通过免疫共沉淀在核质馏分蛋白质相互作用的可视化和原位接近结扎分析

本实验的总体目标是比较免疫共沉淀 （co-ip） 和邻位连接测定 （PLA） 在不同细胞区室中可视化蛋白质相互作用的优缺点。这里介绍的两种不同方法的比较可以帮助科学家在研究细胞核和细胞质中蛋白质相互作用的分布模式时确定哪一种更适合他们的特定目的。co-ip 的主要优点是检测真实的蛋白质相互作用。

相比之下，PLA 的好处是可以在单细胞水平上快速分析研究所蛋白质蛋白质相互作用。根据文本方案生长和收获 hex293 细胞后，至 3 乘以 10 至第 6 个细胞，加入 300 微升冷细胞质提取液，并以最高速度涡旋细胞 15 秒。将提取物在冰上孵育 30 分钟，在孵育过程中每 10 分钟，将样品涡旋 5 秒钟。

然后加入 16.5 μL 冷细胞质提取溶液，涡旋 5 秒，并将样品在冰上孵育 5 分钟。涡旋提取物 5 秒钟，然后将样品在 16， 000 x g 和 4 摄氏度下离心 5 分钟。将上清液转移到新的预冷管中，将其放在冰上直至使用，然后使用 1 毫升冷 PBS 上下吹打洗涤不溶性沉淀 3 次，每次洗涤后去除 PBS。

接下来，加入 150 微升冷核提取液，涡旋 15 秒，并在冰上孵育 1 小时。在孵育过程中，每 10 分钟将样品涡旋 15 秒，并使用 200 微升吸头移液 10 次。涡旋试管 15 秒，将样品在 4 摄氏度下以 16， 000 x g 离心 10 分钟，然后将含有核提取物的上清液转移到新的预冷试管中，并保持在冰上直至使用。

去除 10% 各体积的细胞核和细胞质提取物作为输入，然后将冷 PBS 添加到剩余的提取物中，最终体积为 1 毫升。放在冰上直到使用。必要时，在预清除蛋白 g 偶联磁珠后，将 40 微升蛋白 g 偶联磁珠与 4 微克快速多克隆抗 RBM3 抗体或快速 IGG 混合在 200 微升 PBST 中作为阴性对照。

在旋转器上孵育至室温 40 分钟。将试管放在磁力架上，然后取出并丢弃 supernatent。然后用 200 微升 PBST 洗涤珠子一次。

向珠子中加入 1 毫升稀释的赖酸酯，并在旋转器上以 4 摄氏度孵育过夜。第二天，将试管放在磁力架上并吸出 supernatent。向珠子中加入 0.5 毫升 PBST，并在 4 摄氏度下用旋转器洗涤 3 次，以 20 rpm 的固定速度洗涤 10 分钟。

加入 40 μL 样品缓冲液从磁珠中洗脱蛋白质，然后在 70 摄氏度下加热样品 10 分钟。旋转珠子后，将液体转移到新的 1.5 毫升试管中。为了进行免疫细胞化学，将 HEK293 细胞以 1.5 倍 10 接种到八室聚地赖氨酸包被载玻片中每个腔室的四个细胞中。

在 0.4 毫升 DMEM 中，补充有 10%FPS 和每毫升 100 单位的 penstrep。将细胞在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育 48 小时，然后吸出培养基并使用 4% PFA 在室温下将细胞固定在层流罩中 10 分钟。然后吸出 PFA，每个腔室使用 0.5 毫升 PBS 洗涤细胞 3 次。

加入 0.5% tritonX100 与 5% NGS 和 PBS 以透化和封闭细胞，并在室温下孵育 1 小时。然后，在稀释 1 比 100 的抗 NF90 单克隆和抗 RBM3 多克隆一抗后，将一抗添加到孔中，并在摇床上于 4 摄氏度孵育过夜。第二天，使用 0.5 mL PBS 洗涤腔室 3 次，每次 10 分钟。

为了进行免疫细胞化学，向细胞中加入 1 比 500 稀释的绿色荧光染料偶联抗小鼠抗体和红色荧光染料偶联抗兔抗体，并在室温下孵育 1 小时。加入 1 比 5， 000 稀释的 DAPHE NBPS 对细胞核进行复染，并在室温下孵育 10 分钟，然后像以前一样用 PBS 洗涤样品。从载玻片上取下腔室并晾干，然后每个载玻片使用 250 微升封固剂进行安装。

为了制备试管邻位连接测定探针，在孵育细胞和一抗并按照刚刚演示的洗涤后，将预制探针在 0.1%tritonx100 和 5%NGS 和 PBS 中稀释 1 至 5，总体积为 320 微升，用于一个八室载玻片。将溶液在室温下孵育 20 分钟。从玻璃侧取下腔室并加入稀释的探针，然后将腔室在 37 摄氏度的湿度培养箱中孵育 1 小时。

通过混合 8 μL 连接酶、64 μL 5x 连接原液和 248 μL 水来制备连接溶液。轻弹玻片上的液体，然后使用 onex 洗涤缓冲液 A 洗涤样品两次，每次 5 分钟。将连接溶液添加到样品中，并在 37 摄氏度的湿度培养箱中孵育 30 分钟。

通过混合 4 μL 聚合酶、64 μL 5x 扩增原液和 252 μL 水来制备扩增溶液，并用箔纸包裹试管以避光。然后，轻拍玻片上的液体，并使用 1 x 洗涤缓冲液 A 洗涤样品两次，每次 2 分钟。将扩增溶液添加到样品中，并在 37 摄氏度下在黑暗潮湿的培养箱中孵育 100 分钟。

然后像以前一样敲掉液体后，在洗涤缓冲液 B 中洗涤样品两次，每次 10 分钟，然后在 0.1 x 洗涤缓冲液 B 中洗涤一次，最后，干燥载玻片并用 250 微升含 DAPHE 的商业封固剂封固样品，在显微镜下检查荧光，并使用 CCD 相机采集图像。以 RBM3 作为诱饵蛋白的免疫共沉淀实验显示，NF90-RBM3 相互作用主要存在于细胞核中，少数存在于细胞质中。在这个免疫荧光实验中，NF90 和 RBM3 都在细胞核中可见。

两种蛋白质也存在于 C2 的细胞质中，并且两种蛋白质在每个区室中都显示出完美的共定位。从这些图像中可以看出，邻位连接测定揭示了 NF90-RBM3 相互作用的模式，这与常规免疫细胞化学非常相似，后者的大多数相互作用发生在大多数细胞的细胞核中。只有一小部分细胞主要表现出 NF90-RBM3 相互作用的细胞质分布。

在尝试此过程时，重要的是要记住，虽然更方便，但 PLA 并不直接反映蛋白质蛋白质相互作用。相反，co-ip 会检测定向交互。此外，一抗的特异性决定了结果的质量。

看完这个视频，你应该对如何根据自己的实验目的选择合适的方法来研究不同细胞区室中的蛋白质相互作用有一个很好的了解。