使用流式细胞分选与含内参标准品的qPCR进行单细胞基因表达谱分析

本实验的总体目标是利用带有内参标准的微流控qPCR技术，对单个细胞中的mRNA水平进行定量。该方法有助于回答单细胞生物学领域中的关键问题，例如不同细胞群体在受到刺激时是否表现出特征性的差异响应。该技术的主要优势在于，与RNA荧光原位杂交（RNA FISH）相比，它可检测更多基因的表达，且在单细胞中进行测定时的成本低于RNA测序（RNA-Seq）。

我们最初是在探索通过微流控qPCR技术测量单细胞基因表达的实验方案时，产生了这种方法的想法。我们希望改进现有方法，以更准确地估算单个细胞中不同转录本的绝对数量。细胞分选实验操作将由William Telford进行演示，他是我实验室所使用的流式细胞术平台的负责人。

根据文本方案扩增并纯化目的基因的扩增子后，将每种纯化后的扩增子各18微升加入一个2.0毫升低吸附微量离心管中，然后加入DNA悬浮缓冲液至总体积为1,800微升，使每种扩增子的浓度为每微升5 × 10⁶个分子。充分涡旋混匀5e6标准品，并将其分装至低吸附PCR管中，每管20微升。根据文本方案接种MCF7 p53-Venus细胞后，向细胞中加入400纳克/毫升的新制癌菌素，分别处理3、8.5、14或24小时。

配制裂解缓冲液时，混合本表中列出的试剂。取92.4 µL缓冲液转移至另一试管中，作为扩增子标准品的裂解缓冲液；剩余的裂解缓冲液用于细胞样本。

根据文本方案，制备大肠杆菌DNA并将其加入细胞裂解缓冲液中。为制备标准品，标记六个低吸附离心管。向5e5管中加入90微升DNA悬浮缓冲液。

向其余五个试管中各加入90微升缓冲液，缓冲液中含有每微升6.2皮克的大肠杆菌DNA，并将所有试管保持在冰上。从储存中取出一份5e6标准品后，短暂涡旋混匀试管，然后离心，确保液体位于试管底部；接着使用低吸附枪头，向5e5试管中加入10微升5e6标准品。涡旋混匀，离心后将试管放回冰上。

接下来，从5e5管中吸取10微升液体加入5e4管中，短暂涡旋混匀，离心，然后将管子放回冰上。依次对每管进行系列稀释，每管接收来自前一管的10微升液体，直至所有试管均完成标准稀释。在准备好含有裂解缓冲液的PCR管后，使用12通道移液器将一排PCR管中的9微升细胞裂解缓冲液分别加入PCR板前七行的每个孔中。

向96孔板最后一行的每个孔中加入7微升标准裂解缓冲液，然后使用低吸附枪头，根据孔板图将2微升标准品加入底部行的每个孔中。向10个细胞和100个细胞的孔中各加入2微升浓度为3.1皮克/微升的大肠杆菌DNA，再向无细胞孔中各加入2微升浓度为6.2皮克/微升的大肠杆菌DNA。将荧光激活细胞分选仪设置为按照孔板图分选至96孔板后，为校准仪器，密封一个空的PCR板，并使用测试液流将液滴和PBS分选至该空板的密封膜上。

如果液滴未落在正确位置，需将其从密封膜表面擦拭干净，根据仪器制造商的说明重新校准细胞分选仪，并重复操作直至分选流中的液滴正确沉积。通过胰酶消化收集细胞，并将其重悬于含2% FBS的0.5毫升PBS中，然后转移至流式细胞管。进行细胞分选时，将含有细胞悬液的管子插入细胞分选仪，打开裂解缓冲液板上的密封膜，根据板图小心地将目标细胞分选至孔板中。

为确保单细胞以最高纯度分选，需将仪器设置为单细胞模式，并根据前向散射光和侧向散射光进行标准流式细胞术设门。运行结束后，使用新的无菌热封膜密封反应板，在4°C条件下以400 × g离心1分钟，随后将反应板放入热循环仪中，运行预先设置好的RT-STA程序。完成RT-STA反应的反应板离心后，使用12通道移液器将3.6 µL稀释的外切酶I加入反应板的每个孔中。

密封微孔板并短暂离心，然后将微孔板放入热循环仪中，运行exo I程序。为检测每个样本中管家基因的表达水平，使用选定的管家基因之一的引物，配制900微升DNA结合染料qPCR预混液，用于96个反应。将9微升预混液分配至96孔PCR板的每孔中，然后从样本板中取1微升样本加入PCR板对应的孔中。

使用实时荧光定量PCR仪，按照预混试剂生产商推荐的热循环程序或标准程序运行PCR反应，然后分析样品，并根据文本方案制作样品混合物的板图。标记一块96孔PCR板用于样品混合物，随后使用八通道移液器将3.3 µL的预混试剂与样品上样混合液加入至该PCR板的每个孔中。对于每块样品PCR板，先涡旋震荡10秒，再以500 ×g离心10秒。

取下盖子，将每个阳性单细胞样本的 2.7 微升转移至样品混合板上对应孔中，这些孔的位置已在板图中注明为单细胞孔。撕下新的微流控 qPCR 芯片底部的贴纸，然后使用仍带帽的控制液注射器，下压每个蓄液池弹簧使其松动，并向每个蓄液池注入 100 至 200 微升的控制液。将芯片插入加载仪中并运行预润脚本，随后使用八通道移液器将每种检测混合液的 4.5 微升转移至微流控 qPCR 芯片的左侧。

必须避免在孔板底部产生气泡，否则会导致上样问题。为防止此情况，应将移液枪头接触孔壁一侧，然后仅按至第一档位进行移液。

将每份样本混合物各取4.5微升转移至微流控qPCR芯片的右侧，然后将芯片插入加载仪中并运行加载混合物程序。加载混合物程序完成后，检查芯片上是否存在横贯线条，此类线条可能提示加载异常；随后使用胶带小心去除芯片表面的任何灰尘颗粒，再将芯片插入微流控实时PCR仪中并运行数据采集程序。最后，按照文本方案中的说明分析数据。

该图显示了通过qPCR检测的看家基因表达水平，用于确定哪些孔中加入了单个细胞。含有细胞的样品具有较低的CT值，而无细胞的样品CT值则显著较高。

扩增子标准品的孔位应显示出均匀间隔的扩增曲线。无细胞、10个细胞和100个细胞的孔位曲线之间也应有明显区分。代表实际细胞的种子DNA样品从多个分选后的96孔板中精心挑选，并合并至单个孔板中，以准备进行微流控qPCR。

该热图总结了微流控 qPCR 的结果。每列中的颜色变化显示了不同细胞之间每个基因表达的差异性。颜色明显深于其他行的两行很可能代表不合格的样本。

在进行该实验操作时，保持工作区域无RNase和无DNA污染至关重要，尤其是在配制标准品和裂解缓冲液时。本实验方案的PCR前步骤对污染非常敏感。观看本视频后，您应能够充分掌握如何在单个细胞中定量多个目的基因的表达水平。

完成此操作后，可进行其他方法，如单分子RNA FISH，以验证单个细胞中mRNA丰度的测量结果。