开发一种优化的大鼠眼经巩膜视网膜下人视网膜色素上皮细胞移植方案

本视频的总体目标是介绍一种可重复的经巩膜下视网膜下注射技术，以将人视网膜色素上皮（RPE）细胞递送至啮齿类动物眼球的视网膜下腔，同时最大程度降低视网膜损伤风险。该技术首先在角膜缘后方的颞侧结膜处做一个小切口，以暴露下方的巩膜。随后，使用带斜面的31号胰岛素针头穿透巩膜复合体，将针头以斜面朝上的方向插入组织约500微米或约针尖长度的一半，以形成引导孔。

接下来，将连接注射器的斜面33号注射针导入导孔，并以特定角度和深度插入；拔出针头后，注射孔会自行闭合，无需缝合或使用组织胶。变性性视网膜病变是一组涉及多种不同类型视网膜细胞的广泛性疾病。在全球范围内，最常见的疾病是年龄相关性黄斑变性（AMD），多发于老年人群，可导致永久性失明。

年龄相关性黄斑变性（AMD）中的病理变化涉及视网膜色素上皮细胞（RPE）的初始退化。RPE的丧失会导致视网膜感光细胞功能障碍或死亡。目前针对早期AMD的药物治疗仅限于延缓疾病进展或缓解症状。

视网膜再生能力有限，因此目前尚无有效治疗手段可恢复视力。神经干细胞研究所近期在视网膜色素上皮（RPE）细胞群体中鉴定出一类成体干细胞，这类细胞可作为干细胞替代疗法的来源。

目前，本研究所正在利用视网膜色素上皮（RPE）变性大鼠动物模型，开展RPE干细胞移植治疗的临床前研究，以评估其有效性和安全性。在本研究中，我们采用经巩膜的视网膜下注射技术，将RPE干细胞递送至大鼠眼球内视网膜层与RPE层之间的区域。该方法是一种简便且可靠的细胞递送方式，可成功将细胞注入视网膜下腔。

您将需要以下试剂和设备。使用无菌0.9%生理盐水在手术当天将10%去氧肾上腺素稀释，配制成1%环喷托酯和2.5%去氧肾上腺素，用于散大瞳孔。眼用冲洗液用于冲洗眼睛，并保持未手术眼的湿润。

手术过程中使用眼润滑剂保持未手术的右眼湿润。使用0.5%丙美卡因作为局部麻醉剂。光学相干断层扫描（OCT）检查过程中对已手术的左眼使用眼润滑剂。

该技术所需的材料和设备极少。本方案中列出了该技术所用设备和试剂的详细信息。使用10微升注射器进行细胞注射。

注射前，我们首先组装注射器并用乙醇进行灭菌。将一根无菌的33号斜面针头插入注射器中，并拧紧以完成注射器的组装。依次用100%乙醇、70%乙醇和去离子蒸馏水冲洗注射器，每种溶液各冲洗5至6次。

用无菌黑色记号笔在注射针尖端前方600微米处做标记。将注射器安装在显微操作仪上以备注射使用。人RPE细胞在手术当天制备，并保存在冰水混合物中。

轻轻吹打细胞悬液，取1.2微升加入注射器中，其中额外的0.2微升用于补偿注射回流，以确保实际注射体积为1微升。将装有细胞悬液的注射器重新安装到显微操作仪上，或由助手垂直持握，因为视网膜色素上皮（RPE）细胞在溶液中容易沉降。在解剖显微镜载物台上放置无菌手术垫，并在其下方垫上加热垫，以准备无菌手术区域。

所有涉及动物受试者的操作均已被纽约州立大学奥尔巴尼分校机构动物护理与使用委员会批准。称量动物体重，并使用此处所示的异氟烷蒸汽输送系统对其进行麻醉。待动物麻醉后，将其转移至手术区域，并置于连接异氟烷系统的鼻罩中以维持麻醉状态。

用纱布覆盖大鼠的身体，并轻捏大鼠脚趾以确认完全麻醉。在大鼠右眼滴加一滴眼用润滑剂，将大鼠置于其右侧，使其左眼朝上以备注射，头部朝向术者右手方向，背部朝向术者。剪除遮挡眼睛的任何胡须。

在左眼颞侧滴入少量洗眼液，并用棉签在鼻侧收集多余液体以冲洗眼睛。使用1%托吡卡胺和2.5%去氧肾上腺素各一滴进行散瞳，以备注射后进行光学相干断层扫描（OCT）检查。滴加一滴洗眼液以保持眼睛湿润。

在眼睛上滴一滴丙美卡因，用棉签去除多余液体。轻轻按摩眼周皮肤4到6次，以打开眼睑，使眼球暂时轻微突出眼窝，便于注射针头顺利进入。使用镊子夹住角膜缘后方的结膜，并旋转眼球以找到更适宜手术的位置，同时避免损伤眼外肌。

轻轻抬起结膜形成帐篷状，并将眼球向鼻侧旋转。然后使用剪刀剪开帐篷顶部，以在结膜上制造一个小开口，暴露巩膜。接下来，用镊子夹住靠近角膜缘的结膜开口边缘，并将眼球向鼻侧旋转，使瞳孔轴与地面成约30度角。

使用无菌斜面31号胰岛素针头，针尖斜面朝上，将针尖约一半（约500微米）插入巩膜-视杯复合体组织，以制备注射用引导孔。小心撤出胰岛素针头，此时可能观察到少量血液渗出。如有需要，可使用眼用矛状器械清理孔道并止血。

将装载RPE细胞的注射针以相对于巩膜局部表面约10至15度的角度插入预钻的导引孔中，使针头完全进入组织约500微米，同时确保组织覆盖的针尖位置与针上黑色标记点之间保留约100微米的距离，以进入视网膜下腔。指示助手推动注射器活塞，注入适量体积的细胞。注射后保持注射器位置不动25至30秒，然后缓慢撤出注射器。

注射孔会自动封闭，通常可观察到约0.2微升的回流。用无菌洗眼液冲洗注射部位三次，并用棉签吸去多余液体。在手术眼上滴一滴润滑剂，然后将大鼠转移至OCT检测站，以检查移植细胞的位置以及视网膜下隆起的大小。

OCT 操作完成后，将大鼠放回置于加热灯下的恢复笼中以维持其体温。观察大鼠，确保其从麻醉中苏醒，并每天监测是否有任何痛苦迹象。如有异常，立即通知兽医。

利用我们的技术，我们能够持续且成功地将人视网膜色素上皮（RPE）细胞递送至视网膜下腔。移植后立即进行光学相干断层扫描（OCT）检查，以观察注射部位及移植细胞形成的视网膜下隆起。该方法可作为评估注射质量以及视网膜损伤或出血程度的良好筛查工具。

在OCT扫描下可见注射部位周围有明亮的光反射，以及充满细胞悬液的视网膜下隆起。成功的注射表现为注射部位及玻璃体腔内无出血、无眼内液体渗漏、无视网膜脱离，表明注射造成的创伤极小。移植术后7天，对操作过的SD大鼠眼球进行摘除、固定并切片，用于免疫组织化学分析。

采用人源性细胞核标志物Hunu和视网膜色素上皮（RPE）细胞标志物OTX2来检测移植的细胞。两种标志物均呈阳性表明，移植的人源性RPE细胞定位于大鼠眼球的视网膜下腔。这种经巩膜视网膜下注射技术操作简便，易于掌握。

该方法通过将注射针穿过眼球壁的外层而不损伤神经视网膜，从而减少手术创伤并保持视网膜完整。通过精确控制引导针和注射针进入组织的量化深度以及注射时的角度，可实现细胞更准确、更可靠地递送至视网膜下腔，显著提高操作的成功率。采用此注射方法，我们持续且成功地将人RPE干细胞来源的RPE细胞递送至RCS大鼠的视网膜下腔。

任何观看该视频的人都可以轻松重复此操作步骤。