Name: 人肺树突状细胞:空间分布与表型鉴定支气管活检采用免疫组化和流式细胞仪 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: 了解人肺树突状细胞的空间分布与表型鉴定方法，采用免疫组化和流式细胞仪分析支气管活检样本。该技术有助于研究肺部免疫反应机制。

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作者谨向为本研究提供临床样本的志愿者表示感谢。同时，我们感谢乌meå大学医院（Norrlands universitetssjukhus）公共卫生与临床医学系内科/呼吸内科的工作人员，他们负责收集了所有临床样本。
本研究得到了瑞典研究理事会、瑞典心脏-肺基金会、瑞典战略研究基金会以及卡罗林斯卡学院向 AS-S 提供的资助。

注意：本研究已获得乌默奥地区伦理审查委员会的批准&#229;瑞典
1. 对人体进行支气管镜检查以采集支气管内活检样本
<ol>
	<li>向所有参与者获取知情同意书。</li>
	<li>支气管镜检查前30分钟，给予受试者口服咪达唑仑（4–8 mg）和静脉注射格隆溴铵（0.2–0.4 mg）。使用利多卡因对喉部和支气管进行局部麻醉。让受试者用约3 ml的4%利多卡因含漱，并通过喉部注射器将3 ml利多卡因喷洒于舌根和喉部。再使用8–10次利多卡因喷雾进一步优化局部麻醉效果。此步骤应在受试者坐位时进行。</li>
	<li>让受试者取仰卧位，通过塑料咬口器经口插入纤维支气管镜。经支气管镜使用专用喷雾导管对远端气管和支气管完成局部麻醉，此处使用约5–10 ml的2%利多卡因。</li>
	<li>使用带窗活检钳从主隆突及主支气管分叉处采集6–9份支气管黏膜活检样本（图1）。支气管镜检查结束后、离院前，让受试者休息2–4小时，并提供清淡饮食。</li>
</ol>
2. 将活检组织包埋于甲基丙烯酸羟乙酯（GMA）树脂中
注意：GMA 免疫染色方案最初由南安普顿大学组织化学研究组开发17。
<ol>
	<li>固定：进行免疫组织化学染色时，将活检组织从镊子上取下，直接放入含有 3 ml 冰冷无水丙酮以及蛋白酶抑制剂（苯甲基磺酰氟（35 mg/100 ml 丙酮）和碘乙酰胺（370 mg/100 ml 丙酮））的玻璃小瓶中。在 -20 °C 下固定组织过夜（图 2）。
	 
	注意：以下步骤应在通风橱中佩戴适当的腈类手套进行操作。包埋试剂盒中的组分可能引起致敏、刺激和/或过敏性皮肤反应。所有废弃物必须作为危险废物处理。</li>
	<li>脱水：移除含抑制剂的丙酮，加入新鲜的无水丙酮（不含抑制剂），室温（RT）孵育 15 分钟。移除丙酮，再加入苯甲酸甲酯孵育 15 分钟。</li>
	<li>浸润：配制含 5% 苯甲酸甲酯的乙二醇甲基丙烯酸酯单体处理液；每瓶使用 10 ml 即可。用塑料巴斯德吸管吸除苯甲酸甲酯溶液，加入 3 ml 处理液。将活检组织与过量处理液一起在 4 °C 下孵育 2 小时；此后所有溶液更换步骤（包括包埋液）均可使用巴斯德吸管操作。</li>
	<li>每 2 小时更换一次处理液（共更换 3 次，每次孵育 2 小时），使活检组织在处理液中的总浸润时间至少为 6 小时。将纸质标签插入包埋胶囊的顶端，以标识不同活检样本。</li>
	<li>配制包埋液：将 75 mg 过氧化苯甲酰溶于 10 ml 乙二醇甲基丙烯酸酯单体中。向包埋液中加入 0.25 ml N,N-二甲基苯胺聚氧化乙烯（加速剂），以启动聚合反应。移除处理液，用镊子将一个活检组织放入相应的包埋胶囊中。</li>
	<li>缓慢用包埋液充满包埋胶囊至顶部，拧紧盖子。注意避免扰动组织或产生大气泡。将胶囊在 4 °C 下孵育，直至树脂完全聚合。</li>
	<li>将包埋好的活检组织储存于 -20 °C 的 50 ml 离心管中，管内放置约 5 g 硅胶以保持干燥。</li>
</ol>
3. 甲基丙烯酸缩水甘油酯包埋的支气管内活检组织切片
<ol>
	<li>显微镜载玻片包被：将显微镜载玻片放入洗碗机中，按常规程序清洗。取出后覆盖并使其自然晾干。</li>
	<li>配制10%聚-L-赖氨酸（PLL）溶液（以蒸馏水稀释）。将载玻片完全浸入包被液中5分钟，随后取出自然晾干。将干燥后的PLL包被载玻片存放于原装盒中。</li>
	<li>用含0.1% Tween 20的蒸馏水清洗玻璃条，再用70%乙醇冲洗，并用纸巾擦干。使用刀具切割器从玻璃条上切下玻璃刀片。将刀片存放在可防止移动的容器中，以确保切割边缘不被损坏或划伤。</li>
	<li>活检组织修块：将活检包埋胶囊置于胶囊切割器中，使用碳素钢单刃刀片沿两侧切开。取出GMA包埋的活检组织，牢固地夹入台钳中。用钢刀修去组织周围的多余GMA。</li>
	<li>GMA切片。
	<ol>
		<li>用蒸馏水配制0.05%氨水溶液。将玻璃刀和活检样本装入切片机中。通过调节刀架和样本块的角度，仔细对齐样本块与刀片，使刀片平整贴合于样本块表面。</li>
		<li>使用切片机以缓慢的切片速度切取2 µm厚的切片，用镊子将切片转移至氨水中漂浮。让切片在氨水中漂浮45–90秒，以实现温和的抗原修复和切片展开。</li>
		<li>用显微镜载玻片捞取切片。使用甲苯胺蓝快速染色以检查活检组织学结构。</li>
		<li>将载玻片置于50 °C的加热板上干燥，并用塑料巴斯德吸管向切片滴加500 µl过滤后的甲苯胺蓝染液。在加热板上加热切片，直至染液边缘开始出现绿色环状，然后用水冲洗干净。</li>
		<li>在光学显微镜下检查活检组织学结构。用于免疫组织化学的切片应包含完整且未受损的固有层和上皮区域，腺体和平滑肌成分应尽可能少。</li>
		<li>参照步骤3.4.2，切取组织学质量良好的切片，并用PLL包被的显微镜载玻片捞取，用于免疫组织化学染色。每个活检样本至少切取两片用于分析。切片干燥至少1小时。干燥后，切片可用锡箔纸包裹，于-20 °C保存最多2周，或直接进行免疫染色。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. GMA包埋的支气管内活检组织的免疫组织化学染色
注意：叠氮化钠具有毒性。请在通风橱内且远离酸类的条件下配制0.1%的叠氮化钠溶液。与酸接触会释放有毒气体。
<ol>
	<li>使用金刚石笔在切片周围划线，并将载玻片放置于染色架上。</li>
	<li>进行过氧化物酶封闭。配制含有0.3%过氧化氢和0.1%叠氮化钠的过氧化物酶封闭液。每张切片加入1 ml封闭液，室温孵育30分钟。</li>
	<li>配制0.05 M Tris缓冲生理盐水（TBS），pH 7.6。将载玻片在TBS中洗涤，每次5分钟，共洗3次。</li>
	<li>在DMEM中配制1% BSA封闭液。提前大量配制，分装后冷冻保存备用。弃去TBS，每张切片加入封闭液，室温孵育30分钟以阻断非特异性抗体结合。若仍存在非特异性结合，可增加一步使用与二抗同源物种的5%血清封闭液，室温孵育30分钟。</li>
	<li>将一抗（CD45或CD1a）用TBS稀释至所需浓度（CD45按1:1,000稀释；CD1a按1:1,00稀释），加至切片上。加盖盖玻片，室温孵育过夜。</li>
	<li>用TBS洗涤载玻片3次。将生物素标记的二抗（针对一抗宿主物种，本实验中为兔抗小鼠F(ab'2)）用TBS稀释至适当浓度（1:300稀释），加至切片上，室温孵育2小时。</li>
	<li>至少在使用前30分钟配制链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物，确保用量足以覆盖所有切片。用TBS洗涤载玻片3次后，将复合物溶液加至切片上，室温孵育2小时。</li>
	<li>用TBS洗涤载玻片3次。按制造商说明配制3-氨基-9-乙基咔唑（AEC）过氧化物酶底物溶液，加至切片上，孵育20–30分钟，或直至显色达到理想强度。</li>
	<li>用流动自来水冲洗载玻片5分钟。用滤过的Mayer苏木精溶液复染切片2分钟，再用流动自来水冲洗5分钟。</li>
	<li>弃去水分，切片上加水溶性永久封片剂。将载玻片置于80 °C烘箱中干燥。待冷却后，用DPX封固剂封片并加盖盖玻片。</li>
</ol>
5. 染色分析
<ol>
	<li>使用带有连接至计算机的摄像头的光学显微镜，在40倍放大倍数下分析切片。 
	注意：进行细胞分析时，计数支气管固有层和完整上皮内呈阳性染色且具有细胞核的细胞，排除平滑肌区域、腺体、大血管以及不匹配或受损的组织区域。</li>
	<li>计算细胞计数的平均值，并根据固有层面积和上皮长度对平均细胞计数进行校正。固有层面积和上皮长度可通过图像分析软件计算得出。</li>
</ol>
6. 支气管内活检组织的酶消化
<ol>
	<li>清洗活检组织：使用无菌镊子将完整的活检组织放入含有10 ml Hank's平衡盐溶液（HBSS）的15 ml锥形管中（图3）。在室温下，以30 rpm的转速在摇床上孵育5分钟。通过倾倒15 ml管中的HBSS内容物，将活检组织转移至无菌培养皿中。</li>
	<li>使用DTT破坏黏液：将管中的HBSS更换为含有5 mM 1,4-二硫苏糖醇（DTT）的10 ml HBSS。使用无菌镊子将活检组织重新转移回15 ml锥形管中。在室温下，以30 rpm的转速在摇床上孵育15分钟。</li>
	<li>轻轻涡旋振荡管子15秒。通过倾倒含有HBSS和DTT的15 ml管内容物，将活检组织转移至无菌培养皿上。</li>
	<li>将活检组织转移至培养基中：将管中的HBSS和DTT更换为10 ml RPMI 1640培养基。使用无菌镊子将活检组织重新转移回15 ml锥形管中。在室温下，以30 rpm的转速在摇床上孵育10分钟。</li>
	<li>使用胶原酶和DNase消化活检组织。
	<ol>
		<li>在预热的RPMI培养基中配制含有1 M HEPES溶液的胶原酶II（0.25 mg/ml）和DNase（0.2 mg/ml）的消化液。每孔加入500 µL消化液至48孔组织培养板中。</li>
		<li>每孔放入一个活检组织至消化液中。将培养板置于37 °C、220 rpm的摇床上孵育60分钟。在30分钟后用移液器吹打混匀以重新分散组织，60分钟后再次吹打以彻底解离组织。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备单细胞悬液。
	<ol>
		<li>将消化后的活检组织从各孔中收集至50 ml离心管中，通过40 µm细胞筛过滤。用冰浴的FACS缓冲液（含2%胎牛血清的磷酸盐缓冲液（PBS））冲洗各孔，以收集残留细胞。</li>
		<li>使用注射器推杆的尾部挤压细胞筛上残留的组织。在4 °C条件下，以400 × g离心5分钟。小心吸除上清液，并将沉淀重悬于5 ml冰浴的FACS缓冲液中。使用血细胞计数板和台盼蓝染色手动计数细胞，评估细胞活力。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 支气管内活检组织经酶消化后单细胞的流式细胞术分析
<ol>
	<li>用 200 µl FACS 缓冲液重悬细胞沉淀，调整细胞浓度至约 1 × 106 个细胞。</li>
	<li>根据制造商说明书加入细胞活性染料，以排除死细胞。</li>
	<li>加入 5 µl FcR 封闭试剂，在 4 °C 下孵育 5 分钟。</li>
	<li>加入针对 CD45（2 µl）、谱系标记（CD3、CD20、CD56、CD66abce 和 CD14；每种 2 µl）、CD16（0.5 µl）、HLA-DR（3 µl）、CD11c（5 µl）、CD123（5 µl）、CD1c（3 µl）和 CD103（2 µl）的细胞表面抗体，在 4 °C 下孵育 15 分钟。抗体的具体信息见方法部分，但需根据所使用的具体流式细胞仪进行抗体滴定和优化。在 400 × g 条件下用 PBS 洗涤 5 分钟，去除未结合的抗体。样本可新鲜上机检测，或在 1% 多聚甲醛中固定后保存待后续检测。</li>
	<li>通过流式细胞术检测鉴定肺组织活检样本中的人树突状细胞（DC）18（图 4）。 
	注意：使用流式细胞分析软件，通过 CD45 设门将免疫细胞与其他肺细胞区分开。活/死染料阳性的细胞可被排除以去除死细胞。在所有活的 CD45+ 细胞中，可通过一个包含抗 CD20、CD3、CD56、CD66abce、CD14 和 CD16 抗体的混合抗体组合在一个通道中排除谱系阳性细胞（B 细胞、T 细胞、NK 细胞、中性粒细胞和单核细胞）。随后，通过 HLA-DR+ 细胞可鉴定出所有人 DC。根据是否表达 CD11c，可将经典树突状细胞（MDC）与浆细胞样树突状细胞（PDC）区分开。MDC 可进一步分为 CD1c+ MDC 和 CD141+ MDC。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

本文介绍了如何利用支气管镜检查期间采集的支气管黏膜活检样本，通过免疫组织化学和流式细胞术对健康人体肺组织驻留型树突状细胞（DCs）进行详细的定位及表型特征分析。下文将详细讨论该实验方案中的关键步骤。
本实验方案的关键步骤
切片与免疫组织化学：不使用活检组织块时，必须将其保存在 -20 °C（步骤 2.5）。组织块若温度过高可能会变软，导致切片质量下降。此外，将组织块保存在 -20 °C 有助于保护抗原位点，从而在免疫组织化学染色中获得更佳的染色效果。
切片与免疫组织化学：在对GMA包埋的活检组织进行切片时，准备3-4个盛有氨水的容器以用于漂浮切片较为方便。当取走一张切片后，务必立即用一张新切片替换（步骤3.4），以确保该切片再次被处理时已在氨水中漂浮了适当的时间（约45-90秒），这有助于抗原暴露及后续的免疫组织化学染色。以这种方式切割2 µm厚的切片还可实现连续切片，意味着同一个细胞有可能被不同的细胞表面或细胞内标志物染色。切片过程中切勿触碰玻璃刀刃口，因其极易受损。若刀面有...

肺部持续与外部环境接触，极易暴露于无害颗粒和具有致病能力的微生物。因此，免疫系统必须对入侵的病原体产生强有力的免疫应答，但同样重要的是，需对不会引发疾病的吸入性抗原维持免疫耐受。为了实现有效的免疫监视，呼吸系统内分布着由多种免疫细胞构成的网络，其中包括树突状细胞（DCs）。DCs 是专业的抗原呈递细胞，具有激活初始T细胞的独特能力。在人体肺部，定居的DCs遇到抗原后，会对其进行加工处理，并将其转运至肺引流淋巴结，以呈递给T细胞并激活T细胞1,2,3。
在人类免疫系统中，树突状细胞（DCs）可分为多个亚群，其功能各不相同但存在重叠：包括CD1c+和CD141+髓系树突状细胞（MDCs）以及CD123+浆细胞样树突状细胞（PDCs）4,5。尽管目前关于人类DCs的大部分详细知识来源于血液研究，但现已明确人类肺脏中也存在稀有的DC亚群，具有刺激T细胞的能力6,7,8,9。然而，越来越多的数据表明，免疫细胞（包括DCs）在不同解剖部位中的频率、表型和功能均存在差异10。因此，为了理解免疫细胞在局部免疫与耐受中的作用，必须研究来自相关组织的免疫细胞。综上所述，尽管在人体中血液DCs更容易获取，但在研究肺部疾病时，仍有必要关注肺组织驻留的DCs。
早期研究人类肺组织驻留性树突状细胞（DCs）主要依赖于组织切片中通过免疫组织化学方法观察形态学特征及单一标志物（如 HLA-DR 和 CD11c）的表达11,12,13。相比之下，近期的研究通常采用流式细胞术分析不同的免疫细胞亚群。然而，由于难以找到能够唯一标识特定 DC 亚群的单一细胞表面标志物，仅使用四色流式细胞术的研究可能存在局限性，即有风险将表型标志物与 DCs 相似的其他细胞群体纳入分析。例如，CD11c 在所有髓系 DCs 以及绝大多数单核细胞上均有表达。另一方面，在采用更先进流式细胞术组合的研究中，通常使用患者手术切除的非癌变肺组织10,14,15,16，但尚不明确这些稀有细胞群体是否真正代表健康个体中存在的 DCs。总体而言，相关研究的开展在很大程度上受限于手术切除或完整的人肺组织来源极为稀缺这一事实。
为了克服其中一些局限性，本研究描述了如何对健康志愿者支气管镜检查获取的黏膜支气管内活检组织中的树突状细胞（DCs）进行空间分布的详细分析及表型鉴定。每个个体可采集多个小型活检样本，随后可将其包埋切片，用于免疫组织化学分析，或通过酶消化处理，用于高级流式细胞术分析。与因明显原因仅限于需胸外科手术患者的开胸手术相比，采用支气管镜获取的支气管内活检肺组织具有优势，使得研究可在健康志愿者中开展。此外，健康志愿者支气管镜检查所获取的组织在生理上属于正常组织，不同于肺部疾病患者肺部的非受累区域。然而，活检样本体积较小，即使合并多个活检样本，所获得的细胞数量仍然有限，从而限制了可开展的分析类型。
尽管本研究主要关注树突状细胞（DCs），但所述方法可直接扩展至其他存在于人体黏膜肺组织中的（免疫）细胞。此外，这些方案也可直接应用于因肺部疾病接受支气管镜检查以明确诊断的患者样本，例如慢性阻塞性肺疾病（COPD）、结节病或肺癌患者。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;强&gt;支气管镜检查&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>支气管镜 BF1T160</td><td>奥林巴斯</td><td>BF1T160</td><td></td></tr><tr><td>光源&amp;nbsp;</td><td>Olympus</td><td>Exera CV-160</td><td></td></tr><tr><td>带窗镊子</td><td>Olympus</td><td>FB21C</td><td>用于获取活检样本</td></tr><tr><td>咬合垫</td><td>Conmed</td><td>1429</td><td>20 mm × 27 mm</td></tr><tr><td>葡萄糖 25%&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>500 ml 静脉注射</td></tr><tr><td>格隆溴铵 0.2 mg/ml</td><td></td><td></td><td>静脉注射。防止黏液/唾液分泌</td></tr><tr><td>口服咪达唑仑混合液 1 mg/ml</td><td></td><td></td><td>可用于额外放松</td></tr><tr><td>利多卡因，40 mg/ml</td><td></td><td></td><td>口腔与咽喉给药 / 含漱法</td></tr><tr><td>利多卡因 100 mg/ml 喷雾</td><td></td><td></td><td>咽后壁给药</td></tr><tr><td>利多卡因 20 mg/ml 喷雾</td><td></td><td></td><td>通过支气管镜给药至气道</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;强&gt;GMA 处理与包埋&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>玻璃瓶</td><td></td><td></td><td>5 ml</td></tr><tr><td>丙酮</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32201-1L</td><td></td></tr><tr><td>4 型分子筛 &amp;#197;</td><td>Alfa Aesar</td><td>88120</td><td>直径3-4毫米的颗粒</td></tr><tr><td>苯甲基磺酰氟</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-7626</td><td>0.035 g/100 ml 丙酮</td></tr><tr><td>碘乙酰胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I-6125</td><td>0.37 g/100 ml 丙酮</td></tr><tr><td>聚乙烯平膜&amp;nbsp; TAAB 包埋胶囊</td><td>TAAB 实验室</td><td>C094</td><td>500个 8毫米直径 聚乙烯 平底胶囊</td></tr><tr><td>胶囊固定器</td><td>TAAB 实验室</td><td>C054</td><td>可容纳25个8毫米胶囊</td></tr><tr><td>JB-4 GMA 包埋试剂盒</td><td>Polysciences</td><td>00226</td><td>包含 JB-4 溶液 A（0026A-800）、JB-4 溶液 B（0026B-3.8）、过氧化苯甲酰（02618-12）</td></tr><tr><td>苯甲酸甲酯</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>27614-1L</td><td></td></tr><tr><td>含湿度指示剂的硅胶</td><td>Scharlau</td><td>GE0043</td><td>2.5-6 毫米&amp;nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;强&gt;GMA切片&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>载玻片</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>10143562CEF</td><td>切边，磨砂端</td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920-500mL</td><td>工作溶液按1:10稀释</td></tr><tr><td>用于超薄切片的载玻片条</td><td>Alkar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2287</td><td>洗涤液（0.1% Tween20）</td></tr><tr><td>LKB 7800B 制刀机</td><td>LKB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>胶囊分离器</td><td>TAAB 实验室</td><td>C065</td><td></td></tr><tr><td>碳钢单刃刀片</td><td>TAAB 实验室</td><td>B054</td><td></td></tr><tr><td>副</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>氨水，25%</td><td>VWR</td><td>1133.1000</td><td>2 ml 加入 1 L 中，1:500（0.05%）</td></tr><tr><td>切片机</td><td>Leica</td><td></td><td>Leica RM 2165</td></tr><tr><td>光源</td><td>Leica</td><td></td><td>Leica CLS 150 XE</td></tr><tr><td>带摆臂支架的显微镜</td><td>Leica</td><td></td><td>Leica MZ6</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;强&gt;GMA免疫组织化学&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>金刚石笔</td><td>Histolab</td><td>5218</td><td></td></tr><tr><td>30%过氧化氢溶液</td><td>AnalaR Normapur</td><td>23619.264</td><td></td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8032</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>罗氏</td><td>10708976001</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>VWR 化学品</td><td>27810.295</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Millipore</td><td>82-045-2</td><td>诊断级前白蛋白 BSA</td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5546</td><td></td></tr><tr><td>抗人CD45抗体</td><td>BioLegend</td><td>304002</td><td>小鼠单克隆抗体，克隆号 HI30，同种型 IgG1k。工作浓度为 500 ng/ml</td></tr><tr><td>抗人CD1a抗体</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA80GA</td><td>小鼠单克隆抗体，克隆号 NA1/34-HLK，同种型 IgG2a。工作浓度为 10 &amp;micro;g/ml</td></tr><tr><td>小鼠单克隆IgG1同型对照</td><td>Abcam</td><td>ab27479</td><td></td></tr><tr><td>小鼠单克隆IgG2a同型对照</td><td>Dako</td><td>X094301-2</td><td></td></tr><tr><td>Vectastain ABC Elite 标准试剂盒</td><td>Vector Labs</td><td>PK-6100</td><td></td></tr><tr><td>AEC（3-氨基-9-乙基咔唑）过氧化物酶底物试剂盒</td><td>Vector Labs</td><td>SK-4200</td><td></td></tr><tr><td>迈耶苏木精</td><td>HistoLab</td><td>01820</td><td></td></tr><tr><td>永久性水溶性封片剂</td><td>AbD Serotec</td><td>BUF058C</td><td></td></tr><tr><td>干燥箱</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DPX 永久封片液&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>360292F</td><td></td></tr><tr><td>光学显微镜</td><td>Leica</td><td></td><td>Leica DMLB</td></tr><tr><td>显微镜相机</td><td>Leica</td><td></td><td>Leica DFC 320</td></tr><tr><td>分析软件</td><td>Leica</td><td></td><td>Leica Qwin V3</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;强&gt;酶消化&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Hank's 平衡盐溶液（HBSS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>55021C</td><td></td></tr><tr><td>二硫苏糖醇（DTT）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DTT-RO</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6885</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10104159001&amp;nbsp;罗氏</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>平台摇床</td><td>授款工具</td><td>PMR-30</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 离心管</td><td>Falcon</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>40 &amp;micro;m细胞滤筛</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;强&gt;流式细胞术&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Aqua 可固定死细胞染色试剂盒</td><td>Life Technologies</td><td>L34957</td><td></td></tr><tr><td>CD45</td><td>BD</td><td>555485</td><td></td></tr><tr><td>CD3</td><td>BD</td><td>557757</td><td></td></tr><tr><td>CD20</td><td>BD</td><td>335829</td><td></td></tr><tr><td>CD56</td><td>Biolegend</td><td>318332</td><td></td></tr><tr><td>CD66abce</td><td>Miltenyi</td><td>130-101-132</td><td></td></tr><tr><td>HLA-DR</td><td>BD</td><td>555813</td><td></td></tr><tr><td>CD14</td><td>BD</td><td>557831</td><td></td></tr><tr><td>CD16</td><td>Biolegend</td><td>302026</td><td></td></tr><tr><td>CD11c</td><td>BD</td><td>560369</td><td></td></tr><tr><td>CD1c</td><td>Miltenyi</td><td>130-098-009</td><td></td></tr><tr><td>CD141</td><td>Miltenyi</td><td>130-090-514</td><td></td></tr><tr><td>CD103</td><td>Biolegend</td><td>350212</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>LSR II 流式细胞仪</td><td>BD</td><td></td><td>流式细胞仪</td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>FlowJo</td><td></td><td>用于分析的软件</td></tr></tbody></table>

人类肺树突状细胞：利用免疫组织化学和流式细胞术在支气管内活检样本中进行空间分布与表型鉴定

Human Lung Dendritic Cells: Spatial Distribution and Phenotypic Identification in Endobronchial Biopsies Using Immunohistochemistry and Flow Cytometry

肺部持续暴露于外部环境中，该环境除了含有无害颗粒外，还包含病原体、过敏原和毒素。为了维持免疫耐受或在必要时诱导免疫应答，免疫系统必须恰当地处理吸入的抗原。肺树突状细胞（DCs）在维持精细平衡方面至关重要，即在需要时启动免疫反应，同时避免因过度炎症反应对肺组织造成附带损伤。尽管目前对人血液中免疫细胞（如DCs）的表型和功能已有较为深入的理解，但对于这些细胞在肺等较难获取组织中的认知仍十分有限，原因是人体肺组织样本的研究，尤其是来自健康个体的样本，极为稀少。本研究提出一种策略，用于对接受支气管镜检查并获取支气管内活检样本的健康人肺组织驻留DCs进行详细的时空分布和表型特征分析。每个个体可采集多个微小活检样本，随后可用于超薄切片包埋或酶消化，以进行高阶流式细胞术分析。所述方案已优化，旨在从小份组织样本中获取最大信息量，而在稳态条件下，这些样本中DCs的频率本就较低。尽管本研究聚焦于DCs，但所描述的方法可直接拓展至肺黏膜组织中其他感兴趣的（免疫）细胞。此外，这些方案也可直接应用于患有肺部疾病患者的样本，例如慢性阻塞性肺疾病（COPD）、结节病或肺癌患者，其诊断过程中通常包含支气管镜检查。

目前针对人类呼吸道组织驻留免疫细胞（包括树突状细胞）的研究较为有限，主要原因是手术切除或完整的肺组织样本难以获取。本文介绍了一种通过健康志愿者的支气管镜下支气管活检（EBB）获取肺组织的微创方法，并建立了利用免疫组织化学或流式细胞术研究组织中免疫细胞的实验方案。
健康志愿者接受了支气管镜检查，方法如前所述19,20。使用带孔活检钳（图 1A）从每位受试者的主隆突及主支气管分叉处采集6至9块大小为1-2 mm3的支气管黏膜活检组织。其中两块活检组织被包埋于GMA中，随后用于免疫组织化学分析，以获得空间分布信息。其余活检组织经酶消化处理，制备成单细胞悬液，并通过多色流式细胞术进行分析，从而实现对稀有细胞亚群的精细表征（图 1B）。
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肺组织驻留的免疫细胞，包括人类的树突状细胞（DCs），在防御吸入性病原体和过敏原方面至关重要。然而，由于人类肺组织来源稀少，相关研究受到限制。本研究提供了处理人类黏膜支气管内活检样本的实验方案，可用于通过免疫组织化学和流式细胞术研究肺部树突状细胞。

肺部持续暴露于外部环境中，该环境除了含有无害颗粒外，还包含病原体、过敏原和毒素。在……

该技术的主要优势在于，可以从支气管镜检查期间获取的小块组织中获得大量信息。该方法有助于回答黏膜免疫学中的关键问题，例如在慢性阻塞性肺疾病（COPD）、结节病或肺癌等需要通过支气管镜检查建立诊断的疾病中。对该操作过程的可视化演示，将帮助初次接触该方法的研究人员判断酶消化何时完成。与Faezzah Baharom一同进行本操作演示的，还有来自我们合作者实验室（Umeå大学）的博士后Greg Rankin。

human-lung-dendritic-cells-spatial-distribution-phenotypic

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

人肺树突状细胞：空间分布与表型鉴定支气管活检采用免疫组化和流式细胞仪

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我们描述了一种在卵清蛋白诱导的过敏性气道炎症条件下，监测肺树突状细胞对卵清蛋白刺激的成熟与迁移的策略。该策略可经修改后用于评估感染条件下肺树突状细胞的迁移情况。...

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我们介绍一种制备精密切割肺组织片（PCLS）并对其进行免疫染色以可视化肺内多种免疫细胞类型定位的方法。本方案可进一步扩展，用于在多种条件下观察不同类型细胞的位置与功能。...

活体肺树突状细胞成像的精密小鼠肺切片制备

我们描述了一种处理接受抗逆转录病毒治疗的慢性HIV感染者支气管肺泡灌洗液及其配对的外周血的方法，以评估肺部HIV储存库。这些方法可获得高纯度的CD4 T细胞和肺泡巨噬细胞，随后可用于通过超敏聚合酶链式反应进行免疫表型分析以及HIV...

支气管肺泡灌洗液及配对血液样本中肺泡巨噬细胞和CD4+ T细胞免疫表型分析与HIV储存库评估的处理方法

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人肺上皮前体细胞的分离与富集用于类器官培养

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小鼠肺组织中固有和适应性免疫细胞鉴定的流式细胞术分析

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人类肺树突状细胞：利用免疫组织化学和流式细胞术在支气管内活检样本中进行空间分布与表型鉴定

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