Name: 人视网膜色素上皮细胞向大鼠眼巩膜视网膜移植精制方案的研制 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 45 s
Description: 了解一种经巩膜视网膜下注射技术，用于将人视网膜色素上皮细胞精准递送至大鼠眼部。该方法具有自封闭特性，可最大限度降低视网膜损伤风险，为年龄相关性黄斑变性的干细胞治疗提供安全可靠的实验方案。

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我们感谢Patty Lederman在手术方面的协助，以及Susan Borden在RPE细胞制备方面的帮助。同时感谢NYSTEM C028504对本项目的资助。Justine D. Miller由NIH资助项目F32EY025931支持。

所有涉及动物的实验程序均已获得纽约州立大学奥尔巴尼分校机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。
1. 注射前准备
<ol>
	<li>hRPESC-RPE细胞悬液的制备 
	注意：以下所有步骤均须在无菌细胞培养操作台内进行，操作者需熟悉基本的无菌技术。
	<ol>
		<li>从50至90岁人类供体眼球中分离原代hRPE细胞，并在24孔板中培养细胞12. 在第1代时冻存细胞，按需复苏，并培养第2代（P2）细胞4-5周（图1A用于注射。</li>
		<li>移除培养基12 并用500 µL预热的不含钙的1X杜尔贝科磷酸盐缓冲液轻柔冲洗孔板两次 &amp;#38; 镁（1x DPBS-CMF）：使用1,000 µL移液器将1X DPBS-CMF加入孔板中，随后用真空泵吸除。</li>
		<li>向每孔中加入 300 µL 胰蛋白酶/DNA酶。将hRPESC-RPE细胞在胰蛋白酶/DNA酶（每1 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA中含4 kU DNA酶）中于37 °C孵育4 min，以解离细胞。</li>
		<li>在显微镜下观察细胞是否已变圆。若细胞尚未变圆，继续将细胞在胰蛋白酶/DNase中孵育额外2分钟。</li>
		<li>待细胞变圆后，用1,000 µL移液器吹打使细胞从孔中完全脱离，并将含有胰蛋白酶/脱氧核糖核酸酶的悬浮细胞转移至15 mL锥形管中，加入等体积预热的培养基以中和胰蛋白酶/脱氧核糖核酸酶活性。</li>
		<li>用预热的1X DPBS-CMF轻轻吹打洗涤孔板，特别是孔的边缘区域；然后将这些细胞加入之前的锥形管中。</li>
		<li>在4 °C条件下，以286 × g离心5分钟，使细胞沉淀至锥形管底部。</li>
		<li>吸除上清液，并用1 mL培养基重悬细胞。</li>
		<li>使用血细胞计数板对细胞进行计数。</li>
		<li>在 4 °C 条件下以 286 x g 离心 5 分钟，使细胞沉淀。</li>
		<li>移除上清液，并将细胞重悬于无菌平衡盐溶液（BSS）中，浓度为 50,000 个细胞/µL（以便在视网膜下注射时每 1 µL 体积输送 50,000 个细胞）。</li>
		<li>将最终的细胞悬液（CS）转移至1.7 mL微量离心管中，置于冰水混合物中保存，直至用于注射。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞注射器的制备
	<ol>
		<li>将无菌的33号斜面针头插入注射器中，并拧紧以组装注射装置。</li>
		<li>用100%乙醇冲洗注射器5至6次。</li>
		<li>用70%乙醇冲洗进样器5至6次。</li>
		<li>用BSS冲洗注射器5到6次。</li>
		<li>在解剖显微镜下，使用无菌黑色记号笔在注射针尖端下方600 µm处做标记图1B).</li>
		<li>将注射器置于显微操作仪上用于注射。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 视网膜下注射
<ol>
	<li>手术区域与动物准备
	<ol>
		<li>称量一只4-5周龄的RCS大鼠（60-100 g），并使用异氟烷蒸气输送系统进行麻醉。 
		注意：诱导麻醉时，保持异氟烷气流速率为5%。通过按压大鼠足垫确认麻醉深度，随后将气流速率降低至2-3%以维持术中麻醉。</li>
		<li>在解剖显微镜的载物台上铺设无菌手术巾，并在其下方放置加热垫，以建立无菌手术区域。</li>
		<li>将大鼠转移至手术区域，并将其鼻部接入连接异氟烷系统的鼻罩，以维持麻醉状态。</li>
		<li>用纱布覆盖大鼠身体，并轻捏其脚趾以确认已完全麻醉。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>显微镜下经巩膜视网膜下注射
	<ol>
		<li>在大鼠未手术眼上滴一滴眼用润滑剂。</li>
		<li>将大鼠置于右侧卧位，使其左眼朝上以便注射，头部朝向术者右手侧，背部朝向术者。</li>
		<li>用小剪刀修剪遮挡眼睛的胡须。</li>
		<li>从左眼颞侧滴入少量眼冲洗液，并用棉签在鼻侧收集多余液体，以清洗眼球表面。</li>
		<li>滴入一滴1%托吡卡胺和一滴2.5%去氧肾上腺素（手术当天将10%去氧肾上腺素用无菌0.9%生理盐水稀释配制而成），以散大瞳孔，便于术后OCT检查。</li>
		<li>轻轻牵拉眼周皮肤4-6次，使眼睑张开，眼球轻微前突，便于接近角膜缘后方区域。</li>
		<li>滴一滴眼冲洗液，保持眼球湿润。</li>
		<li>轻轻吹打重悬CS细胞悬液（步骤1.1.12中制备），并将注射器吸取1.2 µL CS。额外的0.2 µL用于补偿注射过程中的回流损失。 
		注意：根据我们的测量，当注射浓度为50,000 cells/µL时，约有5,000-8,000个细胞因回流而丢失，相当于约10-16%的细胞损失；因此额外注射0.2 µL CS以补偿该损失。</li>
		<li>将装有CS的注射器固定于显微操作仪上（或由助手手持），保持垂直方向，因为RPE细胞在悬液中容易沉降。</li>
		<li>在眼球表面滴一滴0.5%丙帕卡因（局部表面麻醉剂），并用棉签吸除多余液体。 
		注意：此步骤可抑制角膜反射，防止后续操作中眼球眨眼。</li>
		<li>用镊子夹住角膜缘后方的结膜组织，将眼球向鼻侧旋转，并提起结膜形成一个&#34;帐篷&#34;结构。</li>
		<li>用剪刀剪开&#34;帐篷&#34;顶部，在结膜上制造一个小开口，暴露下方的巩膜。</li>
		<li>用镊子夹住靠近角膜缘的剩余结膜边缘，将眼球向鼻侧旋转，使瞳孔轴线与台面成约30度角（图1C）。在整个穿刺过程中需持续夹持结膜边缘，以提供反向牵引力并维持眼球处于最佳角度。</li>
		<li>为细胞注射做引导孔，将无菌斜面31号胰岛素针头末端置于角膜缘后1,200-1,500 µm处，针尖开口朝上。</li>
		<li>调整胰岛素针头角度，使其高于巩膜表面10-15度（与预定注射部位的假想平面相切）。缓慢穿透脉络膜-巩膜复合体，进针深度约500 µm。在色素性大鼠中，针尖会“消失”于色素化的脉络膜下方。本实验所用胰岛素针型号，其针尖至斜面的距离为500 µm。</li>
		<li>小心撤出胰岛素针头（可能观察到极少量血液渗出）。</li>
		<li>若出血明显，必要时可用眼用棉签清理穿刺孔。若棉签处理后仍持续出血，提示可能损伤了血管。</li>
		<li>将装载RPE细胞的注射针头引导进入引导孔，针头开口朝下，与巩膜局部表面成约10-15度角。</li>
		<li>轻柔地将注射针插入引导孔约500 µm深，以进入视网膜下腔。黑色记号笔标记边缘与针头被色素脉络膜覆盖处之间应保留约100 µm的安全距离（图1C 和 1D）。</li>
		<li>请助手缓慢推动注射器活塞，注入适量细胞（约1.2 µL）。当助手推动活塞时，应准备施加适当的反向阻力。 
		注意：术前与助手进行模拟练习，有助于双方熟悉此操作步骤。</li>
		<li>在显微镜下聚焦观察记号边缘，保持注射针原位25-30秒，然后缓慢撤出注射针。通常可观察到少量回流。 
		注意：若未见回流，可能发生了玻璃体内注射；若在封闭处看到回流或细胞积聚于巩膜下方，则提示注射过浅。</li>
		<li>用无菌眼冲洗液冲洗注射部位3次，并用棉签吸除多余液体。</li>
		<li>在手术眼上滴一滴眼用润滑剂，将大鼠转移至OCT检测站，检查移植细胞的位置及视网膜下隆起的大小。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 注射后处理
<ol>
	<li>抗炎与镇痛治疗
	<ol>
		<li>皮下注射盐水配制的布托啡诺（buprenorphine），剂量为 0.1 mg/kg 体重，以减轻疼痛。</li>
		<li>腹腔注射（I.P.）盐水配制的地塞米松（dexamethasone），剂量为 1.6 mg/kg 体重，用于控制炎症。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>动物恢复
	<ol>
		<li>将大鼠放回恢复笼中，并置于加热灯下以维持体温。</li>
		<li>观察手术眼是否有出血迹象。</li>
		<li>观察大鼠，确保其从麻醉中苏醒。</li>
		<li>将恢复后的大鼠转移至清洁笼具中，并用手术卡片标记该笼，每日监测是否存在痛苦迹象、眼部出血或角膜混浊等情况；如有异常，立即通知兽医。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文所展示的视网膜下注射技术采用经巩膜途径，即注射针穿透眼球壁的外层结构（巩膜-脉络膜-视网膜色素上皮复合体），而不损伤神经视网膜或干扰玻璃体腔。另一种经玻璃体腔的注射方法存在损伤晶状体导致白内障的潜在风险，因为啮齿类动物的晶状体占据了玻璃体腔的大部分空间。与该方法相比，我们的技术风险更低，造成的创伤极小，因为注射针无需穿过整个玻璃体腔即可到达视网膜下间隙。事实上，我们在研究中通过光学相干断层扫描（OCT）检查发现，视网膜穿透事件极为罕见，且在动物后续检查中未出现持续性视网膜脱离。此外，使用33号注射针时，注射部位非常小（&#60; 200 µm 直径），因此对巩膜-脉络膜-视网膜色素上皮复合体的结构干扰极为有限。针头回撤后，注射孔可自动闭合，无需缝合或使用组织胶。
手术可能出现的并发症包括注射区域周围或导孔内部出血过多。使用镊子夹持角膜缘处的结膜边缘时，仅需施加轻微力量，以避免夹伤血管并减少可能的出血。在制作导孔前，应检查预定的注射部位，避免穿透表层血管。使用穿刺针可在插入细胞注射针前清除导孔内的血液。若反复使用穿刺针数次后导孔仍持续出血，则可能已有血管破裂。我们观察到的另一并发...

位于眼球后部的人类视网膜作为感光组织，在视觉感知中发挥关键作用。因此，视网膜细胞功能障碍或细胞死亡会导致视力问题或永久性失明。涉及视网膜不同层次细胞变性或功能障碍的疾病被称为变性性视网膜疾病，其中年龄相关性黄斑变性（AMD）是最常见的类型，也是发达国家老年人不可逆失明的首要原因1,2. 年龄相关性黄斑变性（AMD）的病理过程与 &#34;玻璃膜疣&#34; RPE层与下方布鲁赫膜之间发生物质积聚，进而损害RPE对光感受器生理功能的支持作用，导致神经视网膜萎缩和视力丧失3,4,5目前，对于晚期干性（非新生血管性）年龄相关性黄斑变性（AMD）尚无治愈方法。干细胞疗法作为再生医学中的新范式，为用干细胞来源的健康细胞替代功能障碍或死亡的视网膜色素上皮（RPE）细胞带来了希望。事实上，已有大量关于移植干细胞的临床前研究例如将人胚胎干细胞（human embryonic stem cell）来源的视网膜色素上皮（RPE）细胞移植至RPE退行性动物模型的研究已开展6,7，其中一些已进入临床试验阶段8,9 (NCT01344993，ClinicalTrials.gov)。近期，本实验室鉴定出一种位于人视网膜色素上皮（RPE）层的新型干细胞来源——人RPE干细胞（hRPESCs），目前正用于年龄相关性黄斑变性（AMD）的hRPESC来源的RPE细胞（hRPESC-RPE）移植治疗的临床前研究10,11,12,13.
在上述多个研究团队（包括我们团队）开展的临床前研究中，均采用了视网膜下注射技术。在动物模型中，视网膜下注射主要有两种方法：经玻璃体途径和经巩膜途径。经玻璃体途径的优势在于，外科医生可直接观察到针尖穿透眼前部、穿过晶状体旁整个玻璃体腔，并在眼球后部穿透视网膜进入视网膜下腔的过程14,15,16。然而，该方法需在视网膜的前部和后部两处造成损伤，存在损伤晶状体的风险，且在拔出针头时可能导致细胞反流至玻璃体腔内。相比之下，经巩膜途径理论上可避免对视网膜和玻璃体的干扰，反流液可直接排出眼外。在色素性啮齿类动物中，术者最初可观察到针尖穿透巩膜的过程，但一旦进入色素化的脉络膜后，针尖即不再可见。由于缺乏直接可视性，穿透视网膜时容易发生视网膜分离，并导致细胞和/或血液进入玻璃体腔。此外，由于眼球表面呈曲面状，很难确定经巩膜注射时最有效的针头角度和进针深度。
在本可视化文章中，我们介绍了一种基于术后光学相干断层扫描（OCT）评估的经巩膜下视网膜注射方法，该方法可对注射部位进行详细观察。我们的经巩膜注射技术采用明确的定位、进针角度和深度，从而实现极低的手术创伤和高可靠性。本文中，我们具体展示了将 hRPESC-RPE 细胞注射至 RCS 大鼠视网膜下腔的过程，RCS 大鼠是人类年龄相关性黄斑变性（AMD）的临床前模型。利用该注射方法，我们成功且稳定地将 hRPESC-RPE 细胞递送至 RCS 大鼠眼的视网膜下腔，成功率极高。先前研究发现，细胞注射可在注射后至少 2 个月维持 RCS 感光细胞的存活13。该操作在解剖显微镜下进行，易于学习掌握，需两名人员（一名手术者和一名助手）共同完成注射，每只动物的平均注射时间少于 5 分钟。明确的进针角度和深度使得在缺乏 OCT 设备的实验室也能成功实施视网膜下注射。该方法可实现高度可重复的视网膜下腔通路，不仅适用于细胞移植，还可用于药物递送和基因治疗。

<table><tbody><tr><td>0.25% 胰蛋白酶-EDTA (1×)</td><td>Life Technologies</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>DNA酶I</td><td>Sigma</td><td>DN-25</td><td></td></tr><tr><td>1×Dulbecco&amp;rsquo;不含钙的磷酸盐缓冲液 &amp;和镁（1xDPBS-CMF）</td><td>Corning Cellgro</td><td>431219</td><td></td></tr><tr><td>无菌平衡盐溶液（BSS）</td><td>Alcon</td><td>00065079550</td><td></td></tr><tr><td>无菌洗眼液</td><td>摩尔医学</td><td>75519</td><td></td></tr><tr><td>无菌0.9%生理盐水</td><td>Hospira</td><td>488810</td><td></td></tr><tr><td>盐酸丙帕他卡因滴眼液（0.5%）</td><td>阿克恩</td><td>17478026312</td><td></td></tr><tr><td>托吡卡胺滴眼液，USP（1%）</td><td>Bausch &amp;& 罗姆</td><td>24208058559</td><td></td></tr><tr><td>盐酸去氧肾上腺素滴眼液，美国药典标准（10%）储备液</td><td>Bausch &amp;& 罗姆</td><td>42702010305</td><td>用于配制2.5%去氧肾上腺素溶液</td></tr><tr><td>Buprenex</td><td>Patterson</td><td>433502</td><td></td></tr><tr><td>地塞米松</td><td>APP Pharmaceuticals</td><td>63323051610</td><td></td></tr><tr><td>100% 乙醇</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>615090040</td><td></td></tr><tr><td>70% 乙醇</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>2546.70-5</td><td></td></tr><tr><td>无菌GenTeal润滑眼用凝胶</td><td>诺华</td><td>78042947</td><td></td></tr><tr><td>无菌Systane Ultra润滑型滴眼液</td><td>爱尔康</td><td>00065143105</td><td></td></tr><tr><td>hRPESC-RPE 细胞</td><td>未商业化供应</td><td></td><td>请参阅 &quot;参考文献编号12&quot; 用于细胞分离与培养。</td></tr><tr><td>24孔板</td><td>康宁</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>锥形管（15 ml）</td><td>Sarstedt</td><td>62554002</td><td></td></tr><tr><td>带O形圈的微量离心管盖</td><td>LPS 刺激</td><td>L233126</td><td></td></tr><tr><td>无盖微型离心管（1.7 ml）</td><td>LPS 刺激</td><td>L233041</td><td></td></tr><tr><td>离心</td><td>Eppendorf</td><td>5804R</td><td></td></tr><tr><td>无菌酒精擦拭巾</td><td>McKesson</td><td>58-204</td><td></td></tr><tr><td>无菌棉签</td><td>McKesson</td><td>24-106-2S</td><td></td></tr><tr><td>无菌 Weck-Cel 棉签</td><td>Beaver-Visitec International&amp;nbsp;</td><td>0008680</td><td></td></tr><tr><td>无菌手术巾&amp;nbsp;</td><td>McKesson</td><td>25-515</td><td></td></tr><tr><td>纱布</td><td>McKesson</td><td>16-4242</td><td></td></tr><tr><td>纳米注射器（10 μl）</td><td>World Precision Instruments</td><td>纳米纤维</td><td></td></tr><tr><td>纳米细斜面33号针头</td><td>世界精密仪器公司</td><td>NF33BV-2</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素注射器针头 31 号规格</td><td>Becton Dickinson</td><td>328418</td><td></td></tr><tr><td>大鼠齿镊</td><td>世界精密仪器公司</td><td>555041FT</td><td></td></tr><tr><td>万纳斯显微解剖弹簧剪</td><td>Roboz</td><td>RS-5602</td><td></td></tr><tr><td>循环水T型泵&amp;nbsp;</td><td>Stryker</td><td>TP700</td><td></td></tr><tr><td>加热垫</td><td>Kent Scientific</td><td>TPZ-814</td><td></td></tr><tr><td>动物麻醉系统</td><td>世界精密仪器公司</td><td>EZ-7000</td><td></td></tr><tr><td>平衡</td><td>Ohaus</td><td>PA1502</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td></td></tr><tr><td>显微镜光源</td><td>Schott</td><td>ACE系列</td><td></td></tr><tr><td>Bioptigen Envisu 光谱域眼科成像系统</td><td>Bioptigen</td><td>R2210</td><td></td></tr><tr><td>无菌黑色记号笔</td><td>Viscot Industries</td><td>1416S-100</td><td></td></tr><tr><td>微型测量尺</td><td>Ted Pella 公司</td><td>13623</td><td></td></tr><tr><td>红外加热灯&amp;nbsp;</td><td>EXO-TERRA</td><td>PT2144</td><td>这用作动物术后恢复期间的加热灯&amp;nbsp; 相</td></tr></tbody></table>

开发一种优化的大鼠眼经巩膜视网膜下人视网膜色素上皮细胞移植方案

Development of a Refined Protocol for Trans-scleral Subretinal Transplantation of Human Retinal Pigment Epithelial Cells into Rat Eyes

年龄相关性黄斑变性（AMD）等退行性视网膜疾病是全球不可逆视力丧失的首要原因。AMD 的特征是视网膜色素上皮（RPE）细胞退化，这些细胞构成单层结构，在功能上支持并解剖上包裹神经视网膜。目前针对非新生血管性 AMD（干性 AMD）的药物治疗仅能延缓疾病进展，无法恢复视力，因此迫切需要开展研究以探索新的治疗策略。用健康细胞替代退化的 RPE 细胞，有望成为未来治疗干性 AMD 的有效手段。在针对 AMD 的干细胞替代疗法的大量临床前研究中，通常采用将干细胞来源的 RPE 细胞移植至动物模型视网膜下腔的方法，该过程应用了视网膜下注射技术。这些临床前动物实验中最常用的方法是经巩膜途径，但由于无法直接观察针尖位置，操作难度较大，且常导致视网膜损伤。另一种经玻璃体途径虽可直接观察针尖位置，但因扰动更多眼部组织，手术创伤风险较高。我们开发了一种风险更低且可重复性更高的改良经巩膜注射方法，通过精确控制进针角度和深度，成功且稳定地将 RPE 细胞递送至大鼠视网膜下腔，并避免了过度的视网膜损伤。此前已有研究证实，采用该方法递送的细胞在皇家外科学院（RCS）大鼠模型中至少 2 个月内具有治疗效果。该技术不仅可用于细胞移植，还可用于小分子或基因治疗药物的递送。

采用本文所述技术，我们通过精确控制注射针插入组织的位置、角度和深度，成功将hRPESC-RPE细胞持续递送至RCS大鼠的视网膜下腔（图1B-D）。移植后立即进行光学相干断层扫描（OCT）检查，以观察注射部位及移植细胞形成的视网膜下隆起（subretinal bleb）。术后OCT评估可作为评估注射质量以及监测视网膜损伤或出血的筛查工具。OCT扫描可清晰显示视网膜下隆起（图2A、C和D）及注射部位（图2A和B）。视网膜下隆起通常在注射后24小时内自行消退。尽管通过OCT难以精确测量隆起的大小，但我们可以假设其面积等于细胞移植所保护的光感受器区域面积，从而进行估算。我们先前已证实，注射1 µL含50,000个细胞的悬液，可在注射部位周围挽救约6-7%的RCS大鼠视网膜区域13。如...

视网膜下注射已广泛应用于年龄相关性黄斑变性干细胞替代治疗的临床前研究。在本可视化文章中，我们描述了一种经巩膜途径向大鼠眼内递送细胞的、风险更低、可重复且精确改良的视网膜下注射技术。

年龄相关性黄斑变性（AMD）等退行性视网膜疾病是全球不可逆视力丧失的首要原因。AMD 是……

本视频的总体目标是介绍一种可重复的经巩膜下视网膜下注射技术，以将人视网膜色素上皮细胞（即 RPE 细胞）递送至啮齿类动物眼球的视网膜下腔，同时最大程度降低视网膜损伤风险。该技术首先在角膜缘后方的颞侧结膜处做一个小切口，暴露下方巩膜。随后，使用带斜面的 31 号胰岛素针头穿刺巩膜复合体，将针头以斜面朝上的方向插入组织约 500 微米，或大约半个针尖长度，以形成引导孔。接下来，将连接注射器的斜面33号注射针导入导孔，并以特定角度和深度插入，拔出针头后注射孔会自行闭合，无需缝合或使用组织胶。变性性视网膜病变包含一系列涉及不同视网膜细胞类型的疾病。在全球范围内，最常见的疾病是年龄相关性黄斑变性（AMD），多发于老年人群，可导致永久性失明。年龄相关性黄斑变性（AMD）中的病理变化涉及视网膜色素上皮细胞（RPE）的初始退化。RPE的丧失会导致视网膜感光细胞功能障碍或死亡。目前针对早期AMD的药物治疗仅限于延缓疾病进展或缓解症状。视网膜再生能力有限，因此目前尚无有效治疗手段可恢复视力。神经干细胞研究所近期在视网膜色素上皮（RPE）细胞群体中鉴定出一类成体干细胞，这类细胞可作为干细胞替代疗法的来源。目前，本研究所正在开展临床前研究，以评估视网膜色素上皮（RPE）干细胞移植疗法在RPE变性大鼠动物模型中的有效性和安全性。在本研究中，我们采用经巩膜的视网膜下注射技术，将RPE干细胞递送至大鼠眼球内视网膜层与RPE层之间的区域。该方法是一种简便且可靠的将细胞成功递送至视网膜下腔的技术手段。您将需要以下试剂和设备。使用当天用无菌0.9%生理盐水将10%去氧肾上腺素稀释后新鲜配制的1%环喷托酯和2.5%去氧肾上腺素，用于散大瞳孔。眼冲洗液用于冲洗眼睛并保持未手术眼的湿润。手术过程中使用眼润滑剂保持未手术的右眼湿润。使用0.5%丙美卡因作为局部麻醉剂。光学相干断层扫描过程中，对已手术的左眼使用眼润滑剂。该技术所需的材料和设备极少。本方案中列出了该技术所用设备和试剂的详细信息。使用10微升注射器进行细胞注射。注射前，我们首先组装注射器并用乙醇进行灭菌。将一根无菌的33号斜面针头插入注射器中，并拧紧以完成注射器的组装。依次用100%乙醇、70%乙醇和去离子蒸馏水冲洗注射器，每种液体各冲洗五到六次。用无菌黑色记号笔在注射针尖端前方600微米处做标记。将注射器安装在显微操作仪上以备注射使用。人RPE细胞在手术当天制备，并保存在冰水混合物中。轻轻吹打细胞悬液，取1.2微升加入注射器中，其中额外的0.2微升用于补偿注射回流，以确保实际注射体积为1微升。将装有细胞悬液的注射器重新安装至显微操作仪上，或由助手垂直持握，因为视网膜色素上皮细胞在溶液中容易沉降。在解剖显微镜载物台上放置无菌手术垫，并在其下方垫上加热垫，以准备无菌手术区域。所有涉及动物受试者的操作均已被纽约州立大学奥尔巴尼分校的机构动物护理与使用委员会批准。称量动物体重，并使用此处所示的异氟烷蒸汽输送系统对其进行麻醉。待动物麻醉后，将其转移至手术区域，并置于连接异氟烷系统的鼻罩中以维持麻醉状态。用纱布覆盖大鼠身体，轻捏大鼠脚趾以确认已完全麻醉。在大鼠右眼滴加一滴眼用润滑剂，将大鼠置于右侧卧位，使其左眼朝上以便注射，头部朝向术者右手方向，背部朝向术者。剪除遮挡眼睛的任何胡须。在左眼颞侧滴入少量洗眼液，并用棉签在鼻侧收集多余液体以冲洗眼睛。通过各滴一滴1%托吡卡胺和2.5%去氧肾上腺素来散大瞳孔，以便进行注射后光学相干断层扫描（OCT）检查。滴入一滴洗眼液以保持眼睛湿润。在眼部滴加一滴丙帕卡因，用棉签拭去多余液体。轻轻按摩眼周皮肤4至6次，以打开眼睑，使眼球暂时轻微突出于眼窝，便于注射针头顺利进入。使用镊子夹住角膜缘后方的结膜，并旋转眼球以寻找更适宜手术的区域，同时避免损伤眼外肌。轻轻抬起结膜形成帐篷状，并将眼球向鼻侧旋转。然后用剪刀剪开帐篷顶部，以在结膜上制造一个小开口，暴露巩膜。接着，用镊子夹住靠近角巩膜缘的结膜开口边缘，并将眼球向鼻侧旋转，使瞳孔轴与地面成约30度角。使用无菌斜面31号胰岛素针头，针尖斜面朝上，将针尖约一半（约500微米）插入巩膜-视杯复合体组织，以制备注射用引导孔。小心撤出胰岛素针头，可能会观察到少量血液渗出。必要时可用眼用镊子清理针孔并止血。将装载RPE细胞的注射针以相对于巩膜局部表面约10至15度的角度插入预钻的导引孔中，使针头完全进入组织约500微米，同时确保组织覆盖的针尖位置与针上黑色标记点之间保留约100微米的距离，以到达视网膜下腔。指示助手推动注射器推杆，注入适量体积的细胞。注射后保持注射器位置不动25至30秒，然后缓慢撤出注射器。注射孔会自动封闭，通常可观察到约0.2微升的少量回流。用无菌洗眼液冲洗注射部位三次，并用棉签吸除多余液体。在手术眼上滴一滴润滑剂，然后将大鼠转移至OCT检测站，以检查移植细胞的位置以及视网膜下隆起的大小。完成OCT后，将大鼠放回恢复笼中，并置于加热灯下以维持其体温。观察大鼠，确保其从麻醉状态中苏醒，并每天监测是否有任何痛苦迹象。如有异常，立即通知兽医。利用我们的技术，我们能够持续且成功地将人视网膜色素上皮（RPE）细胞递送至视网膜下腔。移植后立即进行光学相干断层扫描（OCT）检查，以观察注射部位及移植细胞形成的视网膜下隆起。该方法可作为评估注射质量以及视网膜损伤或出血程度的良好筛查工具。在OCT扫描下可见注射部位周围有明亮的光反射，以及充满细胞悬液的视网膜下隆起。成功的注射表现为注射部位及玻璃体腔内无出血、无眼内液体渗漏、无视网膜脱离，表明注射造成的创伤极小。移植术后7天，对操作过的 rats 眼球进行摘除、固定并切片，用于免疫组织化学分析。采用人源性细胞核标志物Hunu和视网膜色素上皮（RPE）细胞标志物OTX2来检测移植的细胞。两种标志物均呈阳性表明，移植的人源RPE细胞定位于大鼠眼球的视网膜下腔。这种经巩膜视网膜下注射技术操作简便，易于掌握。该方法通过将注射针穿过眼球壁的外层而不损伤神经视网膜，从而减少手术创伤并保持视网膜完整。通过精确控制引导针和注射针进入组织的量化深度以及注射时的角度，可实现细胞可靠且高精度、高成功率地递送至视网膜下腔。采用此注射方法，我们持续且成功地将人RPE干细胞来源的RPE细胞递送至RCS大鼠的视网膜下腔。任何观看该视频的人都可以轻松重复此操作步骤。

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人视网膜色素上皮细胞向大鼠眼巩膜视网膜移植精制方案的研制

细胞移植是一种针对以感光细胞丧失为特征的视网膜退行性疾病的治疗策略。本文介绍一种富集可移植感光细胞并将其移植至成年小鼠视网膜下腔的方法。...

成年小鼠视网膜下移植MACS纯化的光感受器前体细胞

本文以多媒体形式展示了一种被学术界广泛认可的在大鼠和小鼠中进行视网膜下腔注射RPE细胞悬液的实验方案。该方法可用于评估移植的RPE细胞在视网膜变性动物模型中的挽救潜力、安全性以及存活能力。...

在啮齿类动物中进行视网膜下注射以递送悬浮的视网膜色素上皮细胞

视网膜色素上皮（RPE）替代策略和基于基因的治疗已被考虑用于多种视网膜变性疾病。在临床转化过程中，需要使用大型眼动物模型来研究适用于患者的手术技术。本文介绍了一种用于视网膜下手术的兔模型，该模型专为RPE移植设计，具有多功能性和成本效益。...

兔眼视网膜下手术的逐步操作方案

视网膜色素上皮细胞可作为干性年龄相关性黄斑变性晚期的细胞替代疗法。本方案描述了地理样萎缩的大眼模型的建立，以及将人胚胎干细胞来源的视网膜色素上皮细胞移植至该疾病模型的视网膜下腔的过程。...

地理萎缩大眼模型中人胚胎干细胞来源的视网膜色素上皮细胞的视网膜下移植

关键词：人胚胎干细胞，视网膜色素上皮细胞，地理萎缩，视网膜下移植，大眼模型

本文介绍了一种将人多能干细胞（hPSC）来源的视网膜组织移植到大型动物模型视网膜下腔的外科手术技术。...

在猫科大型动物模型中进行人胚胎干细胞来源视网膜组织的视网膜下移植

非人灵长类动物（NHP）由于其在解剖结构和遗传上的相似性，是研究人类视网膜细胞治疗的理想模型。本文描述了一种在NHP眼球中进行黄斑下视网膜色素上皮细胞移植的方法，以及预防与黄斑操作相关的术中并发症的策略。...

退行性视网膜疾病非人灵长类动物模型中的视网膜色素上皮移植

视网膜色素上皮（RPE）的视网膜下植入是治疗退行性视网膜疾病最有前景的方法之一。然而，在大眼动物模型上开展临床前研究仍具有挑战性。本报告提供了将RPE细胞搭载于细胞载体上进行视网膜下移植至小型猪的实验操作指南。...

小型猪视网膜下植入携带视网膜色素上皮细胞的载体：术前准备、手术技术及术后护理指南

本方案介绍了一种经瞳孔视觉引导的经巩膜入路，可安全、精确地向患有或不患有视网膜变性的受体小鼠递送视网膜下细胞移植物，且手术并发症发生率较低。...

视网膜变性小鼠模型中经瞳孔引导的经巩膜下视网膜下移植术

我们描述了一种详细的方案，用于制备经冷冻保存后的hESC来源的视光感受器前体细胞，并将其移植到rd10小鼠的视网膜下腔。...

视网膜下移植人胚胎干细胞来源的光感受器前体细胞至 rd10 小鼠

我们提供一种可重复的方法，用于培养人胎儿视网膜色素上皮细胞（hfRPE），使其形成融合的单层细胞，具有成年天然组织的形态学、生理学、极性以及蛋白质和基因表达特征。该研究已拓展至多种眼病的动物模型。...

研究视网膜色素上皮生理学与病理生理学的实验模型

了解一种经巩膜视网膜下注射技术，用于将人视网膜色素上皮细胞精准递送至大鼠眼部。该方法具有自封闭特性，可最大限度降低视网膜损伤风险，为年龄相关性黄斑变性的干细胞治疗提供安全可靠的实验方案。

开发一种优化的大鼠眼经巩膜视网膜下人视网膜色素上皮细胞移植方案

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