Name: 单细胞基因表达谱使用流式细胞仪和qPCR内部标准 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: 学习使用流式细胞仪和微流控qPCR技术对单个哺乳动物细胞进行分选，并通过内部标准品实现多达96个靶基因的绝对定量分析。该方法为单细胞生物学研究提供了成本效益高且准确的基因表达检测方案。

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我们感谢CCR ETIB流式细胞术核心实验室的V. Kapoor在本方案开发过程中协助进行细胞分选。我们还感谢CCR LP分子诊断组的M. Raffeld、NHLBI DNA测序与基因组核心实验室的J. Zhu在本方案开发过程中协助完成qPCR实验。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）院内研究计划资助。

<ol><li>Feinerman, O., Veiga, J., Dorfman, J. R., Germain, R. N., Altan-Bonnet, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variability+and+Robustness+in+T+Cell+Activation+from+Regulated+Heterogeneity+in+Protein+Levels%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Variability and Robustness in T Cell Activation from Regulated Heterogeneity in Protein Levels.</a> Science. 321 (5892), 1081-1084 (2008).</li>
<li>Spencer, S. L., Gaudet, S., Albeck, J. G., Burke, J. M., Sorger, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-genetic+origins+of+cell-to-cell+variability+in+TRAIL-induced+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Non-genetic origins of cell-to-cell variability in TRAIL-induced apoptosis.</a> Nature. 459 (7245), 428-432 (2009).</li>
<li>Geva-Zatorsky, N., Rosenfeld, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oscillations+and+variability+in+the+p53+system%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">Oscillations and variability in the p53 system.</a> Mol. Syst. Biol. 2 (1), (2006).</li>
<li>Colman-Lerner, A., Gordon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+cell-to-cell+variation+in+a+cell-fate+decision+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Regulated cell-to-cell variation in a cell-fate decision system.</a> Nature. 437 (7059), 699-706 (2005).</li>
<li>Chong, S., Chen, C., Ge, H., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+Transcriptional+Bursting+in+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanism of Transcriptional Bursting in Bacteria.</a> Cell. 158 (2), 314-326 (2014).</li>
<li>Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+mRNA+Synthesis+in+Mammalian+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Stochastic mRNA Synthesis in Mammalian Cells.</a> PLoS Biol. 4 (10), e309+(2006).</li>
<li>Senecal, A., Munsky, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+Factors+Modulate+c-Fos+Transcriptional+Bursts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Transcription Factors Modulate c-Fos Transcriptional Bursts.</a> Cell Rep. 8 (1), 75-83 (2014).</li>
<li>Dey, S. S., Foley, J. E., Limsirichai, P., Schaffer, D. V., Arkin, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthogonal+control+of+expression+mean+and+variance+by+epigenetic+features+at+different+genomic+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">Orthogonal control of expression mean and variance by epigenetic features at different genomic loci.</a> Mol. Syst. Biol. 11 (5), 806+(2015).</li>
<li>Dar, R. D., Razooky, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+burst+frequency+and+burst+size+are+equally+modulated+across+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Transcriptional burst frequency and burst size are equally modulated across the human genome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (43), 17454-17459 (2012).</li>
<li>Thattai, M., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+gene+expression+in+fluctuating+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Stochastic gene expression in fluctuating environments.</a> Genetics. 167 (1), 523-530 (2004).</li>
<li>Porter, J. R., Fisher, B. E., Batchelor, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+Pulses+Diversify+Target+Gene+Expression+Dynamics+in+an+mRNA+Half-Life-Dependent+Manner+and+Delineate+Co-regulated+Target+Gene+Subnetworks%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Syst%22%5BJournal%5D)">p53 Pulses Diversify Target Gene Expression Dynamics in an mRNA Half-Life-Dependent Manner and Delineate Co-regulated Target Gene Subnetworks.</a> Cell Syst. 2 (4), 272-282 (2016).</li>
<li>Lahav, G., Rosenfeld, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+the+p53-Mdm2+feedback+loop+in+individual+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Dynamics of the p53-Mdm2 feedback loop in individual cells.</a> Nat. Genet. 36 (2), 147-150 (2004).</li>
<li>Levine, A. J., Oren, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+first+30+years+of+p53%3A+growing+ever+more+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The first 30 years of p53: growing ever more complex.</a> Nat. Rev. Cancer. 9 (10), 749-758 (2009).</li>
<li>Riley, T., Sontag, E., Chen, P., Levine, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+control+of+human+p53-regulated+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional control of human p53-regulated genes.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (5), 402-412 (2008).</li>
<li>Ye, J., Coulouris, G., Zaretskaya, I., Cutcutache, I., Rozen, S., Madden, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer-BLAST%3A+A+tool+to+design+target-specific+primers+for+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinf%22%5BJournal%5D)">Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction.</a> BMC Bioinf. 13 (1), 134(2012).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma-Aldrich/General_Information/1/pcr-technologies-guide.pdf">PCR Technologies: A Technical Guide</a>. , Sigma-Aldrich. St. Louis, MO. (2014).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory+Manual%22">Molecular Cloning: A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2001).</li>
<li>Batchelor, E., Mock, C. S., Bhan, I., Loewer, A., Lahav, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recurrent+initiation%3A+a+mechanism+for+triggering+p53+pulses+in+response+to+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Recurrent initiation: a mechanism for triggering p53 pulses in response to DNA damage.</a> Mol. Cell. 30 (3), 277-289 (2008).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Flow+Cytometry%3A+Principles+and+Applications%22">Flow Cytometry: Principles and Applications</a>. , Humana Press. Totowa, NJ. (2007).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Real-time+PCR%22">Real-time PCR</a>. , Taylor & Francis. (2006).</li>
<li>Song, L., Langfelder, P., Horvath, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+co-expression+measures%3A+mutual+information%2C+correlation%2C+and+model+based+indices%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinf%22%5BJournal%5D)">Comparison of co-expression measures: mutual information, correlation, and model based indices.</a> BMC Bioinf. 13 (1), 328(2012).</li>
<li>Margolin, A. A., Nemenman, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ARACNE%3A+An+Algorithm+for+the+Reconstruction+of+Gene+Regulatory+Networks+in+a+Mammalian+Cellular+Context%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinf%22%5BJournal%5D)">ARACNE: An Algorithm for the Reconstruction of Gene Regulatory Networks in a Mammalian Cellular Context.</a> BMC Bioinf. 7 (Suppl 1), (2006).</li>
<li>Haff, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+quantitative+PCR+using+nested+primers%5BTitle%5D)+AND+%22PCR+Methods+Appl%22%5BJournal%5D)">Improved quantitative PCR using nested primers.</a> PCR Methods Appl. 3 (6), 332-337 (1994).</li>
<li>Hashimshony, T., Senderovich, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CEL-Seq2%3A+sensitive+highly-multiplexed+single-cell+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">CEL-Seq2: sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq.</a> Genome Biol. 17, 77(2016).</li>
<li>Ronander, E., Bengtsson, D. C., Joergensen, L., Jensen, A. T. R., Arnot, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Single-cell+Gene+Transcription+by+RNA+Fluorescent++In+Situ+Hybridization+%28FISH%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH).</a> J. Vis. Exp. (68), e4073(2012).</li>
<li>Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+individual+mRNA+molecules+using+multiple+singly+labeled+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.</a> Nat. Methods. 5 (10), 877-879 (2008).</li>
<li>Lubeck, E., Cai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+systems+biology+by+super-resolution+imaging+and+combinatorial+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-cell systems biology by super-resolution imaging and combinatorial labeling.</a> Nat. Methods. 9 (7), 743-748 (2012).</li>
<li>Battich, N., Stoeger, T., Pelkmans, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-based+transcriptomics+in+thousands+of+single+human+cells+at+single-molecule+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Image-based transcriptomics in thousands of single human cells at single-molecule resolution.</a> Nat. Methods. 10 (11), 1127-1133 (2013).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

我们介绍了一种从培养的贴壁细胞群体中分离单个哺乳动物细胞，并对每个细胞中约96个基因的表达进行检测的方法。充分的前期准备对该方法的成功实施至关重要。特别是，针对目标转录本设计并验证特异性引物对（步骤1.2–1.3）虽然耗时，但极为关键，因为引物质量直接决定单细胞检测结果的可靠性。一旦获得可靠的引物对，即可用于扩增目标转录本的cDNA；随后将扩增产物等摩尔混合，制备成标准品（步骤1.4）。此步骤至关重要，因为标准品用于估算转录本的绝对拷贝数；标准品应一次性制备，分装保存，并用于后续所有细胞分选和基因表达检测实验。同样，在细胞分选当天，使用低吸附性移液器吸头和微量离心管精确稀释标准品，以制备含有9 µl裂解缓冲液的PCR板（步骤3.7和3.11），尤为关键。校准细胞分选仪（步骤4.2）是另一个关键步骤；必须仔细操作，以确保细胞能够准确落入PCR板中含9 µl裂解缓冲液的指定孔位。
该实验方案可根据多种研究需求进行若干修改。本文重点介绍基于DNA结合染料的qPCR方法，该方法为基因表达定量提供了一种相对经济的手段。然而，这种方法可能产生较高的背景信号，因为任何扩增出的DNA（包括非靶序列...

同一细胞群体中的单个细胞对一致的生理刺激可能表现出显著不同的反应1,2,3,4。细胞群体中遗传差异是导致反应多样性的机制之一，但即使在克隆性细胞群体中，也存在多种非遗传因素可增加反应的变异性。例如，单个蛋白质及其他重要信号分子的水平可在单细胞间存在差异，从而导致下游基因表达谱的差异。此外，基因激活可能以短时间的转录脉冲形式发生5,6，每次脉冲可能仅产生相对少量的转录本7,8,9。这种基因激活的随机性可显著促进生物反应的变异性，并在微生物10以及对生理刺激作出响应的哺乳动物细胞1,2中提供选择优势。由于遗传和非遗传因素共同导致的变异，单个细胞在刺激下的基因表达谱可能与通过群体反应测量获得的平均基因表达谱显著不同。要确定单个细胞在刺激下表现出多大程度的反应变异性，需要采用单细胞分离技术、目标转录本表达水平的检测方法，以及对所得表达数据进行计算分析。
有多种方法可用于检测单细胞中的基因表达，这些方法在成本、检测的转录本数量以及定量准确性方面差异较大。例如，单细胞RNA测序（single-cell RNA-Seq）能够实现广泛的转录本覆盖深度，并可对单个细胞中高表达基因的数千种不同转录本进行定量；然而，达到如此深度测序所需的成本可能过高，尽管该成本仍在持续下降。相比之下，单分子RNA荧光原位杂交（single-molecule RNA fluorescence 原位 单分子RNA原位杂交（smRNA FISH）能够在合理控制每个目标基因检测成本的前提下，对低表达基因的转录本进行精确定量；然而，该方法在单个细胞中可检测的目标基因数量有限。本方案所述的基于定量PCR（qPCR）的检测技术，在上述方法之间提供了一种折中方案。该技术利用微流控实时PCR仪，可同时对最多96个细胞中的多达96种目标转录本进行定量。尽管上述各种方法均需配备相应的硬件设备，但单次qPCR检测的成本相对较低。本方案改编自某微流控实时PCR仪制造商建议的方案（Protocol ADP 41, Fluidigm）。为了在基于PCR的方法中实现对每种转录本绝对拷贝数的估算，我们对该方案进行了扩展，引入了预先制备的目标基因扩增子作为内参对照，可在多个实验中重复使用。
作为该技术的一个示例，本文描述了在MCF-7人乳腺癌细胞中对肿瘤抑制因子p53调控的基因表达水平进行定量分析的方法11。实验中使用一种可诱导DNA双链断裂的化学试剂处理细胞。先前的研究表明，p53对DNA双链断裂的响应在单个细胞中表现出高度异质性，不仅体现在p53蛋白水平上12，也表现在不同靶基因的激活模式上11。此外，p53调控超过100个已被充分表征的靶基因，这些基因参与多种下游通路，包括细胞周期阻滞、凋亡和细胞衰老13,14。由于每个细胞中p53介导的响应既复杂又具有变异性，因此对该系统的分析受益于一种可在单细胞水平同时检测近100个靶基因的方法，如下文所述。通过稍作修改（例如采用不同的单细胞分离与裂解方法），该实验方案可轻松适用于多种哺乳动物细胞类型、转录本及细胞应答的研究。
通过适当的前期准备，按照本方案可在三天内完成一轮细胞分选及基因表达检测。建议时间安排如下：提前选择感兴趣的转录本，鉴定并验证可扩增这些转录本cDNA的引物对，并使用这些引物制备标准品和引物混合液。第1天，在细胞处理后，收集并分选细胞，进行逆转录和特异性靶标扩增，并用外切核酸酶处理样本以去除未掺入的引物。第2天，利用qPCR对分选后的细胞进行质量控制。最后，在第3天，通过微流控qPCR技术测定分选细胞中的基因表达水平。图1总结了所涉及的步骤。

<table><tbody><tr><td>RNeasy Plus Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td></td></tr><tr><td>高容量cDNA反转录试剂盒（含RNase抑制剂）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>4374966</td><td></td></tr><tr><td>Phusion高保真DNA聚合酶</td><td>New England BioLabs</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick 琼脂糖凝胶回收试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT 高灵敏度 dsDNA 检测试剂盒</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>Q33120&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>2.0 ml 低吸附微量离心管</td><td>USA Scientific</td><td>1420-2600</td><td></td></tr><tr><td>DNA悬浮缓冲液</td><td>Teknova</td><td>T0221</td><td></td></tr><tr><td>Axygen 0.2 ml 最大回收薄壁 PCR 管</td><td>康宁</td><td>PCR-02-L-C</td><td></td></tr><tr><td>GE 96.96 动态阵列 DNA 结合染料样本 &amp;amp; 检测上样试剂盒</td><td>Fluidigm</td><td>100-3415</td><td></td></tr><tr><td>HyClone RPMI 1640 培养基</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30027.01</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清，经认证（美国）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>抗生素-抗真菌素溶液</td><td>康宁</td><td>30-004-CI</td><td></td></tr><tr><td>Neocarzinostatin</td><td>Sigma</td><td>N9162</td><td></td></tr><tr><td>ELIMINase</td><td>Decon Labs</td><td>1101</td><td></td></tr><tr><td>SUPERase-In</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>AM2696</td><td></td></tr><tr><td>CellsDirect 一步法 qRT-PCR 试剂盒</td><td>ThermoFisher</td><td>11753500</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; DNA</td><td>Affymetrix</td><td>14380 10 MG</td><td></td></tr><tr><td>ThermalSeal 封口膜，无菌</td><td>Excel Scientific</td><td>STR-THER-PLT</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria IIu</td><td>BD 生物科学</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HyClone 胰蛋白酶 0.05%</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30236.01</td><td></td></tr><tr><td>PBS，1×</td><td>康宁</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 40 &amp;micro;m细胞筛</td><td>康宁</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Exonuclease I</td><td>New England BioLabs</td><td>M0293S</td><td></td></tr><tr><td>SsoFast EvaGreen Supermix（含低ROX）</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>172-5210</td><td></td></tr><tr><td>96.96 动态阵列 IFC 基因表达芯片（微流控 qPCR 芯片）</td><td>Fluidigm</td><td>BMK-M-96.96</td><td></td></tr><tr><td>IFC 控制器 HX（上样仪）</td><td>Fluidigm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioMark 或 BioMark HD（微流控 qPCR 仪器）</td><td>Fluidigm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>实时荧光定量 PCR 分析软件&amp;nbsp;</td><td>Fluidigm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB 软件</td><td>MathWorks</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

使用流式细胞分选与含内参标准品的qpcr进行单细胞基因表达谱分析

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

从细胞群体中进行的基因表达测量可能会掩盖群体内单个细胞之间显著的转录组异质性。单细胞基因表达测量有助于评估基因表达中的噪声作用，识别成对基因表达之间的相关性，并揭示对刺激产生不同反应的细胞亚群。本文描述了一种从组织培养中生长的群体中分离出的单个哺乳动物细胞内检测多达96个基因表达水平的实验流程。通过荧光激活细胞分选（FACS）将细胞分选至裂解缓冲液中，随后对目标mRNA进行逆转录和扩增。然后使用微流控实时PCR仪检测基因表达，该仪器可同时对多达96个样本中的每个样本进行多达96个qPCR检测。我们还介绍了PCR扩增产物标准品的制备与使用方法，以实现对每种转录本绝对数量的估算。与其他单细胞基因表达检测方法相比，该方法能够比RNA FISH检测更多种类的转录本，且成本低于RNA-Seq。

本方案的总体概述见图1，包括细胞处理、通过FACS分离单个细胞、从单细胞裂解液中构建并进行cDNA文库的预扩增、在分选后的孔中确认单细胞cDNA文库，以及通过qPCR检测基因表达水平。
在进行单细胞分离和基因表达分析之前，必须首先为每个目标基因确定有效的寡核苷酸引物对。图2展示了两种引物质量控制方法的示例。在使用待测引物对进行qPCR后，生成熔解曲线。有效引物产生的熔解曲线呈单一峰形（图2A，绿色曲线）。若出现多个峰（图2A，蓝色曲线）或具有明显肩峰的曲线（图2A，红色曲线），则表明存在多个PCR产物，此时应重新设计引物。作为第二种质量控制方法，可通过琼脂糖凝胶电泳直观验证每个测试引物对是否产生唯一且大小正确的条带（图2B）。若出现多个条带或条带大小不...

我们介绍一种用于分选单个哺乳动物细胞并量化每个细胞中多达96个目标基因表达水平的方法。该方法包括使用内部qPCR标准品，以实现对转录本绝对拷贝数的估算。

使用流式细胞分选与含内参标准品的qPCR进行单细胞基因表达谱分析

来自细胞群体的整体基因表达测量可能会掩盖其中单个细胞之间显著的转录组异质性。

本实验的总体目标是利用带有内参标准的微流控qPCR技术，对单个细胞中的mRNA水平进行定量。该方法有助于回答单细胞生物学领域的一些关键问题，例如细胞群体在受到刺激时是否表现出特征性的不同反应方式。该技术的主要优势在于，与RNA原位杂交（RNA FISH）相比，它能够检测更多基因的表达，且在单细胞水平上比RNA测序（RNA-Seq）成本更低。我们最初是在探索通过微流控qPCR技术在单细胞水平上检测基因表达的实验方案时，产生了这种方法的想法。我们希望改进现有方法，以更准确地估算单个细胞中不同转录本的绝对数量。细胞分选实验操作将由我实验室所使用的流式细胞术平台负责人William Telford进行演示。根据文本方案对目的基因进行扩增子的生成与纯化后，取每种纯化后的扩增子各18微升，加入至一个2.0毫升低吸附微量离心管中，随后加入DNA悬浮缓冲液至总体积达到1,800微升，使每种扩增子的浓度均为每微升5×10⁶个分子。充分涡旋混匀5e6标准品，并将其分装至低吸附PCR管中，每管20微升。根据文本方案接种MCF7 p53-Venus细胞后，向细胞中加入400纳克/毫升的新制癌菌素，分别处理3、8.5、14或24小时。配制裂解缓冲液时，混合本表中列出的试剂。取92.4 µL缓冲液转移至另一离心管中，作为扩增子标准品的裂解缓冲液。剩余的裂解缓冲液用于细胞样本。按照文本方案，将大肠杆菌 DNA 加入细胞裂解缓冲液中。为制备标准品，标记六个低吸附离心管。向 5e5 管中加入 90 微升 DNA 悬浮缓冲液。向其余五个试管中各加入 90 微升缓冲液，缓冲液中含有 6.2 皮克/微升的大肠杆菌 DNA，并将所有试管置于冰上。从储存液中取出一份 5e6 标准品后，先短暂涡旋混匀试管，然后离心，确保液体位于试管底部；接着使用低吸附枪头，向 5e5 管中加入 10 微升的 5e6 标准品。涡旋混匀，离心后将试管放回冰上。接下来，从5e5管中吸取10微升加入5e4管中，短暂涡旋混匀，离心，然后将管放回冰上。依次对每管进行系列稀释，每管从前一管接收10微升，直至所有管中均完成标准稀释。在准备含有裂解缓冲液的PCR管后，使用12通道移液器，将PCR管排中的9微升细胞裂解缓冲液分别加入PCR板前七行的每个孔中。向96孔板最后一行的每个孔中加入7微升标准裂解缓冲液，然后使用低吸附枪头，根据板图将2微升标准品加入底部行的各个孔中。向“10个细胞”和“100个细胞”孔中各加入2微升浓度为3.1皮克/微升的大肠杆菌DNA，再向“无细胞”孔中各加入2微升浓度为6.2皮克/微升的大肠杆菌DNA。将荧光激活细胞分选仪编程为按照板图分选至96孔板后，为校准仪器，密封一个空的PCR板，使用测试液流将液滴和PBS分选至该空板的密封膜上。如果液滴未落在正确位置，需将其从密封膜表面擦拭干净，根据仪器制造商的说明重新

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科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

单细胞基因表达谱使用流式细胞仪和qPCR内部标准

单细胞表达谱分析可对单个细胞进行详细的基因表达分析。我们描述了心肌细胞的分离方法，以及对所得裂解液进行全转录组微阵列分析或特定靶标qPCR检测的制备步骤。...

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本文描述了一种分离单个视网膜细胞并扩增其cDNA的方法。单细胞转录组学可揭示组织中细胞异质性的程度，并发现稀有细胞群体的新标记基因。 accompanying protocol...

发育中与成熟视网膜神经元的单细胞分析

我们描述了一种实时PCR方案，用于分析脑脊液（CSF）中的microRNA。除RNA提取步骤外，该方法可推广应用于从其他体液、培养细胞或组织样本中提取的RNA。...

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单细胞基因表达检测对于理解干细胞异质性至关重要。...

通过定量RT-PCR对单个人类胚胎干细胞进行基因表达谱分析

合成酵母基因组项目 Sc2.0 的设计染色体可通过一种基于 PCR 的基因分型检测方法 PCRTagging 与其天然对应物区分开来，该方法以存在/缺失为判定终点。本文中，我们描述了一种用于 PCRTag 基因分型的高通量实时 PCR...

qPCRTag分析——一种用于Sc2.0基因分型的高通量实时PCR检测方法

本方案描述了一种从斑马鱼胚胎中分离单个细胞、富集目标细胞、在基于微流控的单细胞多重系统中捕获斑马鱼细胞，以及检测单个细胞基因表达的方法。...

斑马鱼胚胎单细胞的分离与表征

本方案描述了如何在克隆水平上评估大量基因的表达。单细胞逆转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）可对数百个样本和基因产生高度可靠且灵敏度强的结果。...

利用多重RT-qPCR进行单细胞基因表达分析以表征稀有淋巴细胞群体的异质性

批量基因表达检测会掩盖异质性细胞群体中单个细胞的差异。本文介绍了一种将单细胞基因表达分析与基于荧光激活细胞分选（FACS）的索引分选相结合的实验方案，可用于解析细胞异质性，并在分子水平上对免疫表型不同的细胞亚群进行特征鉴定。...

一种用于表征人类干细胞与祖细胞群体分子及免疫表型异质性的组合式单细胞方法

本方法介绍了如何提高从福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）RNA样本中获得的测序数据的质量和数量。我们描述了更准确评估FFPE-RNA样本质量的方法、测序文库的制备步骤，以及对FFPE-RNA样本数据进行分析的流程。...

降解FFPE-RNA样本测序及分析的优化

单分子RNA荧光原位杂交（smFISH）是一种用于在单细胞水平上精确定量特定RNA表达水平及其定位的方法。本文中，我们报告了经过验证的实验室操作流程，包括湿实验处理、成像以及针对特定RNA的单细胞定量图像分析方法。...

通过单分子荧光原位杂交对转录活性等位基因进行单细胞分析

学习使用流式细胞仪和微流控qPCR技术对单个哺乳动物细胞进行分选，并通过内部标准品实现多达96个靶基因的绝对定量分析。该方法为单细胞生物学研究提供了成本效益高且准确的基因表达检测方案。

使用流式细胞分选与含内参标准品的qPCR进行单细胞基因表达谱分析

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