向峰”可能不是一个理想选择。对于多数记录，“负向谷”通常是最佳选择。其他选项通常可保留默认设置。点击“开始”。 
	注意：事件检测可能需要数秒至数分钟，具体时间取决于记录长度和通道数量。</li>
	<li>点击“完成”退出对话框。在电压波形窗口中检查以灰色显示的事件。确认看起来像事件的信号是否已被正确检测。
	<ol>
		<li>如果未被检测到，可考虑使用更低的检测阈值重新运行事件检测。但需注意，振幅非常低的峰电位可能难以分类，且大量此类事件可能干扰高振幅峰电位的分类。同时检查是否存在明显的重复事件或邻近峰电位未能分辨的情况，并相应调整时空锁定窗口参数。 
		注意：在此阶段，事件通过其发生时间和通道编号进行标识。通常，该通道是峰电位峰-峰值振幅最大的通道。事件初始状态未进行聚类，因此每个事件的聚类编号均为零。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 分选
注意：常规分选前通常不执行下一步操作，但在首次进行分选或遇到不熟悉的数据时，执行此步骤非常有用。
<ol>
	<li>进入“排序 - 将通道转换为簇”选项。此操作会为每个未被屏蔽的电极通道创建一个单独的簇，前提是每个通道都已分配了一些事件。通过进入“审阅 - 查看清洁并分割簇”来检查这些簇。这将弹出另一个对话框（图2）。使用左上角的旋转控件选择要查看的簇。 
	注意：实心蓝色（青色）线表示该簇中所有波形的平均值，在下文中称为簇模板。簇中事件的主成分（PC）分布在下方窗口中显示。这些分布通常会揭示出两个或多个子簇的存在。</li>
	<li>按下“重新对齐”按钮，以调整每个事件的时间（导致显示中的波形发生轻微的横向移动），使其更好地与模板形状匹配。此操作通常可使子簇更加紧凑和清晰，有时还能减少表观数量（图3）。</li>
	<li>选择一个包含两个或多个明显子簇的簇，然后点击“自动分割”。如果在PC分布图中识别出子簇，它们将被着色。作为练习，可使用其中一个小型“分割”按钮创建新簇并进行检查。排序可以手动继续进行，但建议返回并采用更快的自动排序流程。</li>
	<li>进入“排序 - 自动排序”（或点击工具栏上的自动排序按钮）以开始自动排序。生成的对话框如 图4 所示，其中提供了多种选项。
	<ol>
		<li>如果事件检测已完成，请保持“跳过事件检测”选项处于选中状态。若未选中，则将使用从事件检测对话框继承的参数值和设置重新运行事件检测。由于事件检测已经完成，因此请保持该选项选中。</li>
		<li>在下方的“聚类”面板中，选择一个足够大的时间窗口，以完整包含对齐点前后整个动作电位波形，但不要更大。可利用此窗口屏蔽波形中可能干扰（或对排序贡献较小）的区域，例如 长而多变的后电位。通常 ±0.5 ms 范围内的值较为合适。与其他时间窗口一样，该窗口由整数个采样点构成，因此显示的时间值为采样间隔的整数倍。</li>
		<li>接下来，选择在聚类过程中使用的重新对齐选项。该选项将利用模板波形，其鲁棒性优于初始事件检测阶段，因为在事件检测中需将判据应用于相对嘈杂的单个动作电位波形。推荐选项为“峰值加权质心法”，但如果动作电位波形中负谷特征稳定，则“负谷”选项可能更优。</li>
		<li>设定最小簇大小。少于该数量的动作电位的簇将被删除，以防止在排序过程中积累大量小的、可能是虚假的簇。</li>
		<li>确定用于聚类的主成分空间维度数。通常二维已足够，但使用三维可能获得略优的结果，尽管排序时间会相应延长。</li>
		<li>其余选项保持默认设置。可点击帮助按钮获取各项选项的详细说明。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>点击“开始”以启动自动排序。首先基于通道形成簇，如步骤3.1所示。随后依次处理这些簇，逐个分离出单个子簇以形成新簇。每次分离出新簇时，主成分（PC）值将被重新计算并显示。此过程持续进行，直到没有任何单个簇可进一步分割为止。</li>
	<li>根据界面提示操作，其中将从父簇中分离出的子簇以红色显示。 
	注意：偶尔最终簇为红色，而存在未着色的离群点，这些点未形成明显的子簇。这些离群点通常将被删除。在此过程中，簇的数量逐渐增加。完成后，将为每一对符合条件的簇计算簇重叠指数。重叠值较大的簇对将自动合并，而重叠值中等（默认范围为0.1至0.5）的簇对将先合并再重新分割。中等重叠值表明存在两个不同的簇，但部分数据点被错误分配。在此阶段，簇的总数通常减少，而稳定簇的数量增加。</li>
</ol>
4. 定制化
<ol>
	<li>如果首次使用该程序（或可能在下一步操作期间），请自定义窗口大小和位置。进入“文件-首选项”菜单，从下拉列表中选择不同类型的窗口，并根据屏幕情况调整其大小。退出对话框后，合理布置各窗口位置，以充分利用屏幕空间。</li>
	<li>在对话框中选择最适合电极上通道布局与记录中峰电位间距的缩放值。程序提供自动缩放选项，但该功能未必总能选择最佳数值。若自动缩放效果不佳，请将其关闭。</li>
	<li>勾选“固定参数”（Sticky Parameters）选项：若启用此选项，则分类参数值（例如用于事件检测的参数）的更改将在程序下次启动时被保存并继承。此功能虽有用，但也需注意检查参数值，以确保在探索不同选项或加载不同工作文件时未被无意修改。此外，还可设置子聚类颜色的更改选项。</li>
	<li>更改处理器线程数量时需谨慎。最优线程数通常比物理（而非虚拟）CPU 核心数少 1。增加线程数未必能加快处理速度，甚至可能导致严重性能下降。</li>
</ol>
5. 合并与拆分
<ol>
	<li>自动分选完成后，点击“下一步”进入手动引导的合并与拆分阶段。弹出的对话框左下角显示了尚需检查的模糊聚类对数量以及稳定聚类的数量。</li>
	<li>点击“开始”。随后会出现另一个对话框，并显示第一对需要检查的项目。</li>
	<li>选择是否合并该组，重新分割该组（导致重叠值降低），或将该组标记为“不同”，表示忽略重叠指数的值，或标记为“模糊”，表示无法确定这些峰电位来自相同或不同的神经元单元。
	<ol>
		<li>单击复选框以显示峰电位参数图（峰峰值（P-P）高度，或第一主成分（PC1）或第二主成分（PC2）） 与 时间，和/或自相关与互相关直方图。 
		注意：P-P 高度的显示 与 时间在决定是否合并两个簇时通常非常有用。如果一个单元的峰电位高度与另一个单元的峰电位高度在时间上平滑过渡，且恰逢一个单元停止放电而另一个单元开始放电，则这两个单元极有可能属于同一神经元，应当合并。互相关图可能揭示两个簇之间尖峰放电时间的强烈时序关系。若互相关图在极短的时间间隔内出现显著的非对称性峰值（例如 大约5-10毫秒），尤其是当第二个峰电位小于第一个时，这两个信号极有可能来自同一个神经元，该神经元在发放峰电位簇时，由于Na⁺+ 通道适应</li>
		<li>当难以决定是否合并时，将该配对标记为“ambiguous”，并在后续分析中相应地处理这些聚类。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>如果合并与拆分选项无法找到明显可分离的簇，请使用弹出对话框中的滑块手动调整聚类参数（空间带宽 sigma），并结合一组合并按钮，寻找一个看起来满意的拆分结果。使用“撤销”按钮可恢复至两个簇的原始状态。点击“按所示拆分”以完成操作。注意，此过程可能产生两个以上的簇。</li>
	<li>继续此过程，直至没有更多的配对需要检查。此时，绝大多数簇应已被标记为“稳定”。</li>
	<li>如果某些簇对的重叠指数非常低，导致在引导合并过程中被忽略（但仍存在合并的证据），请前往“审查 - 比较簇对”菜单选项（或单击工具栏中对应的图标），打开如图所示的对话框 图5使用对话框顶部的旋转控件选择任意一对聚类进行比较。 
	注意：与引导式合并和分裂相同，配对结果会被放入一个已排序的列表中，但在本情况下，除簇重叠指数外，还可使用其他比较指标。
	<ol>
		<li>从下拉列表中选择“归一化点积”选项。该方法计算模板值之间的相关性，对乘性缩放变化不敏感，适用于识别由峰高波动导致的伪影性簇对。</li>
		<li>单击对话框中间的“最相似”按钮，以显示最相似的一对。使用按钮下方的水平旋转控件向前或向后浏览列表。利用相关性显示和P-P高度 与 时间显示以辅助进行合并决策，与用户引导的合并和分裂操作相同。请注意，每次合并操作后，列表都会重新计算。该比较阶段是开放式的，用户需自行决定在支持合并的证据上进行多大范围的搜索。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 审核 - 后处理
<ol>
	<li>现在进入“Review - Post-processing”（或点击相应的工具栏图标）。此对话框（图6）提供选项，可用于向簇中添加或从中移除事件，也可删除信噪比（SNR）低于设定阈值的整个簇。在分类过程中，由于对齐误差可能会产生重复事件（即在同一时间点出现在同一簇中的多个事件）。那些远离原始位置的事件有时可被重新定位；若重新定位无效，也可将其删除。</li>
	<li>使用对齐清理按钮，移除与模板匹配度较差的簇内事件。使用“Recluster”按钮执行相反操作，即将未归簇但与某一特定模板匹配良好的事件重新分配至该簇。被回收的事件将被标记为各自父簇的子簇，可通过“View, clean and split clusters”对话框进行检查。这些事件将保留在簇中（并以此状态导出），除非被手动删除（使用第一个子簇旁的小“delete”按钮）。返回后处理对话框后，使用“delete”按钮及其旁边的数值调节控件，删除信噪比低于所选阈值的簇。</li>
	<li>尽管簇编号从1到N连续排列（其中N为簇的总数），但在分类结束时，簇的实际编号接近于任意分配。可使用“Sort”按钮，根据选定的标准（例如电极上的垂直位置或通道编号）对簇重新编号。需要注意的是，除删除重复事件外，目前尚无客观证据支持本对话框中任何特定选择优于其他选择。</li>
	<li>在分类的手动操作过程中，可随时保存一个包含当前参数值、分类选项、事件时间、簇属性及消息记录的文件。通过“File - Save work file”创建该文件。为文件命名时，应使其名称明显关联于原始数据文件，并点击“Save”。若需在后续继续分类，首先打开原始记录文件，然后进行高通滤波（如初始已执行），再打开已保存的工作文件。程序状态将恢复至工作文件保存时的完全一致状态。此外，工作文件也记录了分类过程的全部操作——包括所用参数及分类期间生成的消息。</li>
	<li>最后，导出已分类的事件。进入“Export - Sorted spike files”（或点击工具栏中对应按钮）。从下拉列表中选择“.csv文件”（逗号分隔变量），然后点击“Save as”。为将要保存已分类单元导出数据的文件指定一个名称。 
	注意：该文本文件中每一行对应一个事件，依次包含事件发生的时间（以秒为单位，精确到最近的10 µs）、簇编号（从1开始递增）以及分配给该事件的通道编号。请注意，如果某一簇中的事件在某个特定通道上并非始终具有最大幅值，则分配的通道可能在该簇的不同事件间不一致。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

文件格式
目前支持的文件格式包括 Neuralynx（.ntt 和 .ncs）、Plexon（.plx）、Neuroscope（.xml + .dat）、MultiChannel Systems（.mcd）、Blackrock（.nev）和 Intan（.rhd）。对于不支持的格式，有两种处理方式。一种是请求开发者在后续版本中添加对该文件格式的支持（在“帮助 - 关于”对话框中提供了发送电子邮件的链接）。另一种方法是将文件转换为受支持的格式。一个简单的选择是使用时间-脉冲-格式“.tsf”。这种基础格式包含电压记录和通道位置信息，以及排序后的事件记录、通道和聚类分配信息。读取这些文件通常比其他格式更快。无论是否涉及不支持的格式，将滤波后的数据保存为 .tsf 文件可能都很方便（该格式包含在导出选项中），因为这可以避免后续耗时的滤波过程。.tsf 格式的详细信息包含在程序附带的文档中。
附属文件
两个辅助文件用于存储参数，即 ss_prefs.sav 和 ss_parameters.s...

任何使用比简单的在线阈值检测和时间窗处理更复杂的方法来记录大脑细胞外信号的研究者，都面临着从电极记录的噪声电压信号中识别并分离出不同神经元信号的任务。这项任务通常被称为“ spike sorting”（ spike 分类）。 spike 分类的难度受到多种因素的影响。神经元之间可能非常接近，导致邻近电极记录到的信号十分相似而难以区分。单个神经元产生的信号可能随时间变化，原因可能包括电极的移动、在高放电率期间钠通道动力学的改变、靠近电极的树突中电压门控通道激活程度的变化，或可能与脑状态的改变有关。通过使用具有多个紧密排列（20 - 100 µm）记录通道的多电极阵列（MEAs），可以在一定程度上缓解这些问题，因为单个神经元的信号通常会分布在多个通道上，从而获得更好的空间分辨能力1,2。然而，由于神经元信号会沿电极全长扩散并在空间上重叠，这一方法结合上述因素，导致需要在潜在的极高维空间中识别对应于不同神经元的聚类。当电极通道数量较多时，该问题在计算上可能变得难以处理。迄今为止，尽管已有多种解决方案被提出3,4,5,6,7,8，但尚未形成普遍认可的最佳 spike 分类方法，而来自多电极阵列（MEAs）的记录数据正变得越来越常见9,10。由于 spike 分类本身并非最终目的，而仅仅是进一步数据分析前必要的预处理步骤，因此迫切需要一个易于使用的软件包，能够读取原始记录数据文件，并以尽可能少的用户干预、快速且可靠地将其转换为已分类的 spike 序列。
本文提供了 SpikeSorter 使用的教程——该程序旨在满足上述需求。该程序基于先前已发表论文中描述的算法11,12,13。程序设计的目标包括：a) 具备用户友好的界面，无需或仅需极少的计算机编程或动作电位分选方法学方面的先验知识；b) 除标准的 Windows 或 Linux 操作系统外，几乎不需要其他专用软件组件；c) 支持多种记录数据格式的导入与导出；d) 在分选过程中尽量减少用户干预；e) 分选时间应随记录时长和电极通道数以合理的方式（理想情况下呈线性）增长。程序中实现的算法包括：a) 一组灵活的预处理和事件检测策略；b) 一种自动化的“分而治之”式降维策略，该策略根据从分配给特定簇的通道子集中提取的主成分（PC）分布对电压波形进行聚类；c) 基于均值漂移算法3,14 的快速聚类过程，用于自动聚类 PC 分布；d) 对簇进行部分自动化的成对合并与分裂，以确保每个簇尽可能与其他簇区分开来。此外，还增加了一组程序，允许用户通过检查 PC 分布、脉冲序列的互相关图与自相关图以及脉冲波形的时间-幅度图，手动进行簇的分裂或合并。该程序可读取并分选来自四极电极、四极电极阵列、犹他阵列以及单通道和多通道多电极阵列（MEA）的记录数据。当前支持的通道数上限为 256，但未来可能会增加。
另一个跨平台的开源实现&#34;spyke&#34;（http://spyke.github.io）也可获取。该工具由我们其中一位作者（MS）使用 Python 和 Cython 编写，其整体方法与 SpikeSorter 相同，但存在一些差异：为降低内存需求，原始数据以小数据块形式加载，且仅在绝对必要时才加载；聚类结果仅在三维空间中显示、操作和分类；同时采用主成分分析和独立成分分析作为互补的降维方法。spyke 需要更多的用户交互，但大量依赖键盘与鼠标快捷键以及撤销/重做队列，以快速探索各种因素对任意给定动作电位子集聚类效果的影响。这些因素包括动作电位通道和时间范围的选择、动作电位对齐、聚类维度以及空间带宽（sigma）11。
以下是用于排序的算法和策略的简要说明。更完整的描述可参见以往的出版物。11,12,13 以及可通过访问获取的注释 通过 帮助按钮（以“?”标识）位于SpikeSorter内。加载原始细胞外电压文件并滤除低频成分后，事件检测的初始阶段将产生一组事件，每个事件均由事件发生时刻前后的一段短暂电压片段组成。若电极位点间距足够紧密（&#60; 100 µm），单个神经元信号通常会出现在多个相邻通道上。系统会为每个事件自动选择一个中心通道，该通道对应事件的峰峰值电压最大。自动分选首先为每个电极通道生成一个初始聚类，包含所有定位到该通道的事件。位于两个通道中间的神经元可能产生被定位（可能随机）到不同通道的尖峰信号：来自这两组尖峰的聚类将在后续阶段被识别为相似并合并。随后计算每个初始聚类中事件的平均波形，称为聚类模板。根据模板波形在各通道上的振幅及其标准差，为每个聚类分配辅助通道。然后基于所分配通道组上的波形，计算每个聚类的主成分值。用户可选择使用的主成分维度数量，通常2个维度已足够。每个聚类随后被进一步划分为若干子聚类，此过程重复进行，直至无法再通过自动聚类进一步分裂为止。
此时，来自64通道电极的初始簇集（例如64个）可能会被进一步划分为其两到三倍的数量，具体取决于记录中实际存在的神经元数量。但由于单个神经元的信号事件在不同通道间的分配具有可变性，此阶段所得到的簇集数量几乎必然多于实际应有数目。接下来的分类步骤是通过比较成对的簇集，合并相似的簇集或在簇集之间重新分配事件，以纠正过度分割的问题。该分类阶段被称为“合并与分裂”。
合并与分裂
对于 N 个簇，共有 N*(N-1)/2 对组合，因此对数随 N2 增长，这是不可取的。然而，许多组合对可以被排除在比较之外，因为这对中的两个成员在物理位置上相距较远。这使得计算量降低至与通道数量呈近似线性关系。尽管采用了这一简化方法，合并与分裂阶段仍然可能非常耗时。其工作方式如下：每一对需要比较的簇（根据分配给每个簇的通道集合之间的重叠程度判断为物理上接近的簇）被临时合并，但保留两个成员簇中各个峰电位的身份信息。然后计算该合并簇对的主成分，并基于前两个主成分的分布来计算两个簇中数据点之间重叠程度的指标。
重叠度量的计算方法在其他地方有更详细的描述11。如果簇之间完全不重叠，则其值为零，i.e. 每个点的最近邻均位于同一簇中。如果簇完全重叠，则其值接近于1，i.e. 最近邻位于同一簇中的概率与点均匀混合情况下所预测的概率相同。
在决策过程中会考虑重叠度量。如果重叠程度大于某一特定值，则可能将簇合并。如果重叠程度非常小，则可将该簇对定义为彼此独立并保持不变。中等程度的重叠值表明簇对之间分离不完全，可能提示应先将该对簇合并后再重新拆分，以期得到重叠更少的两个簇。这些操作首先在自动化阶段执行，随后在人工引导阶段进行。
在自动化阶段，重叠值较高的聚类对会被合并；随后，中等至低重叠值的聚类对会被合并并重新拆分。在第二阶段（用户引导阶段），系统会向用户展示所有剩余的模糊聚类对即 那些在指定中间范围内具有重叠值的样本，按顺序呈现，要求选择是否 a) 以合并该配对， b合并并重新拆分该配对， c）声明该对为不同类别（此操作将覆盖重叠度量的显著性），或 d）以将该电极对的关系定义为“模糊”，表示该对中的峰电位不太可能被良好分离。系统提供了多种工具以辅助做出这些判断，包括自相关图、互相关图以及峰电位幅度和主成分（PC）值的时间序列图。
理想情况下，在合并与分裂阶段结束时，每个簇应与其他所有簇明显区分开来，这种区分依据可以是该簇与其他簇共有的通道数量极少或没有，或者其重叠指数小于某一设定值。该值可由用户选择，通常为0.1。通过此检验的簇（单位）被定义为“稳定”，未通过检验的（因为与一个或多个其他簇的重叠程度超过阈值）则被定义为“不稳定”。在实际操作中，大多数单位在排序结束时最终被定义为“稳定”，其余部分则要么被舍弃，要么被视为可能的多单位活动。
软件要求
SpikeSorter 兼容 64 位版本的 Windows 7 和 Windows 10 操作系统，也可在 Linux 系统下通过 Wine 模拟器成功运行。数据文件会完全加载到内存中（以提高运行速度），因此可用内存容量需随记录数据的大小相应增加（建议为程序本身预留约 2 GB 内存）。在 Windows 和 Linux 环境中，均已成功对超过 130 GB 的电生理数据文件完成排序。软件选项通过标准的 Windows 菜单、工具栏和对话框进行访问。菜单中各项的布局大致对应于排序操作的流程，左侧以“文件”菜单开始，用于数据输入，右侧以“导出”菜单结束，用于导出已排序的数据。工具栏按钮为常用菜单项提供快捷方式。
通道配置文件
许多记录数据格式不存储通道位置。然而，了解这些位置对于 spike 分选至关重要。采集软件也可能以多种方式对通道进行编号：SpikeSorter 要求通道按顺序编号，从通道 1 开始。因此，必须创建一个辅助的电极配置文件，用于重新映射通道编号以符合顺序规则，并存储通道位置。通道配置文件是一个文本文件，每个通道对应一行文本。文件的第一行存储一个文本名称，长度最多为 16 个字符，用于标识电极。后续各行中的数字可用制表符、单个逗号或空格分隔。每行包含四个数字，依次为：文件中的通道编号、该通道将被映射到的通道编号（即 将由SpikeSorter使用的数量），以及 x 和 y 通道的坐标，单位为微米。该 x 坐标通常应垂直于电极插入方向和 y 相应地，坐标中的深度表示进入组织的深度。配置文件必须与记录文件置于同一目录中。文件命名具有一定灵活性：程序会首先查找与原始数据文件同名但扩展名为 .cfg 的文件；若未找到，则会查找名为 'electrode.cfg' 的文件；若该文件也不存在，则会生成错误信息，提示缺少通道布局信息。

<table><tbody><tr><td>spikesorter.exe</td><td>不适用</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.swindale.ecc.ubc.ca/SpikeSorter">http://www.swindale.ecc.ubc.ca/SpikeSorter&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

使用“spikesorter”对电生理记录进行分类的可视化指南

A Visual Guide to Sorting Electrophysiological Recordings Using 'SpikeSorter'

目前可用于对多电极阵列记录信号进行峰电位分类的独立软件应用较少。理想的软件应具备友好的图形用户界面，能够读取多种格式的数据文件，并为用户提供一套灵活的工具，使其能够以一定程度的可靠性检测并分类来自不同神经元单元的细胞外电压波形。此前发表的峰电位分类方法现已集成于一款名为 SpikeSorter 的软件程序中，旨在为电生理学家提供一套完整的分类工具，从原始记录数据文件开始，直至导出分类后的峰电位时间点为止。该程序在当前技术条件下尽可能实现了流程自动化。本文详细说明并演示了该软件的使用方法：打开一个代表性数据文件，对细胞外记录信号进行滤波，检测事件并进行聚类分析。文中还展示了分类过程中常见的若干问题，包括由于某些神经元单元倾向于成对发放峰电位（其中第二个峰电位显著小于第一个）而导致的单元被人为过度分割，以及某些单元峰电位幅度随时间缓慢变化所引起的过度分割现象。SpikeSorter 的性能已通过模拟的真实参考数据（surrogate ground truth data）进行了测试，结果表明其准确性与其他正在开发的算法相当。

图7 展示了典型分类记录的显示结果（通过进入“视图 - 已分类波形”获得）。默认视图仅显示每个簇在中心通道上的波形。常见的现象是，同一通道上一对簇的波形看起来完全相同，但当使用“比较配对”对话框检查这两个簇时，主成分投影（PC投影）中会显示出明显的不同簇，这种情况通常是由于相邻通道上的波形存在差异所致。例如，图7中通道62上的波形即为此例。
如上所述，经常会遇到需要根据幅度-时间图和互相关图来决定是否合并的簇对。 图8 展示了部分基于互相关图的合并决策示例。在短时间间隔内出现非常显著且不对称的互相关（图8B）伴随着单位峰-峰值高度的差异以及相似的放电模式（图8E强烈表明这些峰电位来自同一个神经元。 图9 显示了一种缺乏相同类型合并证据的情况。此处，互相...

本文展示了如何使用 SpikeSorter 程序检测和分类使用多电极阵列进行的细胞外记录中的峰电位。

使用“SpikeSorter”对电生理记录进行分类的可视化指南

目前可用于对多电极阵列记录信号中的峰电位进行分类的独立软件应用程序较少。理想情况下，一个应用程序应当……

本视频的主要目标是向电生理学研究人员展示如何使用 SpikeSorter 程序检测和分类通过微电极阵列记录的神经组织胞外信号中的动作电位。我们的目标是提供一种操作简便的解决方案，通过具有用户友好界面的程序完成动作电位分类任务。SpikeSorter 可读取多种格式的文件，除分类和数据导出选项外，还提供多种预处理和事件检测策略。该技术的应用延伸至通过多电极阵列进行细胞外记录来研究神经活动领域。通常，初学者由于该任务的复杂性以及缺乏标准化的方法和客观验证手段，会面临操作困难。我们最初萌生这一方法的想法，源于在处理使用54通道多电极阵列所获得的记录数据时，遇到了缺乏现成解决方案的难题。开始此操作前，打开程序。依次点击“文件”和“打开”，然后在弹出的打开文件对话框右下角的下拉列表中选择录音文件格式。接着，选择文件并点击“打开”。读取完成后点击“确定”。此时记录信号将显示在电压波形显示区域中。如果记录信号未经过滤波且包含局部场电位，请点击工具栏上的滤波图标将其去除。选择高通巴特沃斯滤波器，设置合适的截止频率和极点数，然后点击“Do It”。点击“OK”，然后点击“done”，在显示界面中检查滤波后的波形。通过按住鼠标左键并拖动，可查看电压信号。使用滚轮放大特定特征，也可再次滚动以缩小视图。将鼠标悬停在特定波形点上，可在左上角显示相应的电压值。双击窗口将弹出一个对话框，可用于快速查看记录的任意部分，以及在完成事件检测与分类后，查看通道或簇中的特定事件。接下来，检查是否存在可能故障并需要屏蔽的通道。单击通道检查图标并查看图表。要屏蔽异常通道，可选择通道编号，或从问题列表中选择。完成后，关闭对话框，然后在提示中单击“是”以保存屏蔽值。被屏蔽的通道在电压显示中呈灰色。在此步骤中，进入预处理事件检测以调出事件检测对话框。使用右上角的滑块检查特定通道上的噪声水平。仔细检查电压显示，还可能发现需要屏蔽的静默或异常嘈杂的通道。选择可变阈值法进行事件检测。推荐的阈值范围为噪声的4.0至6.0倍。选择 4.5。从下拉列表中选择动态多相滤波检测方法。将窗口设置为典型峰电位波形宽度的一半左右，数值范围为 0.15 至 0.5 毫秒。然后，通过选择最能识别待分类峰电位中单一、时间上局域化特征的选项，来选定对齐方法。其余选项保持默认设置，点击“开始”。点击“完成”以退出对话框。电压波形窗口以灰色显示已分配至其中心通道的检测事件。可根据此时观察到的结果调整事件检测参数。例如，可使用较低的检测阈值重新运行事件检测，以检测到更多事件。下一步在常规分选前通常不会执行，但在首次进行分选或遇到不熟悉的数据时，执行此步骤非常有用。进入分选界面，将通道转换为簇，为每个未屏蔽的电极通道创建一个单独的簇，前提是假设每个通道都已分配了一些事件。通过进入审阅、查看、清理和拆分簇来检查这些簇，从而弹出另一个对话框。使用旋转控制选择要查看的簇。选择一个包含两个或更多明显子簇的簇，然后按下重新对齐按钮，以调整每个事件的时间，使其更贴合模板的形状。接着，按下自动分割按钮，根据主成分分布对事件进行聚类。随后，单击复选框以查看子簇中的波形。使用滑块控件检查相应的波形。作为练习，可使用其中一个较小的拆分按钮创建新簇并进行观察。注意，当绿色簇被分离后，红色簇现在更清晰地显示出两个亚簇。虽然可以继续以这种方式手动分选，但建议使用更快的自动分选（Autosort）程序。点击“完成”，然后进入“分选”→“自动分选”。如果事件检测已经完成（如此处所示），请保持跳过事件检测选项处于选中状态。如果不选中该选项，系统将自动运行事件检测，并使用从事件检测对话框继承的参数值和选项。在下方的聚类面板中，选择一个足够大的时间窗口，以完整包含对齐点之前和之后的整个动作电位波形。接下来，选择在聚类过程中使用的重新比对选项，并设定最小聚类大小。确定用于聚类的主成分（PC）空间的维度数，其余选项保持默认设置。随后，点击“开始”以启动自动聚类（Autosort）。自动分选完成后，点击“下一步”进入手动引导的合并与拆分阶段，然后点击“开始”。在新弹出的对话框中，系统将依次显示那些相似性不明确或差异不明显的聚类对。对于每一对呈现的聚类，请使用按钮选择是合并该聚类对、合并后再重新拆分、标记为不同，或标记为模糊（即无法确定最佳决策时）。单击复选框，以显示峰电位峰值高度或第一、第二主成分随时间变化的曲线图，或自相关与互相关直方图。这些图表可辅助进行判断。此处展示了一个合并判断的示例。随后进行合并与分割决策。如果合并与分割选项无法找到明显可分离的簇，请在弹出的对话框中使用滑块手动调整聚类参数，以找到一个看起来令人满意的分割结果。如果无法实现满意的分割，请使用“撤销”按钮返回至这两个簇的原始状态。完成后，按下所示的拆分（split）按钮。接着转到审阅（review）和后期处理（post-processing）界面，使用比对清理（alignment cleaning）按钮，移除与所属簇模板匹配度较差的事件。然后，使用重新聚类按钮，根据匹配值将未聚类的事件重新分配至特定模板。回收的事件将被标记为各父类簇的子类簇，并可通过“查看、清理与拆分类簇”对话框进行检查。除非被删除，这些事件将保留在类簇中，并按此状态导出。接下来，返回后处理对话框。使用删除按钮及其旁边的旋钮控件，删除信噪比低于所选阈值的簇。随后，使用排序按钮，根据选定的标准对簇重新编号。该图显示了进入“视图”后获得的已排序记录的波形显示结果。通常情况下，同一通道上某一对聚类的波形看起来完全相同，但“对比配对”对话框在主成分投影中仍会显示出不同的聚类。在完成前述排序步骤后，波形的幅度-时间图和互相关图有时可为合并决策提供参考。这说明了一种基于短时间间隔内存在显著非对称交叉相关性，并结合两个神经元第一主成分值之间明确关系（此处显示在纵轴上）的合并判断。本图展示了一种缺乏类似合并证据的情况：交叉相关图不具有明显非对称性，且自相关图存在差异。尽管波形形态相似，但由于主成分分布存在差异，这两种放电单元不应合并。本图展示了一种情况：当其中一个单元停止放电而另一个单元开始放电时，两者的波形形态相似，且第一主成分的数值相互重叠。在此情况下，是否合并的判断显得十分明确。我们希望本对 SpikeSorter 的简要介绍对您有所帮助。我们计划继续开发该程序，并在需要时添加新的功能。为此，我们欢迎提交错误报告、建设性反馈以及改进意见。

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