人视网膜色素上皮细胞向大鼠眼巩膜视网膜移植精制方案的研制

视网膜注射液已广泛应用于干细胞置换治疗老年性黄斑变性的临床前研究。在这一可视化的文章中, 我们描述了一个低风险, 可重复和精确修改的视网膜注射技术, 通过巩膜的方法传递细胞到大鼠的眼睛。

本视频的总体目标是介绍一种可重复的经巩膜视网膜下注射技术，将人视网膜色素上皮或 RPE 细胞输送到啮齿动物眼睛的视网膜下空间，同时将视网膜损伤的风险降至最低。这是通过首先在角膜缘后面的颞结膜上做一个小切口以暴露下面的clera来完成的。然后，使用斜面 31 号胰岛素针穿透巩膜核心复合物，方法是将针头插入组织 500 微米或大约一半的尖端，斜面朝上，形成一个导向孔。

接下来，将连接到注射器的斜面 33 号注射针引导至导向孔并以特定角度和深度插入，注射孔在针头缩回后自动密封，无需缝合或组织胶。退行性视网膜病变包括涉及不同视网膜细胞类型的多种疾病。在世界范围内，最常见的疾病是年龄相关性黄斑变性 （AMD），发生在老年人中，并导致永久性失明。

AMD 发生的病理变化涉及视网膜色素上皮细胞 （RPE） 的初始变性。RPE 缺失导致视网膜荧光受体功能障碍或死亡。目前对早期 AMD 的药物治疗仅限于减缓进展或缓解症状。

再加上视网膜的再生潜力有限，这意味着没有有效的治疗方法来恢复视力。神经干细胞研究所最近在 RPE 细胞群中鉴定出了一个成体干细胞群。这些细胞可以用作干细胞替代疗法的来源。

目前，我们研究所正在进行临床前研究，以研究 RPE 干细胞移植疗法在 RPE 退行性大鼠动物模型中的有效性和安全性。在这项研究中，我们利用经巩膜视网膜下注射技术将 RPE 干细胞输送到大鼠眼睛中，位于视网膜层和 RPE 层之间。我们的方法是将细胞成功递送到视网膜下空间的一种简单可靠的方法。

您将需要以下试剂和设备。1% 托吡卡胺和 2.5% 去氧肾上腺素，由 10% 去氧肾上腺素新鲜制成，在手术当天用无菌 0.9% 盐水稀释，用于扩张瞳孔。洗眼液用于冲洗眼睛并保持未手术的眼睛湿润。

手术过程中使用眼部润滑剂保持未手术的右眼湿润。0.5% 丙帕卡因用作局部麻醉剂。在 OCT 扫描期间，手术左眼使用眼部润滑剂。

这种技术需要最少的材料和设备。该方案中概述了该技术中使用的设备和试剂的详细信息。使用 10 μL 注射器注射细胞。

注射前，我们首先组装注射器并用乙醇消毒。将无菌的 33 号斜面针头插入注射器并拧紧以组装注射器。用 100% 乙醇冲洗进样器，然后用 70% 乙醇冲洗，然后用去离子蒸馏水冲洗，依次冲洗 5 到 6 次。

用无菌黑色记号笔在距离针尖 600 微米的位置标记注射器针。将注射器放在微型机械手上进行注射使用。人 RPE 细胞在手术当天制备并保存在冰水混合物中。

轻轻研磨细胞悬液，向注射器中加入 1.2 微升，额外的 0.2 微升用于补偿注射回流，以保证 1 微升注射量。更换显微作器上装满细胞悬液的注射器，或让助手垂直握住它，因为 RPE 细胞往往很容易在溶液中沉入。通过在解剖显微镜的载物台下方放置带有加热垫的无菌手术垫来准备无菌手术区域。

所有涉及动物受试者的程序均已获得纽约州立大学奥尔巴尼分校机构动物护理和使用委员会的批准。如此处所示，使用异氟醚蒸气输送系统对动物进行称重和麻醉。麻醉后将大鼠转移到手术区域，并将其放置在连接到异氟醚系统的鼻锥中以维持麻醉。

用纱布盖住大鼠的身体，捏住大鼠的脚趾，确认完全麻醉。在大鼠的右眼上滴一滴眼润滑剂，将大鼠放在右侧，左眼面向注射天花板，头部朝向外科医生的右手，然后背对外科医生。修剪掉遮住眼睛的任何胡须。

左眼的颞侧滴下少量洗眼液，然后用棉签将多余的洗眼液收集在鼻侧冲洗眼睛。用 1% 托吡卡胺、2.5% 去氧肾上腺素扩张瞳孔，用于注射后光学相干断层扫描或 OCT 检查，每种滴剂各滴一滴。滴一滴洗眼液以保持眼睛湿润。

在眼睛上滴一滴 Proparacain，然后用棉签去除多余的部分。轻轻按摩眼睛周围的皮肤四到六次，以打开眼睑，使眼睛暂时略微地从眼窝中弹出，以便于使用注射器针头。用力抓住角膜缘后面的结膜，并旋转眼睛以找到更好的手术位置，而不会损伤眼部肌肉。

轻轻提起结膜，做一个帐篷，然后鼻腔旋转眼睛。然后用剪刀剪掉帐篷的顶部，在结膜上开一个小口，露出巩膜。接下来，用镊子抓住角膜缘旁边的结膜口边缘，然后鼻腔旋转眼睛，使瞳孔轴相对于地面呈约 30 度角。

使用无菌斜面 31 号胰岛素针刺穿巩膜核心复合物，斜面朝上，尖端的一半或约 500 微米插入组织，以形成注射导向孔。小心地拔出胰岛素针头，可能会看到少量血液渗出。如有必要，可以使用眼矛清理孔并止血。

装有 RPE 细胞的注射针以相对于巩膜局部表面约 10 至 15 度的角度引导至导向孔中，以到达视网膜下空间，方法是将长度为 500 微米的针头完全插入组织并在针头上覆盖的针头点与针头上黑色标记点之间留出 100 微的距离。告诉助手按下注射器的柱塞，以注入适当体积的细胞。注射后将注射器固定 25 到 30 秒，然后慢慢缩回注射器。

注射孔自动密封，通常观察到少量约 0.2 μL 的回流。用无菌洗眼液冲洗注射部位 3 次，然后用棉签收集多余的部分。在手术眼上滴一滴润滑剂，然后将大鼠转移到 OCT 站，以检查移植细胞的位置和视网膜下气泡的大小。

OCT 完成后，在加热灯下将大鼠放回恢复笼中，以保持其体温。观察大鼠以确保它从麻醉中苏醒，并每天监测是否有任何痛苦的迹象。如有疑虑，请立即通知兽医。

使用我们的技术，我们始终如一地成功地将人类 RPE 细胞递送到视网膜下空间。移植后，我们立即进行 OCT 检查，观察注射部位和移植细胞产生的视网膜下水泡。这是一个很好的筛查工具，用于评估注射质量和视网膜损伤或出血的程度。

在 OCT 扫描下可以看到注射部位周围的强光反射和充满细胞悬液的视网膜下水泡。在成功的注射中，在注射部位或玻璃体内间隙周围没有看到出血、眼内液渗漏或视网膜脱离，表明注射造成的创伤最小。手术大鼠眼在移植后 7 天成核、固定和切片进行免疫组织学分析。

人核标志物 Hunu 和 RPE 细胞标志物 OTX2 用于检测移植细胞。两种标志物的阳性表明，移植的人 RPE 细胞位于大鼠眼睛的视网膜下间隙。这种经巩膜视网膜下注射技术简单易学。

它造成的手术创伤较小，并且通过将注射针穿过眼壁的外层而保持视网膜完整，而不会破坏神经视网膜。先导针和注射针进入组织的定量滴注以及注射过程中使用的角度允许以更高的准确性和成功率可靠地将细胞输送到视网膜下空间。通过这种注射方法，我们始终如一地成功地将人 RPE 干细胞衍生的 RPE 细胞递送到 RCS 大鼠的视网膜下间隙。

观看视频的任何人都可以轻松重复此过程。