人脐带和胎儿胎盘间充质基质细胞的分离与鉴定
2017年4月3日
本文介绍一种从人脐带（UC）和胎儿胎盘样本中分离出脐带内层（CL）、华通胶（WJ）、脐带-胎盘连接处（CPJ）以及胎儿胎盘（FP）的实验方案，用于通过组织块培养法分离和鉴定间充质基质细胞（MSCs）。
本方案的总体目标是从四种不同的围产期组织来源中分离间充质基质细胞，即脐带内膜、华通胶、脐带-胎盘连接处以及胎儿胎盘。该方法可通过无创方式获取具有特殊品质的间充质干细胞，从而推动干细胞生物学和替代医学领域的发展。该技术的主要优势在于，能够从不同的围产期组织来源高效地获得大量高质量且均一的细胞群体。
通过该技术获得的多能脐带间充质基质细胞可用于治疗多种疾病和障碍，因为它们比从成体组织中分离的间充质干细胞更为原始。该方法有助于深入了解来自脐带和胎盘不同节段及特定微环境的间充质基质细胞的特性。首先，在生物安全柜中将样本置于盛有冰的150毫米培养皿中，并使用针头和注射器用预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）反复冲洗组织数次。
当所有血凝块清除后，仔细检查样本以识别不同的解剖区域。然后用镊子夹住脐带的胎儿端，用剪刀在脐带-胎盘连接处的顶端小心地做一个切口。在连接处下方再做第二个切口，以将脐带-胎盘连接部分从胎盘上分离。
将分离的组织分别放入不同的培养皿中。接着，沿纵轴切开脐带，充分暴露血管及周围的华通胶，注意不要损伤上皮层。用手术刀刮除血管及羊膜下上皮层间的华通胶。
随后，去除血管，将血管下方及周围残留的血管周凝胶转移至华通氏胶培养皿中，并将剩余的脐带外层组织置于另一个独立的培养皿中。当所有组织均完成分离后，向每个培养皿中加入3–5毫升胰蛋白酶以替换PBS溶液，并用剪刀将每份组织样本剪切成1–2毫米大小的组织块，在37°C、5%二氧化碳条件下孵育30分钟。使用相差显微镜观察组织的部分消化情况，通过观察细胞从组织中释放的现象来判断消化进程。
部分消化结束后，加入等体积的培养基中和胰蛋白酶，并将样品转移至各自的50毫升锥形管中。让组织块静置3分钟沉降。然后小心吸除上清液，将每份样品中15至20个部分消化的组织块分别接种到75平方厘米的组织培养瓶中。
接下来，加入9毫升培养基，在37摄氏度下培养2至3天。3天后更换培养基，并通过相差显微镜检查组织块是否有细胞迁出。当细胞生长达到70%汇合度时，每瓶加入1至2毫升胰蛋白酶溶液消化细胞，轻轻旋转培养瓶使酶液均匀覆盖，于37摄氏度孵育3分钟。
然后用一到两毫升培养基中和反应。通过离心收集细胞，并将沉淀重悬于培养基中，以每平方厘米1×10⁴个细胞的接种密度进行传代培养。脐带内层和华通胶来源的细胞培养物的集落形成效率分别为59和80个集落。
然而，脐带-胎盘连接处细胞的集落形成效率值与骨髓间充质干细胞相当，表明来源于脐带-胎盘连接处的细胞具有更高的增殖和自我更新能力。对从这些围产期组织中分离得到的单细胞悬液进行流式细胞术分析显示，来自全部四种组织来源的细胞在特定间充质干细胞标志物阳性细胞比例方面，与标准骨髓来源间充质干细胞表达的水平相似。然而，中位荧光强度比值表明，华通胶及脐带-胎盘连接处来源的细胞与胎盘脐带内层来源的细胞相比，非常相似或更高。
有趣的是，尽管不同围产期来源的细胞在集落形成效率上存在差异，但通过定量RT-PCR分析发现，除脐带-胎盘交界处来源的间充质基质细胞外，其他来源的细胞均表达相似水平的多能性标志物，而脐带-胎盘交界处来源的间充质基质细胞对所有检测的多能性标志物均表现出最高水平的表达。此外，从所有围产期来源分离的间充质基质细胞均能有效分化为脂肪细胞、软骨细胞和成骨细胞，并表现出三系分化能力，尽管其分化潜能因间充质基质细胞来源不同而有所差异。
熟练掌握后，若操作高效，该技术可在两到三小时内完成。在进行此操作时，重要的是要练习侧向操作技术，并避免不同组织来源之间的交叉污染。该技术为研究人员探索围产期组织中干细胞微环境的特性奠定了基础。
概述
本方案概述了通过外植体培养技术分离人脐带和胎儿胎盘以获取间充质基质细胞（MSCs）的解剖步骤。该方法可用于鉴定不同围产期组织来源的MSCs，从而推动干细胞生物学领域的进展。
关键研究组成部分
科学领域
- 干细胞生物学
- 再生医学
- 细胞培养技术
背景
- 间充质基质细胞（MSCs）因其多向分化潜能而具有治疗潜力。
- 围产期组织是原始间充质基质细胞的丰富来源。
- 本方案旨在提高从脐带和胎盘中获取高质量间充质基质细胞的产量。
- 了解来自不同组织来源的间充质基质细胞的特性，有助于指导其临床应用。
研究目的
- 从脐带内层、华通胶、脐带-胎盘连接处及胎儿胎盘中分离间充质干细胞（MSCs）。
- 评估来源于这些组织的间充质干细胞的质量与特性。
- 提供一种无创的方法以获取用于研究和治疗用途的间充质干细胞。
使用的方法
- 将脐带和胎盘解剖为不同的解剖区域。
- 使用胰蛋白酶对组织样本进行部分消化。
- 在特定培养基条件下培养解剖后的组织。
- 利用显微镜和流式细胞术评估细胞生长并进行表征。
主要结果
- 在华通胶和脐带-胎盘连接处细胞中观察到较高的集落形成效率。
- 所有间充质干细胞均表达相似的多能性标志物，但表达水平存在差异。
- 间充质干细胞表现出向多个谱系分化的能力。
- 该技术可在两至三小时内高效完成。
结论
- 本方案提供了一种从围产期组织中分离高质量间充质干细胞（MSCs）的可靠方法。
- 了解不同来源间充质干细胞的特性可增强其治疗应用潜力。
- 鼓励进一步探索围产期组织中的干细胞微环境。
常见问题
行业重要性概述
本方案能够从不同的围产期组织来源中分离间充质基质细胞（MSCs），为骨髓来源的MSCs提供一种无创且符合伦理的替代方法。通过比较脐带-胎盘连接处（CPJ）、华通胶（WJ）、脐带外膜（CL）和胎儿胎盘（FP）等解剖区域，该方法可支持再生医学研发流程中的靶点验证与作用机制风险评估。CPJ来源的MSCs表现出更高的集落形成效率和多能性标志物表达，可为细胞治疗应用提供预测性依据，有助于先导细胞的筛选与产品管线的优化决策。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过分离具有不同增殖能力和自我更新能力的围产期特定微环境中的间充质干细胞（MSCs），可实现对治疗假设的验证。
- 操作价值：通过在脂肪生成、软骨生成和成骨生成谱系中进行多向分化潜能的功能验证，支持生物学风险的降低。
- 科学价值：通过鉴定CPJ为一种具有更强集落形成效率和多能性标志物表达的高效间充质干细胞来源，增强靶点可信度。
筛选与检测方法开发
- 操作价值：通过获得具有明确表面标志物谱（CD29、CD44、CD73、CD90、CD105）的均一且贴壁的间充质干细胞（MSC）群体，为后续实验流程提供经过验证的生物系统。
- 科学价值：通过稳定的组织块培养技术以及集落形成效率和流式细胞术指标等定量输出结果，提升检测方法的标准化程度和可重复性。
- 操作价值：突出该方法具备筛选就绪性和可扩展性，整个方案可在两至三小时内完成，适用于临床前筛选级联中对化合物进行可靠评估。
转化与临床前研究
- 科学价值：通过展示三系分化能力这一临床前验证的关键功能性读数，阐述了疾病相关性及转化生物标志物的一致性。
- 操作价值：通过提供具有贴壁生长、成纤维细胞样形态以及与骨髓来源间充质干细胞相似的表面标志物表达谱的MSCs，描述了从发现到临床前验证的连续性。
- 科学价值：通过显示CPJ-MSCs比其他来源的MSCs具有更高的分化效率，突出其在预测性降风险方面的价值，支持基于风险评估的推进决策。
流程与工作流整合
该方法可融入从早期发现到先导物识别及临床前研究的整个发现流程，通过解剖学定位明确的MSC分离，支持假设验证、信号通路解析以及生物学风险降低。
- 发现生物学：阐述该方法如何通过比较脐带外层、华通胶、脐带-胎盘连接处及胎儿胎盘中的间充质干细胞（MSC）特性，支持假设验证与通路阐明。
- 筛选：描述该方法的检测就绪性、可重复性以及定量输出结果，例如集落形成效率（CL为59，WJ为80，CPJ与骨髓BM相近）和基于流式细胞术的标志物表达分析。
- 分析：突出诸如集落形成效率、荧光强度比值以及多能性标志物的定量逆转录PCR等测量指标，帮助研究团队比较不同条件并评估其预测价值。
- 转化研究：通过展示间充质干细胞向脂肪细胞、软骨细胞和成骨细胞谱系的分化能力，将该方法与临床前研究的连续性相联系，支持生物标志物的一致性及功能验证。
- 企业级复用：将该方法定位为可重复使用的能力建设，而非一次性技术，从而实现围产期组织来源间的标准化，为再生医学项目提供稳定一致的间充质干细胞供应。
运营与企业影响
- 科学价值：通过解剖学定位明确的间充质干细胞（MSC）分离与功能表征，提高预测可信度、靶点验证能力，并减少机制上的不确定性。
- 操作价值：通过组织块培养法、明确定义的消化参数以及一致的接种密度（1×10⁴ 细胞/cm²），实现标准化、可重复性和可扩展性。
- 战略价值：在发现早期识别出如乳齿牙髓（CPJ）等高活性的MSC来源，从而做出更优的立项/终止决策，提升资本使用效率，并降低后期生物学风险。
- 项目组合影响：基于不同围产期MSC来源在增殖能力、自我更新能力和分化效率上的差异，进行风险校正后的优先级排序和推进决策。
实施注意事项
- 需要具备组织解剖、无菌细胞培养和用于标志物分析的流式细胞术方面的专业科学知识。
- 所需的仪器和分析基础设施包括相差显微镜、离心机、培养箱（37°C，5% CO₂）以及用于CD标志物和荧光强度评估的流式细胞仪。
- 跨团队标准化要求包括统一的组织解剖方案、胰蛋白酶中和步骤和接种密度，以确保不同实验室之间的可重复性。
- 在不同模型系统间的适应性考虑包括根据组织来源调整组织块大小和消化时间，因为不同来源的组织块出块时间存在差异（CPJ为3–4天，CL/WJ为7–10天，FP为11–14天）。
- 文献支持的实际局限性包括在解剖过程中需避免不同组织来源之间的交叉污染，以及不同解剖区域在集落形成效率和出块时间上的变异性。
生物制药常见问题
Chapters in this video
0:05
Title
1:09
Human Umbilical Cord (UC), Cord-Placenta Junction (CPJ), and Fetal Placenta (FP) Processing and Cell Isolation
6:21
Conclusion
4:29
Results: Colony-Forming Efficiency and Mesenchmyal Stromal Cell (MSC) Marker Expression of Perinatal Tissue-Isolated Cells
