Name: 3D磁干细胞聚集和生物反应器为成熟软骨再生 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: 了解利用磁聚集技术与生物反应器动态培养促进间充质干细胞软骨分化的方法。该技术通过机械刺激增强细胞外基质生成，为软骨再生及肌肉、心脏等组织修复提供新策略。

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作者谨此感谢QuinXell Technologies和CellD，特别是Lothar Grannemann和Dominique Ghozlan在生物反应器方面的协助。我们感谢Catherine Le Visage提供了普鲁兰糖/葡聚糖多糖支架。本研究得到了欧洲联盟（ERC-2014-CoG项目MaTissE 648779）以及法国国家研究局（Agence Nationale de la Recherche, ANR）（MagStem项目ANR-11 SVSE5）的资助。

1. 磁性装置的构建
注意：用于细胞接种的装置根据应用而有所不同（图1）。为了形成细胞聚集体，每个聚集体的细胞数量限制为 2.5×105 个，因此磁性尖端必须非常细（直径 750 µm）。为了在 1.8 cm2、7 mm 厚的支架上接种细胞，磁体必须更大（直径 3 mm），以确保细胞通过支架的孔隙迁移。
<ol>
	<li>构建用于聚集体形成的微磁体装置（图1A）
	<ol>
		<li>使用直径为0.8 mm的钻头在铝板（直径3 cm，厚度6 mm）上钻出微孔。</li>
		<li>将磁性尖端（直径750 µm）插入板的每个孔中。</li>
		<li>将该圆盘置于一块永磁钕磁铁上，以确保磁化至饱和。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>构建用于支架接种的装置（图1B）
	<ol>
		<li>将硬质聚苯乙烯切割成2.4 cm2的正方形。</li>
		<li>在1.6 cm2 的面积上等距插入9个小磁体（直径3 mm，长6 mm）。</li>
		<li>将该装置置于一块永磁钕磁铁上。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 干细胞标记
注：干细胞使用 0.1 mM 磁性纳米颗粒标记 30 分钟（2.6 ± 0.2 pg 铁/细胞）以形成细胞聚集体，而用于接种支架时则使用 0.2 mM 磁性纳米颗粒标记 30 分钟（5 ± 0.4 pg 铁/细胞）。此前已发表的研究中曾使用过这些纳米颗粒浓度和孵育时间处理间充质干细胞（MSC）及其他细胞18,19，并已确定纳米颗粒对细胞活力及 MSC 的分化能力均无影响。干细胞摄入的铁含量通过单细胞磁泳法测定19,20。
<ol>
	<li>在完全的间充质干细胞生长培养基（MSCGM）中，于 37 °C 和 5% CO2 条件下培养人源间充质干细胞（MSC），直至细胞接近汇合（约 90%）。</li>
	<li>通过将 0.1 或 0.2 mM 柠檬酸包被的磁赤铁矿氧化铁纳米颗粒（γFe2O3；核心直径：8 nm）溶于无血清的 RPMI 修饰型 McCoy's 5A 培养基（不含谷氨酰胺）并添加 5 mM 柠檬酸钠，制备磁性标记溶液。</li>
	<li>弃去培养基，用无谷氨酰胺的无血清 RPMI 培养基冲洗细胞，然后每 150 cm2 培养瓶加入 10 mL 氧化铁纳米颗粒溶液，该体积为覆盖全部细胞所需的最小体积。</li>
	<li>在 37 °C 和 5% CO2 条件下孵育 30 分钟，随后弃去纳米颗粒溶液。用无谷氨酰胺的无血清 RPMI 培养基冲洗 5 分钟，以促进仍附着于细胞膜表面的纳米颗粒内化。</li>
	<li>弃去 RPMI 培养基，每瓶加入 25 mL 完全 MSCGM 培养基，在 37 °C 和 5% CO2 条件下过夜孵育。</li>
</ol>
3. 磁性细胞接种
<ol>
	<li>使用高糖 Dulbecco 改良伊格尔培养基（DMEM）含 L-谷氨酰胺，添加 50 µM L-抗坏血酸 2-磷酸、0.1 µM 地塞米松、1 mM 丙酮酸钠、0.35 mM L-脯氨酸、1% 含胰岛素、人转铁蛋白和亚硒酸的通用培养补充剂（ITS-Premix），以及 10 ng/mL 转化生长因子-β3（TGF-β3），新鲜配制软骨诱导培养基。</li>
	<li>使用每 150 cm2 培养瓶 8 mL 的 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 消化磁标记细胞，将解离后的细胞在 260 × g 条件下离心 5 分钟。吸除培养基后重悬细胞并计数。</li>
	<li>将底部为玻璃的细胞培养皿（35 mm）放置在两个磁性装置上方。</li>
	<li>为通过磁力形成细胞聚集体，向培养皿中加入 3 mL 软骨诱导培养基，并轻柔地滴加尽可能小的体积（不超过 8 µL），每滴含 2.5×105 个标记细胞（最多可形成 16 个聚集体）。静置培养皿 20–30 分钟，避免移动，以促进球形聚集体形成，随后将包含 16 个聚集体的完整装置置于 37 °C、5% CO2 的培养箱中培养。</li>
	<li>按照相同方案制备对照组聚集体，并用不含 TGF-β3 的软骨诱导培养基完全更换培养液。
	<ol>
		<li>为生成三维聚集体结构，于第 8 天将两个聚集体接触放置，形成 8 个双聚体，启动融合过程；第 11 天将两个双聚体合并，形成 4 个四聚体；最终于第 15 天将 4 个四聚体融合，获得最终结构。</li>
		<li>同时，在 15 mL 离心管中加入 1.5 mL 含或不含 TGF-β3 的软骨诱导培养基（分别用于实验组和对照组），将 2.5×105 个标记干细胞在 260 × g 条件下离心 5 分钟，以形成聚集体。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为通过磁力接种支架，将每个干燥的支架置于培养皿中。使用由普鲁兰多糖/葡聚糖制成的多孔多糖支架21。对每个支架，将 2×106 个标记干细胞悬浮于 350 µL 不含 TGF-β3 的软骨诱导培养基中，小心地将细胞悬液滴加至支架表面。
	<ol>
		<li>在 37 °C 培养 5 分钟，使细胞充分渗入支架内部，随后轻柔地向培养皿中加入 3 mL 含或不含 TGF-β3 的软骨诱导培养基（分别用于实验组和对照组）。</li>
		<li>将接种细胞的支架置于磁性装置上，在 37 °C、5% CO2 条件下培养 4 天，以促进细胞在支架孔隙中的迁移与限域分布。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>同时，采用相同方法将 2×106 个标记干细胞接种至支架，并在无磁条件下培养，以获得均匀接种的支架作为阳性对照。</li>
</ol>
4. 分化为软骨细胞
注意：孵育4天后，移除磁铁，并在培养皿（静态条件）或生物反应器（动态条件）中继续软骨细胞成熟过程。阴性对照样本在不含TGF-β3的软骨诱导培养基中于静态条件下进行成熟培养。
<ol>
	<li>在静态条件下，将接种细胞的支架或细胞聚集体保留在同一培养皿中。每两周更换两次成软骨诱导培养基，持续 21 天。</li>
	<li>在动态条件下，准备生物反应器。
	<ol>
		<li>根据制造商的操作说明，将硅胶管剪裁至适当长度。</li>
		<li>对所有材料进行高压灭菌：500 mL 培养室、管路、双向旋转接头和笼架。</li>
		<li>将生物反应器各部件放入无菌微生物安全操作台中，按照制造商说明将管路连接至双向旋转接头和培养室。</li>
		<li>使用无菌刮铲小心地将接种细胞的支架转移至已灭菌的笼架中，每个笼架放置 2 个支架。待笼架装配完成后，将其插入盖子上的针状固定装置中，以防止后续旋转过程中发生移动。向培养室中加入成软骨诱导培养基，并用带有笼架的盖子密封。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>启动蠕动泵，使成软骨诱导培养基充满管路并排除气泡。</li>
	<li>将装满培养基的培养室固定于生物反应器的电机上，并开启计算机，以控制机械臂和培养室的旋转。</li>
	<li>设置机械臂和培养室的转速均为每分钟 5 转（rpm）。调节蠕动泵的流速至 10 rpm，以实现对接种细胞支架的持续灌注培养。</li>
</ol>
5. RNA 提取与基因表达分析
注意：在RNA提取之前，需用酶溶液消化支架。
<ol>
	<li>通过加入100 μL酶溶液制备1 mL酶解液 &#181;L 普鲁兰酶（40 U/mL）和 50 &#181;850 mL 无血清 DMEM 培养基中加入 dextranase（60 mg/mL）L</li>
	<li>用无血清DMEM培养基将支架冲洗两次，弃去培养基，然后加入800 &#181;每支架加入 L 酶解溶液，37 ℃孵育 15–30 分钟 &#176;C，轻柔振荡。</li>
	<li>当支架完全溶解后，将含有细胞的溶液转移至1.5 mL离心管中，在300 ×g下离心 &#215; g 离心 10 分钟，小心吸除上清液，用无菌 1&#215; 磷酸盐缓冲液（PBS），在300 × g条件下离心 &#215; 10 分钟内以 g 离心，然后将细胞重悬于 RNA 提取液中。</li>
	<li>为了从聚集体中提取RNA，将球状体放入RNA分离溶液中，并使用匀浆器彻底破碎，然后进行RNA提取。</li>
	<li>使用总RNA提取试剂盒，按照制造商说明书提取RNA。</li>
	<li>使用400 ng总RNA，按照制造商说明书，加入250 ng随机引物和1种逆转录酶，合成互补DNA &#181;L dNTP 混合液（各 10 mM）和 40 U/mL RNase 抑制剂；反应终体积为 20 &#181;L. 反应结束时，加入 80 &#181;升蒸馏水以获得最终体积100 &#181;L.</li>
	<li>用于定量聚合酶链式反应（PCR），使用含有荧光试剂的PCR混合液，以定量目的基因的相对表达水平，如聚集蛋白聚糖（AGC）和胶原蛋白II型（Col II），用量为10&#215; 稀释的 cDNA。使用核糖体蛋白大亚基 P0（RPLP0）作为参考基因对基因表达水平进行归一化。采用 2-&#916;&#916;CT 公式，其中 &#916;&#916;CT = &#916;分化条件下的 CT 值 - 均值 &#916;对照条件的 CT 及各组 &#916;CT 表示目的基因的 CT 值减去参考基因（RPLP0）的 CT 值。</li>
	<li>确定统计测量值为平均值 &#177; 均值的标准误差（SEM）。分析时需基于不少于 2 次的独立实验。采用 Student t 检验分析离心沉淀物与磁力融合体之间的统计学差异（* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001）。 &#60; 0.05）。使用Kruskal-Wallis检验（单因素非参数方差分析）确定分化支架与对照支架之间统计学差异的显著性（* p &#60; 0.05).</li>
</ol>
6. 组织学分析
<ol>
	<li>用无菌的 1× PBS 冲洗细胞化支架或聚集体，然后在室温下用 10% 甲醛溶液固定 1 小时，再用 1× PBS 冲洗。</li>
	<li>吸除 PBS，将样品包埋于最佳切割温度化合物（OCT）中，并在浸于液氮的异戊烷浴中速冻。将样品在 -20 °C 下保存。使用冷冻切片机切片，聚集体切取 8 µm 厚的冷冻切片，细胞化支架切取 12 µm 厚的冷冻切片。</li>
	<li>用 0.5% 甲苯胺蓝溶液染色冷冻切片 2 分钟，流水冲洗，经 100% 乙醇脱水，二甲苯透明，最后用光学显微镜封片剂封片。</li>
</ol>

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<li>Campbell, J. J., Lee, D. A., Bader, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+compressive+strain+influences+chondrogenic+gene+expression+in+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biorheology%22%5BJournal%5D)">Dynamic compressive strain influences chondrogenic gene expression in human mesenchymal stem cells.</a> Biorheology. 43, 455-470 (2006).</li>
<li>Vunjak-Novakovic, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioreactor+cultivation+conditions+modulate+the+composition+and+mechanical+properties+of+tissue-engineered+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Bioreactor cultivation conditions modulate the composition and mechanical properties of tissue-engineered cartilage.</a> J Orthop Res. 17 (1), 130-138 (1999).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

首先，由于本文介绍的技术依赖于磁性纳米颗粒的细胞内化，因此一个重要的问题是纳米颗粒在细胞内定位后的去向。确实，铁基纳米颗粒可能因其尺寸、包被材料及暴露时间的不同，引发潜在的毒性或影响细胞的分化能力19,22然而，多项研究表明，使用包封的铁纳米颗粒时，对细胞生理学没有影响23 以磁铁蛋白的形式，一种生物磁性纳米颗粒24，或使用简单的柠檬酸盐包被并具有适当浓度18此外，当氧化铁纳米颗粒在与本文所述相似的条件下使用时（与间充质干细胞共用并用于软骨生成），我们最近证明，在细胞摄取及间充质干细胞球体形成后约10天内，纳米颗粒在内体中会发生快速且近乎完全的降解。有趣的是，这种大规模的降解与游离铁在铁蛋白中的高效储存密切相关，对细胞铁代谢的影响极为有限，预示着其在临床应用中具有良好的前景。25.
<p class="jove_conten...

磁性纳米颗粒已作为磁共振成像（MRI）的对比剂在临床中应用，其治疗用途也在不断拓展。例如，最近研究表明，标记的细胞可以被操控 体内 利用外部磁场，可被引导和/或维持在特定的植入部位1,2,3在再生医学中，它们可用于构建有序的组织 体外4，包括血管组织5,6,7，骨骼8，以及软骨9.
关节软骨处于无血管环境，因此当损伤发生时，细胞外基质成分的修复能力非常有限。正因如此，目前的研究主要集中在工程化透明软骨替代物的开发上，以用于植入损伤部位。为了制备自体来源的替代物，一些研究团队正在探索使用自体软骨细胞作为细胞来源10,11，而另一些团队则强调间充质干细胞（MSC）向软骨细胞分化的潜能12,13。在本研究回顾的前期工作中，我们选择了MSC，因为其骨髓取样相对简便，且无需牺牲健康软骨细胞，从而避免了后者可能发生的表型丢失风险14。
启动干细胞软骨向分化的关键早期步骤之一是细胞的聚集。通常采用离心或微团培养方法形成细胞聚集体15；然而，这些聚集方法既无法在较厚的支架内形成细胞簇，也无法控制聚集体之间的融合。本文中，我们介绍了一种利用间充质干细胞（MSC）磁性标记与磁力吸引来聚集干细胞的创新方法。该技术已被证实可通过聚集体之间的融合形成无支架的三维结构，从而获得毫米尺度的软骨组织9。对厚而大的支架进行磁性接种，还为增加工程化组织的尺寸、设计更适用于植入的形状以及拓展软骨修复领域的临床应用潜力提供了可能。本文详细描述了将MSC磁性接种至由天然多糖——普鲁兰多糖（pullulan）和葡聚糖（dextran）构成的多孔支架中的实验方案，此类支架此前已被用于限制干细胞16,17。最后，在生物反应器中进行软骨向分化，以确保营养物质和气体能够持续扩散至高密度接种细胞的支架基质核心。该生物反应器不仅为细胞提供营养、软骨诱导生长因子和气体，还可提供机械刺激。总体而言，用于限制干细胞的磁性技术结合生物反应器中的动态成熟培养，可显著增强软骨向分化效果。

<table><tbody><tr><td>氧化铁（磁赤铁矿）纳米颗粒（&amp;gamma;-Fe&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;）</td><td>PHENIX - 巴黎第六大学</td><td>由 C. M&amp;eacute;nager 制备并提供</td><td>平均直径为 8.1 nm，表面带负电荷</td></tr><tr><td>多糖普鲁兰/葡聚糖支架</td><td>LIOAD - 南特大学</td><td>由 C. Le Visage 制备并提供</td><td>由碱性条件下（10&amp;nbsp;M NaOH）的 75:25 普鲁兰/葡聚糖混合物制备而成。孔隙尺寸：185–205&amp;nbsp;&amp;micro;m；厚度：7&amp;nbsp;mm；表面积：1.8&amp;nbsp;cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;。</td></tr><tr><td>TisXell 再生系统</td><td>QuinXell Technologies</td><td>QX900-002</td><td>具有 500 mL 培养腔的双轴生物反应器&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>支架用笼：Histosette II M492&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>720-0909</td><td></td></tr><tr><td>间充质干细胞（MSC）</td><td>Lonza</td><td>PT-2501</td><td>使用了三个独立批次</td></tr><tr><td>MSCGM BulletKit 培养基</td><td>Lonza</td><td>PT-3001</td><td>配制完全培养基时，将提供的 BulletKit（含血清、谷氨酰胺和抗生素）加入 MSCGM 培养基中</td></tr><tr><td>含 Glutamax I 的 DMEM 培养基</td><td>Life Technologies</td><td>31966-021</td><td>不含丙酮酸钠，不含 HEPES</td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基，不含谷氨酰胺</td><td>Life Technologies</td><td>31870-025</td><td>不含丙酮酸钠，不含 HEPES</td></tr><tr><td>不含 CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 和 MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 的 PBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>0.05% 胰蛋白酶-EDTA（1x）</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>青霉素（10,000&amp;nbsp;U/mL）/链霉素（10,000&amp;nbsp;&amp;micro;g/mL）</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>ITS 通用培养补充剂预混液（20x）</td><td>Corning</td><td>354352</td><td></td></tr><tr><td>100 mM 丙酮酸钠溶液</td><td>Sigma</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>L-抗坏血酸-2-磷酸</td><td>Sigma</td><td>A8960</td><td>使用蒸馏水现配成 25 mM 的浓缩溶液</td></tr><tr><td>L-脯氨酸</td><td>Sigma</td><td>P5607</td><td>用蒸馏水配制成 175 mM 的储存液，并于 4&amp;nbsp;&amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>地塞米松</td><td>Sigma</td><td>D4902</td><td>用 100% 乙醇配制成 1 mM 的储存液，并于 -20&amp;nbsp;&amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>TGF-β3 蛋白 10&amp;nbsp;&amp;micro;g</td><td>Interchim</td><td>30R-AT028</td><td></td></tr><tr><td>三水合柠檬酸钠</td><td>VWR</td><td>33615.268</td><td>用蒸馏水配制成 1&amp;nbsp;M 的储存液，并于 4&amp;nbsp;&amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>来自 &lt;em&gt;Bacillus acidopullulyticus&lt;/em&gt; 的普鲁兰酶</td><td>Sigma</td><td>P2986</td><td></td></tr><tr><td>来自 &lt;em&gt;Chaetomium erraticum&lt;/em&gt; 的葡聚糖酶</td><td>Sigma</td><td>D0443</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin RNA 提取试剂盒</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740955.5</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript II 逆转录酶</td><td>Life Technologies</td><td>18064-014</td><td></td></tr><tr><td>随机引物-六聚体&amp;nbsp;</td><td>Promega</td><td>C1181</td><td>500 &amp;micro;g/mL：使用时稀释至 1/2，每样本加入 1 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>重组 RNAsin 核糖核酸酶抑制剂</td><td>Promega</td><td>N2511</td><td>40 U/&amp;micro;L：每样本加入 1 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>PCR 核苷酸 dNTP 混合液（每种 10&amp;nbsp;mM）</td><td>Roche</td><td>10842321</td><td></td></tr><tr><td>SyBr Green PCR 主混合液</td><td>Life Technologies</td><td>4368708</td><td></td></tr><tr><td>Step One Plus 实时荧光定量 PCR 系统</td><td>Life Technologies</td><td>4381792</td><td></td></tr><tr><td>10% 中性缓冲福尔马林溶液</td><td>Sigma</td><td>HT5012</td><td></td></tr><tr><td>OCT 包埋剂</td><td>VWR</td><td>361603E</td><td></td></tr><tr><td>异戊烷</td><td>Sigma</td><td>M32631</td><td></td></tr><tr><td>甲苯胺蓝 O</td><td>VWR</td><td>1.15930.0025</td><td></td></tr><tr><td>无水乙醇</td><td>VWR</td><td>20821.310</td><td></td></tr><tr><td>甲苯</td><td>VWR</td><td>1.08323.1000</td><td></td></tr><tr><td>封片剂 Pertex</td><td>Histolab</td><td>840</td><td></td></tr><tr><td>qPCR 用 RPLP0 引物</td><td>Eurogentec</td><td></td><td>5'-TGCATCAGTAC&lt;br/&gt; CCCATTCTATCAT-3'；&lt;br/&gt; 5'-AAGGTGTAATC&lt;br/&gt; CGTCTCCACAGA-3'</td></tr><tr><td>qPCR 用聚集蛋白聚糖引物</td><td>Eurogentec</td><td></td><td>5'-TCTACCGCTGCGAGGTGAT-3'；3'-TGTAATGGAACACGATGCCTTT-5'</td></tr><tr><td>qPCR 用 II 型胶原引物</td><td>Eurogentec</td><td></td><td>5'-ACTGGATTGACCCCAACCAA-3'；3'-TCCATGTTGCAGAAAACCTTCA-5'</td></tr></tbody></table>

三维磁性干细胞聚合并结合生物反应器成熟化用于软骨再生

3D Magnetic Stem Cell Aggregation and Bioreactor Maturation for Cartilage Regeneration

软骨组织工程由于在构建一种 体外 功能上类似于天然组织的植入物。近期探索的一种用于构建自体替代物的方法，涉及将干细胞分化为软骨细胞。为启动这一软骨形成过程，需要一定程度的干细胞聚集；因此，我们证明了利用微型化磁场源作为细胞吸引装置，可在厚支架内及无支架条件下实现细胞的磁性浓缩。该磁性方法还被用于引导细胞聚集体融合，构建出尺寸达数毫米、无支架且结构有序的三维（3D）组织。与对照相比，通过磁驱动融合形成的组织不仅体积显著增大，且II型胶原表达明显升高，聚集蛋白聚糖的表达也呈现相似的上升趋势。鉴于天然软骨在发育过程中受到力学作用影响其三维结构，本研究进一步实施了动态成熟培养。采用可提供机械刺激的生物反应器，对经磁性接种的支架进行为期21天的培养。生物反应器中的成熟过程显著促进了细胞支架内的软骨形成，所得细胞外基质富含II型胶原和聚集蛋白聚糖。本研究阐明了磁性浓缩标记干细胞结合生物反应器动态成熟培养在促进软骨向分化方面的创新潜力，无论是在无支架条件下还是在多糖支架内均具有应用前景。

首先，可通过微磁体单独形成聚集体，方法是接种 2.5×105 个标记的干细胞（图 2A）。这些单个聚集体（大小约 0.8 mm）随后可通过连续的磁力诱导融合，进一步组装成更大的结构。例如，在软骨分化成熟的第 8 天，将聚集体两两接触放置以形成双聚体；第 11 天通过合并两个双聚体形成四聚体；最终在第 15 天，将 4 个四聚体融合，形成一个包含最初 16 个聚集体的三维结构，共含有 4×106 个细胞（大小约 4 mm）（图 2B）。其次，相同的磁吸引技术也可用于在支架内形成细胞聚集体。将支架接种于磁性装置上，可在支架孔隙内、精确对应微磁体位置处观察到高度密集的细胞凝聚（图 2C）。相比之下，若在无磁吸引条件下接种细胞（被动接种），细胞则呈现均匀分布。随后将含有细胞的支架置入笼状结构中（图 3A），并连接至生物反应器腔室，以在动态成熟条件下进行软骨分化过程（图 3B</stron...

干细胞向软骨分化需要精细调控培养条件。本文介绍一种利用磁力方法聚集细胞的技术，这是启动软骨分化的关键步骤。此外，我们还表明，在生物反应器中进行动态成熟培养可对细胞构建物施加机械刺激，从而增强软骨样细胞外基质的生成。

软骨组织工程仍面临挑战，原因在于难以在体外构建出功能上类似于天然组织的植入物。一种方法……

本磁性细胞聚集与动态成熟方法的总体目标是改善间充质基质细胞（MSC）的体外软骨形成能力。利用干细胞的磁性聚集替代传统软骨形成过程中的细胞凝聚，是软骨再生过程中的早期关键步骤。在干细胞被限制于支架中后，可将支架转移至细胞生物反应器中，以评估细胞的动态成熟情况。重要动力学方法可应用于其他生物系统，如肌肉、心脏或血管修复。但如您所见，该方法非常适用于软骨再生。利用实际生物反应器对磁力细胞接种和动态细胞成熟进行可视化演示至关重要，因为仅通过文字说明难以掌握这两种技术。为构建用于聚集体形成的微型磁体装置，首先将直径为750微米的磁性尖端插入一块厚度为六毫米的铝板上的每个三厘米孔中，并将该铝板放置在一块永磁钕磁铁上方。为构建用于支架接种的装置，首先将硬质聚苯乙烯切割成2.4平方厘米的正方形，并在1.6平方厘米的表面上等距离插入直径为三毫米、长六毫米的磁体，然后将该装置置于一块永磁钕磁铁上方。为了标记人源MSC，首先在37摄氏度、5%二氧化碳条件下，使用完全MSC生长培养基培养干细胞，直至细胞融合度达到90%。吸除培养基后，用不含谷氨酰胺的Serum three RPMI培养基冲洗细胞，然后每150平方厘米培养瓶加入10毫升氧化铁纳米颗粒溶液，在细胞培养箱中孵育30分钟。孵育结束后，用不含谷氨酰胺的Serum three RPMI培养基冲洗细胞5分钟，以使仍附着在质膜上的纳米颗粒被细胞内化。然后将每个烧瓶中的 RPMI 替换为 25 毫升完全 MSC 培养基，并将细胞放回细胞培养箱中过夜。次日早晨，用每瓶 8 毫升的 0.5% 胰蛋白酶-EDTA 解离磁性细胞，并通过离心收集解离的细胞。我们将细胞沉淀重悬后进行计数，并将玻璃底35毫米细胞培养培养皿放置在每个磁性装置上方。为通过磁力形成细胞聚集体，向每个培养皿中加入3毫升软骨诱导培养基，并轻柔地接种不超过8微升的标记细胞悬液，每份悬液含2.5 × 10⁵个细胞。接种细胞时速度既不能过慢也不能过快，这一点至关重要。与磁场的距离既不宜过近，也不宜过远。待所有细胞聚集体放置完毕后，静置20-30分钟，使其形成类球体，期间避免扰动。随后将聚集体转移至细胞培养孵育箱中。同一天，将2.5 × 10⁵个标记的干细胞在含有1.5 mL软骨诱导培养基的15 mL锥形管中离心，形成细胞聚集体。为实现磁力接种支架，每个培养皿中放置一个干燥的普鲁兰糖/葡聚糖多糖多孔支架，并将2 × 10⁶个标记细胞悬浮于350 µL不含TGFβ3的软骨诱导培养基中。小心地将细胞悬液滴加至支架上，随后将结构物置于37 °C孵育，以确保细胞完全渗透。五分钟后，向培养皿中轻柔加入三毫升软骨诱导培养基，将支架放回细胞培养箱中培养四天，以使细胞迁移穿过支架孔隙。同一天，另取一组支架，以2×10⁶个标记的干细胞接种，方法如前所述，但不使用磁铁孵育细胞，以获得均匀接种的支架作为阳性对照。在第五天进行支架内软骨形成时，移除所有支架上的磁性装置，将静态支架放回细胞培养箱中继续培养至第25天，每周更换两次培养基。根据制造商说明，在第五天将硅胶管剪裁至适当长度，用于动态细胞培养，并将管路、500毫升培养室、双向旋转器和笼架放入无菌微生物安全操作台中。按照制造商说明，将管路连接至培养室内的双向旋转器。然后使用无菌刮铲小心地将两个接种了细胞的支架分别转移至每个笼架中。将所有支架转移后，将笼子插入盖子上的针头中，以防止其在旋转过程中移动。然后向培养室中加入软骨诱导培养基。准备培养室时应使用无菌防腐技术，以避免任何工具或支架受到污染。接下来，将笼子插入腔室，然后关闭腔室并启动蠕动泵，以软骨诱导培养基填充管路并排除气泡。将装填完毕的腔室放置于生物反应器的电机内并固定，然后打开控制机械臂和腔室旋转的计算机。随后，将机械臂和腔室的旋转速度均设为每分钟5转，并调节蠕动泵的流速至每分钟10转，以实现对接种细胞支架的持续灌注培养。在第8天，通过将两个聚集体置于软骨诱导培养基中相互接触，形成八个双聚体，从而启动无支架的三维聚集体构建。然后在第11天将两个双聚体合并，形成四个四聚体，并在第15天通过融合这四个四聚体构建最终结构。通过磁力融合形成的组织与通过离心获得的细胞球相比，II型胶原蛋白的表达显著增加。随着聚集相关基因表达的增强，在使用磁力接种的细胞化静态支架中，聚集相关基因和II型胶原的表达均较无磁力接种的支架有所增加。有趣的是，当磁力接种与动态分化相结合时，II型胶原的表达显著更高。使用甲苯胺蓝进行组织学分析显示，16个聚集体的顺序磁性融合表现出丰富的氨基葡萄糖糖胺沉积。进一步研究表明，在磁性接种的支架中，当支架在生物反应器中分化时，其氨基葡萄糖糖胺含量高于静态培养条件下的支架。一旦掌握该技术，若操作得当，磁性细胞聚集可在两小时内完成。进行此操作时，重要的是记住应将标记的细胞重悬于尽可能小的体积中，以促进聚集体的形成。在使用磁力接种支架后，可通过实际的生物反应器进行动态成熟培养，以增强新合成软骨细胞的表达。自该技术发展以来，为再生医学领域的研究人员探索人类关节软骨再生提供了新的途径。观看本视频后，您应能够充分了解如何构建磁性装置、对干细胞聚集体来源的干细胞进行标记、利用磁场将支架接种细胞，以及如何使用实际的生物反应器。请务必注意，操作人体细胞和组织可能具有极高危险性，必须始终采取预防措施，例如佩戴手套、实验服和防护眼镜。

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科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

3D磁干细胞聚集和生物反应器为成熟软骨再生

本演示的目的是展示一种高度可重复的方法，用于在软骨缺损中生成可被磁共振成像（MR成像）可视化的基质相关干细胞植入物。干细胞使用美国食品药品监督管理局（FDA）批准的超顺磁性氧化铁颗粒Ferumoxides进行标记，与琼脂糖混合后植入软骨缺损区域，并使用7T磁共振扫描仪进行成像。...

植入氧化铁标记的人类间充质干细胞修复软骨缺损

我们设计了一种新型机械负荷生物反应器，可在将软骨生物复合材料移植到关节软骨缺损部位之前，对其施加单轴或双轴机械应变。...

用于组织工程的双轴机械加载生物反应器设计

本研究介绍了一种通过直接培养胶原蛋白、平滑肌细胞和内皮细胞来快速制备活体血管组织的技术。此外，还描述了一种用于工程化血管组织力学表征的新方案。...

用于血管组织再生的三维细胞化胶原凝胶的构建

软骨修复是一项尚未满足的医学挑战，而基于细胞的人关节软骨组织工程技术是一种有前景的解决方案。本文中，我们描述了三维（3D）仿生水凝胶作为扩增和成熟人关节软骨细胞的理想工具。...

用于关节软骨细胞培养与软骨生成的三维水凝胶支架

本文介绍了一种在自组装肽支架中建立三维培养系统以促进去分化的成人关节软骨细胞向类软骨组织分化的实验方案。...

在三维肽支架中培养哺乳动物细胞

本文介绍了一种简单且经济的实验方案，用于直接从新西兰白兔的滑膜液中分离和纯化间充质干细胞。...

利用磁激活细胞分选策略从兔模型中分离和纯化滑膜液来源的间充质干细胞

三维单轴机械刺激生物反应器系统是肌腱来源干细胞向肌腱特异性分化及新生肌腱形成的理想生物反应器。...

应用三维单轴机械刺激生物反应器系统诱导肌腱来源干细胞的肌腱向分化

通过植入由间充质干细胞构建的人工软骨组织，以软骨内成骨方式实现骨修复，有望克服传统治疗方法的局限性。透明质酸水凝胶在规模化制备均一分化软骨移植物以及促进融合移植物间血管化整合骨形成方面具有显著优势。 体内.

通过整合性骨形成 在体 内 利用间充质干细胞进行软骨内成骨

本研究描述了一种通过在低黏附条件下利用重力使细胞聚集形成软骨细胞球体，随后将所得球体在微型生物反应器中进行培养的方法。...

利用重力条件和自制微型生物反应器在低黏附环境下由不同软骨细胞生成球状体

人类血管周围干细胞（PSCs）是一类新型干细胞，可用于骨骼组织再生，其功能类似于间充质干细胞（MSCs）。PSCs可通过FACS（荧光激活细胞分选）从标准吸脂手术中获取的脂肪组织中分离，随后与成骨诱导性支架材料结合，以实现骨形成。 体内.

使用人血管周围干细胞进行骨再生

了解利用磁聚集技术与生物反应器动态培养促进间充质干细胞软骨分化的方法。该技术通过机械刺激增强细胞外基质生成，为软骨再生及肌肉、心脏等组织修复提供新策略。

三维磁性干细胞聚合并结合生物反应器成熟化用于软骨再生

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