三维磁性干细胞聚合并结合生物反应器成熟化用于软骨再生

本磁性细胞聚集与动态成熟方法的总体目标是改善间充质基质细胞（MSC）的体外软骨形成能力。利用干细胞的磁性聚集替代传统软骨形成过程中的细胞凝聚，是软骨再生过程中的早期关键步骤。在干细胞被限制于支架中后，可将支架转移至细胞生物反应器中，以评估细胞的动态成熟情况。

重要动力学方法可应用于其他生物系统，如肌肉、心脏或血管修复。但如您所见，该方法非常适用于软骨再生。利用实际生物反应器对磁性细胞接种和动态细胞成熟进行可视化演示至关重要，因为仅通过文字说明难以掌握这两种技术。

为构建用于聚集体形成的微型磁体装置，首先将直径为750微米的磁性尖端插入一块厚度为六毫米的铝板上的每个三厘米孔中，并将该铝板放置在一块永磁钕磁铁上方。为构建用于支架接种的装置，首先将硬质聚苯乙烯切割成2.4平方厘米的正方形，并在1.6平方厘米的表面上等距离插入直径为三毫米、长六毫米的磁体，然后将该装置置于一块永磁钕磁铁上方。

为了标记人源MSC，首先在37摄氏度、5%二氧化碳条件下，使用完全MSC生长培养基培养干细胞，直至细胞融合度达到90%。吸除培养基后，用不含谷氨酰胺的Serum three RPMI培养基冲洗细胞，然后每150平方厘米培养瓶中加入10毫升氧化铁纳米颗粒溶液，在细胞培养箱中孵育30分钟。孵育结束后，用不含谷氨酰胺的Serum three RPMI培养基冲洗细胞5分钟，以使仍附着在质膜上的纳米颗粒内化。

然后将每个烧瓶中的 RPMI 替换为 25 毫升完全 MSC 生长培养基，并将细胞放回细胞培养箱中过夜。次日早晨，用每瓶 8 毫升的 0.5% 胰蛋白酶-EDTA 解离磁性细胞，并通过离心收集解离的细胞。

我们将细胞沉淀重悬后进行计数，并将玻璃底35毫米细胞培养培养皿放置在每个磁性装置上方。为通过磁力形成细胞聚集体，向每个培养皿中加入3毫升软骨诱导培养基，轻柔地加入不超过8微升的标记细胞悬液，每微升含2.5 × 10⁵个细胞。细胞滴加速度既不能过慢，也不能过快，这一点至关重要。

与磁场的距离既不宜过近，也不宜过远。待所有细胞聚集体放置完毕后，静置20-30分钟，使其形成球状体，期间避免扰动。随后将聚集体转移至细胞培养孵箱中。

同一天，将2.5 × 10⁵个标记的干细胞在含有1.5 mL软骨诱导培养基的15 mL锥形管中离心，形成细胞聚集体。为通过磁力接种支架，每个培养皿中放置一个干燥的普鲁兰糖/葡聚糖多糖多孔支架，并将2 × 10⁶个标记细胞悬浮于350 µL不含TGFβ3的软骨诱导培养基中。小心地将细胞悬液滴加至支架上，于37 °C孵育，以确保细胞完全渗透。

五分钟后，轻轻向培养皿中加入三毫升软骨诱导培养基，将支架放回细胞培养箱中培养四天，以使细胞通过支架孔隙迁移。同一天，另取一组支架，以2×10⁶个标记的干细胞进行接种，如前所述操作，但不使用磁铁，以获得均匀接种的支架作为阳性对照。在第五天进行支架内软骨形成时，移除所有支架上的磁性装置，将静态支架放回细胞培养箱中继续培养至第25天，每周更换两次培养基。

根据制造商的说明，在第五天也需将硅胶管切割至适当长度，并将管路、500毫升培养室、双向旋转器和笼架放入无菌的微生物安全操作台中，用于动态细胞培养。按照制造商的说明，将管路连接至培养室中的双向旋转器。然后使用无菌刮铲小心地将两个接种了细胞的支架转移至每个笼架中。

将所有支架转移后，将笼子插入盖子上的针头中，以防止旋转过程中支架移动。然后用软骨诱导培养基填充培养室。准备培养室时应使用无菌防腐技术，以避免任何工具或支架受到污染。

接下来，将笼子插入腔室，然后关闭腔室并启动蠕动泵，以使软骨诱导培养基充满管路并排除气泡。将装填完毕的腔室放置并固定在生物反应器的电机内，启动控制机械臂和腔室旋转的计算机。随后，将机械臂和腔室的旋转速度均设为每分钟5转，并调节蠕动泵至每分钟10转的流速，以持续向接种细胞的支架供给培养基。

在第8天，通过将两个聚集体置于软骨诱导培养基中相互接触，形成八个双聚体，从而启动无支架的三维聚集体结构的构建。然后在第11天将两个双聚体合并，形成四个四聚体，并在第15天通过融合这四个四聚体构建最终结构。通过磁力融合形成的组织与通过离心获得的细胞球相比，II型胶原蛋白的表达显著增加。

随着聚集体表达的增加，与未使用磁力接种的支架相比，细胞化静态支架在采用磁力接种时，聚集体以及II型胶原的表达均有所上升。有趣的是，当磁力接种与动态分化相结合时，II型胶原的表达显著更高。

使用甲苯胺蓝进行组织学分析显示，16个聚集体的顺序磁性融合表现出丰富的氨基葡萄糖糖胺沉积。进一步研究表明，在磁性接种的支架中，当支架在生物反应器中分化时，其氨基葡萄糖糖胺含量高于静态培养条件下的含量。一旦掌握该技术，若操作得当，磁性细胞聚集可在两小时内完成。

进行该操作时，重要的是记住应将标记的细胞重悬于尽可能小的体积中，以促进聚集体的形成。在使用磁力接种支架后，可通过实际的生物反应器进行动态成熟培养，以增强新合成软骨细胞的表达。自该技术发展以来，为再生医学领域的研究人员探索人类关节软骨再生提供了新的途径。

观看本视频后，您应能够充分理解如何构建磁性装置、对干细胞聚集体来源的干细胞进行标记、利用磁场将支架接种细胞，以及如何使用实际的生物反应器。请务必注意，操作人体细胞和组织可能具有极高危险性，必须始终采取预防措施，例如佩戴手套、实验服和防护眼镜。