Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

该程序的总体目标是使用内标微流控 qPCR 定量单个细胞中 mRNA 的水平。这种方法可以帮助回答单细胞生物学领域的关键问题，例如细胞群是否以特征不同的方式对刺激做出反应。该技术的主要优点是它可以在单个细胞中以比 RNA-Seq 更低的成本测量比 RNA FISH 更多的基因表达。

当我们探索通过微流体 qPCR 测量单细胞中基因表达的方案时，我们第一次想到了这种方法。我们想修改现有方法，以更准确地估计单个细胞中不同转录本的绝对数量。演示细胞分选程序的是 William Telford，他是我实验室使用的流式细胞术设施的经理。

根据文本方案从目标基因生成和纯化扩增子后，将 18 微升每个纯化的扩增子混合在 2.0 毫升低结合微量离心管中，然后加入高达 1， 800 微升的 DNA 悬浮缓冲液，使每个扩增子的浓度为每微升 10 至 6 个分子的五倍。彻底涡旋 5e6 标准品，并将其分成 20 微升等分试样，装在低结合力 PCR 管中。根据文本方案接种 MCF7 p53-Venus 细胞后，向细胞中加入每毫升 400 纳克新卡他汀，并处理 3、8.5、14 或 24 小时。

要制备裂解缓冲液，请混合此表中列出的试剂。将 92.4 μL 缓冲液转移到单独的试管中，作为扩增子标准品的裂解缓冲液。剩余的裂解缓冲液将用于细胞。

根据文本方案，准备大肠杆菌 DNA 并将其添加到细胞的裂解缓冲液中。要制备标准品，请标记 6 个低结合力离心管。向 5e5 管中加入 90 μL DNA 悬浮缓冲液。

向其他 5 个试管中加入 90 μL（每微升含有 6.2 pg 大肠杆菌 DNA）的缓冲液，并将所有试管置于冰上。从储存中取出等分试样 5e6 标准品后，短暂涡旋试管，然后旋转以确保液体位于试管底部，然后使用低结合力移液器吸头，向 5e5 试管中加入 10 微升 5e6 标准品。涡旋、旋转并将试管放回冰上。

接下来，从 5e5 试管中吸取 10 微升到 5e4 试管中，然后短暂涡旋试管，旋转，然后将试管放回冰上。对每个试管重复连续稀释，从前一个试管中接收 10 μL，直到所有试管都稀释了标准品。用裂解缓冲液制备 PCR 管后，使用 12 通道移液器，将 9 微升细胞裂解缓冲液从 PCR 管行分配到 PCR 板前 7 行的每个孔中。

将 7 微升标准裂解缓冲液分配到板最后一行的每个孔中，然后使用低结合移液器吸头，根据板图向底行的每个孔中加入 2 微升标准液。向 10 个细胞孔和 100 个细胞孔中加入 2 微升每微升 3.1 皮克的大肠杆菌 DNA，然后将每微升 2 微升 6.2 皮克的大肠杆菌 DNA 加入到无细胞孔中。对荧光激活细胞分选仪进行编程后，根据板图分选到 96 孔板中，瞄准机器，密封空 PCR 板，并使用测试流将液滴和 PBS 分选到空板的密封件上。

如果液滴没有落在正确的位置，请将其从密封件表面擦掉，根据机器制造商的说明重新校准细胞分选仪，然后重复，直到分选流中的液滴正确沉积。通过胰蛋白酶消化收获细胞，并将其重悬于 0.5 毫升含 2% FBS 的 PBS 中，然后转移到流式细胞仪管中。要对细胞进行分选，请将带有细胞悬液的试管插入细胞分选仪中，打开裂解缓冲液板上的密封，然后根据板图将感兴趣的细胞小心地分选到板中。

为确保以最高纯度分选单个细胞，请在单细胞模式下运行机器，并使用基于前向和侧向散射的标准流式细胞术门控。运行后，使用新的无菌热封密封板，并以 400 倍 g 离心 4 摄氏度 1 分钟，然后将板放入热循环仪中并运行先前准备好的 RT-STA 程序。离心完成的 RT-STA 板后，使用 12 通道移液器将 3.6 微升稀释的核酸外切酶 I 分配到板的每个孔中。

密封并短暂旋转板，然后将板放入热循环仪中并运行 exo I 程序。为了测量每个样品中的看家基因表达，使用来自所选看家基因之一的引物准备 900 μL DNA 结合染料 qPCR 预混液，用于 96 次反应。将 9 微升预混液分配到 96 孔 PCR 板的每个孔中，然后从样品板中加入 1 微升样品到 PCR 板的相应孔中。

使用预混液制造商建议的热循环方案或遵循标准方案在实时 PCR 机器上运行板，然后分析样品并根据文本方案制作样品混合物板图。标记板样品混合物，然后使用八通道移液器将 3.3 μL 预混液样品加载试剂混合物分配到 96 孔 PCR 板的每个孔中。对于每个样品的 PCR 板，涡旋板 10 秒，然后以 500 次 g 离心 10 秒。

取下盖子，将 2.7 微升每个阳性单细胞样品转移到样品混合板上的相应孔中，用于板图上指示的单细胞孔。撕下新微流体 qPCR 芯片底部的贴纸，然后在盖子仍然打开的情况下使用控制管路液体注射器，按下每个蓄能器弹簧以将其松开，并为每个蓄能器注入 100 至 200 微升控制管路液体。将芯片插入加载机并运行 prime 脚本，然后使用八通道移液器将 4.5 微升每种检测混合物转移到微流体 qPCR 芯片的左侧。

避免在井底产生气泡至关重要。这将产生加载问题。为防止这种情况，请将移液器吸头触碰孔的侧面，然后仅移液至第一个停止点。

将 4.5 微升每种样品混合物转移到微流体 qPCR 芯片的右侧，然后将芯片插入加载机并运行加载混合物脚本。加载混合脚本完成后，验证芯片上没有线条，这表明存在加载问题，然后使用胶带小心地去除芯片上的任何灰尘颗粒，然后将芯片插入微流体实时 PCR 机器并运行数据收集脚本。最后，根据文本协议分析数据。

该图显示了通过 qPCR 测量的看家基因的表达水平，以确定哪些孔接收了单个细胞。接收细胞的样本的 CT 值较低。没有细胞的样本的 CT 值要高得多。

扩增子标准品的孔应显示均匀分布的扩增曲线。无细胞、10 细胞和 100 细胞孔的曲线中也应有明显的分离。从多个分选的 96 孔板中挑选代表实际细胞的种子 DNA 样品，并合并到一个板中，以制备微流体 qPCR。

此热图总结了微流体 qPCR 结果。每列中的颜色变化显示了不同细胞之间每个基因表达的变异性。比其他行暗得多的两行很可能代表不良样本。

在尝试此程序时，请务必保持工作区域不含 RNase 和 DNA，尤其是在制备标准品和裂解缓冲液时。该方案的 pre-PCR 部分对污染敏感。观看此视频后，您应该对如何定量单个细胞中多个目标基因的表达有很好的了解。

按照此程序，可以执行其他方法，如单分子 RNA FISH 来验证单细胞中 mRNA 丰度的测量。