Name: 背根神经节的啮齿动物的脊髓和隔离的液压挤压 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: 学习液压挤压法快速分离啮齿动物脊髓并精准识别背根神经节。该方法比传统技术更快，能显著减少组织损伤，适用于神经生物学研究的多种下游分析。

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我们感谢奥胡斯大学的 David Kiel 提供拍摄与剪辑工作。显微镜视频序列的处理使用了 VirtualDub 软件。感谢丹麦转化神经科学研究中心（DANDRITE），Nordic EMBL 合作伙伴关系，提供设备使用权限；同时感谢奥胡斯大学研究基金会、欧盟第七框架计划项目 PAINCAGE、丹麦独立研究理事会（DFF）以及伦贝克基金会提供的经费支持。

所有动物实验均严格遵守丹麦及欧洲法规。许可编号：2012-15-2934。
1. 脊髓液压挤出用注射器的准备
<ol>
	<li>对于成年大鼠，使用 10 mL 注射器；对于成年小鼠，使用 5 mL 注射器；对于幼鼠，使用 2.5 mL 注射器。</li>
	<li>通过修剪通用型非滤芯移液器吸头（适用于 2–200 µL 移液器）的大端，将其调整至能牢固地安装在注射器上。将调整后的移液器吸头安装到注射器上。对于幼鼠，应使用 23 G 或类似规格的针头代替调整后的移液器吸头。</li>
	<li>吸取冰上预冷的无菌 PBS，并将注射器置于冰上备用。</li>
</ol>
2. 安乐死
<ol>
	<li>不要进行颈椎脱位，因为这会扰乱脊椎，导致无法进行脊髓挤出。</li>
	<li>对于成年大鼠/小鼠，使用如 CO2 或异氟烷等气体实施安乐死。这些物质有害，应在通风橱内操作，并按照机构指南处理。（注意：CO2：H280，P410，P403；异氟烷：H361d，P260，P281，P280）
	<ol>
		<li>为确认啮齿动物已死亡，可用镊子夹捏其足掌以检查反射是否消失。使用大剪刀将其头部剪下。对于幼鼠，采用断头法实施安乐死。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 脊柱的分离
<ol>
	<li>在毛皮上洒水以控制毛发。</li>
	<li>使用剪刀沿脊柱向远端方向剪开毛皮，并沿脊柱两侧剪开至超过骨盆骨处，分离脊柱。用剪刀在骨盆骨远端处剪断脊髓。 
	注意：在整个方案中，头尾轴均称为近端-远端轴。
	<ol>
		<li>使用剪刀修剪脊柱，避免最前端和最远端区域，因为这些区域可能导致脊柱呈明显的S形，从而影响脊髓的顺利挤出。确保脊髓在两端均可见。如果脊髓不可见，需用剪刀继续修剪脊柱，直至脊髓暴露可见。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 脊髓的液压挤出
<ol>
	<li>将盛有无菌 PBS 的培养皿（直径 100 mm）置于冰上。</li>
	<li>用食指按压脊柱弯曲部位（最靠近近端的一端），尽可能将脊柱拉直。
	<ol>
		<li>对于幼鼠，避免弯曲脊柱，否则会导致椎骨损伤，使脊髓无法完整挤出。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将移液器吸头（幼鼠使用 23 G 针头，成年小鼠可选用 18 G 针头）插入脊柱最远端。若插入正确，吸头将在脊髓腔内保持稳定。</li>
	<li>确保脊柱尽可能拉直，施加稳定压力，将脊髓挤入置于冰上的培养皿中。在进一步处理前，应将脊髓保持在 PBS 中，确保其在冰上始终湿润。</li>
</ol>
<img alt="脊髓腰膨大比较图：成年大鼠、成年小鼠、幼年小鼠。" src="/files/ftp_upload/55226/55226fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：代表性脊髓标本。 液压挤出的脊髓标本。从左至右：成年大鼠、成年小鼠、幼年小鼠。腰膨大部分由方框标出。<a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55226/55226fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
5. 背根神经节（DRGs）的鉴定
<ol>
	<li>使用剪刀将脊柱纵向均分为两部分，并将分开的脊柱置于显微镜下。</li>
	<li>通过定位脊柱上最远端肋骨的附着位置来确定第13胸椎（T13）节段，注意不要将肋骨与附近的肋间神经混淆。最远端的肋骨附着于T13椎骨节段的近端部分，而T13背根神经节（DRG）位于T13椎骨远端、L1椎骨近端的位置。</li>
	<li>沿远端方向识别相邻的背根神经节（DRG）。在成年大鼠中，相邻的DRG呈白色，背根和腹根清晰可见；在成年小鼠中，相邻的DRG也呈白色，背根和腹根同样清晰可见；在幼鼠中，相邻的DRG则呈现为透明的球状结构。</li>
</ol>
<img alt="小鼠幼崽和成年大鼠背根神经节解剖；标注图示；神经科学、发育比较。" src="/files/ftp_upload/55226/55226fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2：脊髓挤出后在脊柱中识别背根神经节。 脊柱已被切开，以便观察由箭头所示的背根神经节。图中以成年大鼠和小鼠幼崽为例。 <a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55226/55226fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
6. 背根神经节的分离
<ol>
	<li>根据待分离的特定DRG数量准备相应数量的培养皿（直径30 mm）， 例如 L3、L4、L5。用预冷的无菌PBS填充培养皿，并置于冰上。</li>
	<li>使用显微剪刀，尽可能靠近背根神经节（DRGs）切断背根和腹根，以释放神经根，同时避免损伤背根神经节（DRGs）。</li>
	<li>用闭合镊子的尖端轻轻挖出背根神经节，并将其转移至相应编号的培养皿中。</li>
</ol>
<img alt="成年大鼠、成年小鼠、幼鼠的分离背根神经节；神经生物学实验比较。" src="/files/ftp_upload/55226/55226fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：典型的分离背根神经节。 从左到右：成年大鼠、成年小鼠、幼鼠。 <a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55226/55226fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
7. 组织样本的后续分析处理
<ol>
	<li>蛋白质印迹法
	<ol>
		<li>分离目标组织区域， 例如 脊髓腰膨大。如有需要，将脊髓分为同侧和对侧，再进一步分为背角和腹角。</li>
		<li>将组织置于裂解缓冲液中，例如 TNE 裂解缓冲液（10 mM Tris-base, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP40，溶于双蒸水）2O），并加入适量的酶抑制剂，置于冰上。</li>
		<li>在冰上使用机械研磨杵匀浆组织，持续约 30 s。</li>
		<li>16,000 × g 条件下离心 15 分钟 4 °C 并根据标准方案使用上清液进行后续处理5,6 或在 -20 °C 直至进一步使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>RNA分析
	<ol>
		<li>分离目标组织。</li>
		<li>立即将组织放入RNA稳定液中，以稳定RNA用于储存。</li>
		<li>根据标准方案提取RNA7.</li>
		<li>将RNA反转录为cDNA，并按照标准实验流程进行qPCR7.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>免疫组织化学
	<ol>
		<li>适用于新鲜冷冻组织（可用于脊髓）：
		<ol>
			<li>将干冰块粉碎成相当于两汤匙粉末的量以制备干冰粉末。用布包裹干冰块，并使用锤子将其粉碎。将铝箔（约5 cm × 5 cm）放置在一层干冰块上，再用干冰粉末覆盖铝箔。</li>
			<li>使用镊子将选定用于进一步分析的脊髓区域置于干冰粉上，使其快速冷冻，然后将脊髓转移至冻存管中。全程保持在干冰上，或储存于 -80 °C 直至进一步使用。</li>
			<li>将脊髓转移至冷冻切片机（-20 °C如有需要，可在冷冻切片机内修剪脊髓。将脊髓置于冷冻切片机内的包埋介质中，以将其固定于标本盘上。</li>
			<li>按所需厚度切取脊髓组织， 例如 5 µm，并收集到玻璃板上。在采集组织前，立即用手指加热玻璃板，以促进组织更好地附着。将剩余的组织保存在冻存管中，置于 -80 °C 直至进一步使用。</li>
			<li>将玻璃板上的切片置于冷冻切片机内，直至准备进行后固定。</li>
			<li>将切片浸入4% PFA中，室温下后固定10分钟。</li>
			<li>根据标准方案进行染色8.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>用于冷冻切片的固定组织（适用于脊髓和背根神经节）
		<ol>
			<li>用4%多聚甲醛固定脊髓和背根神经节（脊髓固定2小时，小鼠背根神经节固定1.5小时，大鼠背根神经节固定4小时）于 4 °C （将脊髓置于水平位置，以防止其固定成弯曲状态）。</li>
			<li>将组织转移至25% w/v蔗糖溶液中，4℃过夜 4 °C组织可在添加少量10%叠氮化钠以防止微生物污染的25% w/v蔗糖溶液中保存于 4 °C 直至进一步使用。如有需要，在硅胶板或类似材质上修剪脊髓，仅保留腰膨大部分。</li>
			<li>用纸巾的尖端吸去组织上多余的蔗糖溶液。</li>
			<li>将包埋剂填充至冷冻模具的一半高度。使用闭合的镊子等工具将气泡推至冷冻模具的边缘。</li>
			<li>使用镊子将组织置于包埋材料上，并确保组织方向符合预期要求。</li>
			<li>用包埋介质完全填满冷冻模具，并将气泡尽可能推离组织远一些（例如 使用闭合的镊子。</li>
			<li>将2-甲基丁烷加入培养皿（直径100 mm）。该物质有害，操作时须在通风橱中进行，并根据机构规定处理（注意：H224，H304，H336，H411，P210，P280，P273，P301，P331，P304/P340，P309/P310）。</li>
			<li>将培养皿置于干冰层上，并向培养皿中加入两块干冰。将冷冻模具放入培养皿中，使包埋介质完全冻结。</li>
			<li>始终将包埋的组织置于干冰上或 -80 °C 用Parafilm封好，直至进一步处理。</li>
			<li>在冷冻切片机中切取组织（-20 °C) 至所需厚度， 例如 5 µm.</li>
			<li>根据标准方案进行染色8.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>用于石蜡包埋的固定组织（适用于脊髓和背根神经节）
		<ol>
			<li>用4%多聚甲醛固定脊髓和背根神经节（脊髓固定2小时，小鼠背根神经节固定1.5小时，大鼠背根神经节固定4小时） 4 °C （将脊髓置于水平位置，以防止其固定成弯曲状态）。</li>
			<li>将组织转移至25% w/v蔗糖溶液中，4℃过夜 4 °C组织可在含少量10%叠氮化钠以防止微生物污染的25% w/v蔗糖溶液中保存于 4 °C 直至进一步使用。</li>
			<li>分离目标组织区域， 例如 脊髓腰膨大</li>
			<li>将包埋盒填充至一半高度的石蜡。</li>
			<li>将包埋模具短暂放置于包埋机的冷却区域进行降温，使石蜡略微硬化，以便更好地调整组织位置。</li>
			<li>将组织按所需方向放入包埋模具中，用石蜡填充模具并立即冷却。</li>
			<li>将含有石蜡的包埋模具置于 4 °C 过夜以使其完全硬化，然后从包埋模具中取出含有组织的石蜡块。</li>
			<li>在切片机上按所需厚度切片， 例如 5 µm.</li>
			<li>根据标准方案进行染色8.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+dissociated+sensory+neuron+cultures+and+considerations+for+their+use+in+studying+neuronal+function+and+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity.</a> Nat Protoc. 2 (1), 152-160 (2007).</li>
<li>Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple%2C+step-by-step+dissection+protocol+for+the+rapid+isolation+of+mouse+dorsal+root+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res+Notes%22%5BJournal%5D)">A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia.</a> BMC Res Notes. 9, 82(2016).</li>
<li>Kennedy, H. S., Jones, C. 3rd, Caplazi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+standard+laminectomy+with+an+optimized+ejection+method+for+the+removal+of+spinal+cords+from+rats+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histotechnol%22%5BJournal%5D)">Comparison of standard laminectomy with an optimized ejection method for the removal of spinal cords from rats and mice.</a> J Histotechnol. 36 (3), 86-91 (2013).</li>
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 <a target="_blank" href="http://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot ">http://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot </a> (2016).</li>
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<li>Ogrean, C., Jackson, B., Covino, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+real-time+PCR+using+the+thermo+scientific+Solaris+qPCR+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Quantitative real-time PCR using the thermo scientific Solaris qPCR assay.</a> J Vis Exp. (40), (2010).</li>
<li>Crosby, K., et al. Immunohistochemistry Protocol for Parraffin-embedded Tissue Sections - ADVERTISEMENT. , JoVE. Cambridge, MA. 
 <a target="_blank" href="https://www.jove.com/video/5064/immunohistochemistry-protocol-for-paraffin-embedded-tissue-sections">https://www.jove.com/video/5064/immunohistochemistry-protocol-for-paraffin-embedded-tissue-sections</a> (2014).</li>
<li>Watson, C., Paxinos, G., Puelles, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWatson%2C+C+%22The+Mouse+Nervous+System%22">The Mouse Nervous System</a>. , 1st edition, Academic Press, Elsevier. 424-426 (2012).</li>
<li>Rigaud, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species+and+strain+differences+in+rodent+sciatic+nerve+anatomy%3A+implications+for+studies+of+neuropathic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Species and strain differences in rodent sciatic nerve anatomy: implications for studies of neuropathic pain.</a> Pain. 136 (1-2), 188-201 (2008).</li>
<li>Green, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+non-genetic+factors+which+influence+the+type+of+the+skeleton+in+an+inbred+strain+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic and non-genetic factors which influence the type of the skeleton in an inbred strain of mice.</a> Genetics. 26 (2), 192-222 (1941).</li>
<li>Meyer, A., Gallarda, B. W., Pfaff, S., Alaynick, W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20084054">Spinal cord electrophysiology.</a> J Vis Exp. (35), (2010).</li>
<li>Ciglieri, E., Ferrini, F., Boggio, E., Salio, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+for+in+vitro+morphofunctional+analysis+of+mouse+dorsal+root+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Anat%22%5BJournal%5D)">An improved method for in vitro morphofunctional analysis of mouse dorsal root ganglia.</a> Ann Anat. , 62-67 (2016).</li>
<li>Peeraer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+evaluation+of+rat+dorsal+root+ganglion+neurons+as+an+in+vitro+model+for+diabetic+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pain+Res%22%5BJournal%5D)">Pharmacological evaluation of rat dorsal root ganglion neurons as an in vitro model for diabetic neuropathy.</a> J Pain Res. 4, 55-65 (2011).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

如果脊柱受到干扰， 例如 通过颈椎脱位处死时，脊髓在挤出过程中可能会断裂。如果脊髓无法挤出，可将脊柱两端稍作修剪后再次尝试挤出。若后续分析需要完整的脊髓， 即 包括颈膨大和腰膨大，脊柱仅需轻微修剪。若仅需腰膨大进行后续分析，应根据本方案修剪脊髓。使用指尖将脊柱伸直，以利于脊髓的挤出。
该方案适用于所有年龄段的啮齿类动物，本文以成年小鼠（8周龄）、幼鼠（5日龄）和成年大鼠（10周龄）为例进行说明。根据动物种类和品系的不同，胸段和腰段脊髓的节段数量可能有所差异。9,10,11根据待分析的蛋白质，可在处死前对成年啮齿类动物灌注含酶抑制剂的溶液。若进行单侧神经损伤实验，可在脊髓组织取出后立即使用超细镊子将其分为同侧与对侧。此外，每侧还可进一步分为背侧和腹侧。随后可对组织进行后续分析处理。 例如 蛋白质印迹法
在脊髓挤出前应避免使用PFA进行经心脏灌注固定，因为这会使脊髓失去柔韧性，从而阻碍脊髓的液压挤出。液压脊髓挤出会导致背根被撕脱。对于需要保留附着背根的实验，建议采用椎板切除术。此外，液压脊髓挤出会丢失脊髓脑膜，而标准的椎板切除术可避免这一问题3。
可以使用充氧的人工脑脊液（ACSF）代替冰冻的磷酸盐缓冲液（PBS）进行脊髓液压挤出和背根神经节（DRG）的分离。使用ACSF可使分离的组织处于更接近生理状态的环境中，这对于后续进行电生理记录尤为重要12,13。对于建立原代DRG培养，也可选用含有1 g/L葡萄糖的PBS作为替代方案14。
与传统的椎板切除法分离脊髓相比，液压挤出脊髓是一种显著更快的方法，可减少组织操作时间，从而降低蛋白质损伤的风险。在通过椎板切除法分离脊髓前，用固定剂灌注可能减少解剖过程中以及最终将脊髓从脊柱中取出时的组织损伤风险。然而，组织固定会使其无法适用于如蛋白质印迹（Western blotting）等分析。液压挤出法可获得结构完整无损的组织3，适用于更广泛的分析。
背根神经节的稳定鉴定可能存在困难，但对组织分析至关重要。 例如 坐骨神经损伤后。通过根据背根神经节（DRGs）相对于肋骨的位置进行编号，可实现DRGs的准确定位。通过实施第7步实验方案中所示的组织处理方法的多种优化方案，可进一步改善脊髓组织及DRGs的染色效果。

该方法的总体目标是分离脊髓，并识别和分离背根神经节（DRGs）1,2液压挤出脊髓的方法显著快于通过椎板切除术进行脊髓分离的传统方法， 即 通过逐节折断脊椎骨的方式，该方法可降低解剖过程中对组织造成的损伤风险3,4背根神经节可能难以识别，准确识别对于组织学分析至关重要。 例如 坐骨神经损伤后。通过根据背根神经节（DRGs）相对于肋骨的位置进行编号，可实现对DRGs的准确定位与识别。
通过本视频所示技术分离的组织可用于多种分析，包括蛋白质印迹5,6、定量PCR7以及免疫组织化学染色8。
在鉴定背根神经节（DRG）时，需要注意的是，脊髓节段的数量已知会因动物种类和品系的不同而有所差异9,10,11。在小鼠中进行该方法的优势在于可获得大量遗传修饰的品系，且饲养成本相对较低。而使用大鼠的优势在于组织产量相对较高，且若涉及神经损伤实验，其较大的体型将使操作更为便利。

<table><tbody><tr><td>邦氏剪刀，超细，直刃，8.5 cm</td><td>F.S.C. (Fine Science Tools)</td><td># 14084-08</td><td>用于在分离背根神经节（成年小鼠、成年大鼠）前切开脊髓；可使用其他厂家产品</td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf</td><td># 5427 R</td><td>用于匀浆组织的离心</td></tr><tr><td>冷冻切片机</td><td>Leica Biosystems</td><td># CM 3050 S</td><td>用于染色前对包埋组织进行切片；可使用其他型号和厂家产品</td></tr><tr><td>镊子，Dumont #3</td><td>F.S.C. (Fine Science Tools)</td><td># 11231-30</td><td>用于脊髓挤出后的操作；可使用其他厂家或类型</td></tr><tr><td>镊子，Dumont #5</td><td>F.S.C. (Fine Science Tools)</td><td># 11252-20</td><td>用于背根神经节的分离（成年小鼠、成年大鼠、幼鼠）；可使用其他厂家产品</td></tr><tr><td>异氟烷（氟烷）IsoFlo Vet 100%</td><td>Abbott</td><td># 002185</td><td>用于安乐死；可使用其他厂家产品；注意：有毒性</td></tr><tr><td>异戊烷 GPR rectapur</td><td>VWR chemicals</td><td># 24872.298</td><td>用于组织的速冻；可使用其他厂家产品；注意：有毒性</td></tr><tr><td>切片机</td><td>Leica Biosystems</td><td># RM 2155</td><td>用于石蜡包埋组织的切片；可使用其他型号和厂家产品</td></tr><tr><td>石蜡颗粒</td><td>Sigma-Aldrich</td><td># 76243</td><td>用于石蜡包埋；可使用其他厂家产品</td></tr><tr><td>石蜡组织包埋工作站</td><td>Leica Biosystems</td><td># EG1160</td><td>用于组织的石蜡包埋以便后续切片；可使用其他型号和厂家产品</td></tr><tr><td>电动无绳研磨杵</td><td>Sigma-Aldrich</td><td># Z359971-1EA</td><td>用于Western blot前对分离组织进行机械匀浆；可使用其他厂家产品</td></tr><tr><td>培养皿，35 mm</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td># 121V</td><td>用于储存分离的背根神经节；可使用其他厂家和尺寸</td></tr><tr><td>培养皿，100 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td># P7741</td><td>用于脊髓挤出；可使用其他厂家和尺寸</td></tr><tr><td>磷酸酶抑制剂 PhosSTOP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td># 04906845001</td><td>磷酸酶抑制剂混合物，可根据需要加入TNE裂解缓冲液中；可使用其他厂家产品</td></tr><tr><td>移液器吸头，1–200 &amp;mu;L，无滤芯</td><td>Sarstedt</td><td># 70.1189.105</td><td>用于液压挤出；可使用其他厂家产品</td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂 Complete</td><td>Sigma-Aldrich</td><td># 05892791001</td><td>蛋白酶抑制剂混合物，可根据需要加入TNE裂解缓冲液中；可使用其他厂家产品</td></tr><tr><td>RNA later 溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td># R0901</td><td>用于RNA稳定保存；可使用其他厂家产品</td></tr><tr><td>RNeasy Protect Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td># 74124</td><td>用于RNA提取；可使用其他厂家产品</td></tr><tr><td>手术刀；Swann-Morton 11号手术刀片</td><td>Swann-Morton</td><td># REF0203</td><td>用于分离脊髓腰段；可使用其他厂家或类型</td></tr><tr><td>剪刀，直刃，3型，25 mm刃口</td><td>Bochem</td><td># 4070</td><td>用于脊柱的分离；可使用其他厂家或类型</td></tr><tr><td>剪刀，130 mm刃口</td><td>Hounisen</td><td># 1902.0130</td><td>用于脊髓的分离（成年大鼠）</td></tr><tr><td>弹簧剪，直刃，8 mm刃口</td><td>F.S.C. (Fine Science Tools)</td><td># 15009-08</td><td>用于在分离背根神经节（幼鼠）前切开脊柱，以及用于背根神经节的分离（成年小鼠、成年大鼠、幼鼠）；可使用其他厂家产品</td></tr><tr><td>标准注射器，2.5 mL、5 mL、10 mL</td><td>Terumo</td><td># SS02SE1；# SS05SE1；# SS10SE1</td><td>用于液压挤出；可使用其他厂家产品</td></tr><tr><td>体视显微镜 MZ12.5，配备1X物镜和10X目镜</td><td>Leica</td><td># 10446370</td><td>可使用其他厂家或类型</td></tr><tr><td>无菌PBS</td><td>GIBCO</td><td># 10010-015</td><td>用于液压挤出；也可根据标准方案自行配制</td></tr><tr><td>注射器针头 23 G × 1&quot;，0.6 × 25 mm</td><td>Terumo Neolus</td><td># NN-2325R</td><td>用于幼鼠的液压挤出；可使用其他厂家或类型</td></tr><tr><td>注射器针头 18 G × 1 1/2，1.2 × 40 mm</td><td>Terumo Neolus</td><td># NN-1838S</td><td>可替代移液吸头用于成年小鼠的液压挤出；可使用其他厂家产品</td></tr><tr><td>Tissue-Tek</td><td>Sakura</td><td># 4583</td><td>用于后续冷冻切片的组织包埋介质</td></tr><tr><td>TNE裂解缓冲液</td><td>VWR chemicals</td><td># 10128-582</td><td>用于Western blot前的组织裂解；可使用其他厂家产品；也可根据标准方案自行配制</td></tr></tbody></table>

啮齿类动物脊髓的液压挤出及背根神经节的分离

Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents

传统上，脊髓通过椎板切除术进行分离。 即 通过逐个打开脊椎骨的方式获取脊髓，这一过程既耗时，又可能在解剖过程中对脊髓组织造成损伤。本文介绍一种利用液压压力挤出脊髓的方法，操作时间显著缩短至数分钟，有助于减少蛋白质损伤。该方法对脊髓组织的损伤风险较低，可提高后续免疫组织化学分析的质量。采用液压法挤出脊髓替代传统的椎板切除术，还可进一步利用同一实验动物进行背根神经节（DRG）的分离，从而减少动物使用数量，并实现同一动物多种组织的联合分析。我们展示了一种根据DRG相对于肋骨的解剖位置进行识别与分离的稳定方法。然而，需注意根据不同实验动物调整该方法，因为不同动物种类或品系的脊髓节段数量（包括胸段和腰段）可能存在差异。此外，我们还展示了分离组织的进一步处理示例。

水压挤出的脊髓显示出光滑且无损伤的表面，如图1所示。腰膨大可轻易识别为脊髓增厚的区域，在图1中以方框标出。根据形态学特征，可肉眼辨别脊髓的背侧和腹侧。在图1中，朝向观察者的为腹侧，其特征是沿整个脊髓有一条明显的中线。沿脊髓走行的两条较宽的线条可用于识别背侧。在最远端，成年大鼠和成年小鼠有时仍可能残留马尾神经。
单个背根神经节（DRG）只有在位于脊柱内时才能被识别，如图2所示。在分离后，如图3所示，单个DRG无法通过外观进行识别。因此，如有需要，在分离过程中必须将其明确分开并保持独立。分离后，脊髓和DRG可按照步骤7.3所述进行处理和染色，如图4所示。图4a显示了DRG切片的免疫组织化学染色结果，其中神经元及其周围的卫星胶质细胞清晰可见。通过准确识别DRG，可分析坐骨神经损伤对受损神经元胞体及其周围卫星胶质细胞的影响。图4b显示了液压挤出的脊髓的尼氏（Nissl）染色结果，切片边缘平滑，表明组织保持完整。
<img alt="背根神经节和脊髓组织切片、免疫组织化学、带有施万细胞的轴突、荧光。" src="/files/ftp_upload/55226/55226fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 4"> 
图 4：代表性组织切片。A. 背根神经节切片的免疫组织化学染色。 B. 液压挤出脊髓的尼氏染色切片。 <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55226/55226fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本文介绍了一种在同一啮齿类动物中进行脊髓液压挤出以及特异性背根神经节（DRGs）识别与分离的实验方案。与传统的脊髓分离方法相比，该方法显著缩短了操作时间，并降低了组织损伤的风险。

传统上，脊髓是通过椎板切除术分离的，即逐个打开脊椎骨。这种方法既耗时，又可能……

本方法的总体目标是通过液压挤出法分离脊髓，并在小鼠和大鼠中识别和分离背根神经节。首先对啮齿类动物实施安乐死，随后进行断头处理。沿脊柱纵向剪开皮肤，并将其与下方组织分离。接下来，沿脊柱两侧向远端方向剪开，将脊柱从周围组织中分离，直至超过骨盆骨。随后，在骨盆骨远端处切断脊柱。将一支装有调整过吸头的注射器插入脊髓最远端的末端。通过施加稳定压力，使用冰上预冷的无菌PBS将脊髓挤出至冰上的培养皿中。用弹簧剪纵向切开脊柱。接着，定位最远端肋骨的附着位点。这可以识别出每侧最远端的胸段背根神经节，记为T13。随后可依次识别其他背根神经节。对应脊髓腰膨大的背根神经节位于远端。使用弹簧剪剪断背根和腹根，然后将背根神经节（DRGs）轻轻从椎管中取出，并转移至含有无菌 PBS 并置于冰上的标记培养皿中。与传统的椎板切除术（即逐节敲碎脊椎骨）相比，液压挤出脊髓是一种显著更快的方法。该方法降低了因解剖操作导致组织损伤的风险，并可获得适用于多种分析的组织样本。背根神经节通常较难辨认，但准确识别对于组织的后续分析至关重要，例如在坐骨神经损伤后。因此，通过根据背根神经节相对于肋骨的位置进行编号，可实现对其的一致性识别。通过切掉未过滤移液器吸头的大端来准备用于脊髓挤出的注射器。调整合适后，吸头将紧密贴合。吸取冰冻的无菌 PBS，并将注射器置于冰上备用。对于成年啮齿类动物，使用 CO2 或异氟烷等气体实施安乐死后，再进行断头处理。不要采用颈椎脱位法，因为这会损伤脊椎，导致无法进行脊髓剥离。幼鼠可通过直接断头处死。向毛皮上洒水以控制毛发。接着，沿脊柱向远端方向切开毛皮。沿脊柱两侧剪开，越过骨盆骨，分离脊柱，并在骨盆近端处切断脊柱。修剪脊柱时应去除近端和远端部分，因为这些区域可能导致脊柱呈过度S形，从而影响脊髓的顺利挤出。确保脊柱两端均可见脊髓。若脊髓不可见，需继续修剪脊柱直至脊髓显露。将含有 PBS 的培养皿置于冰上。用食指按住脊柱近端弯曲部位，使脊柱伸直。将移液器吸头插入脊髓的远端。施加稳定压力，将脊髓挤出至培养皿中。切开脊柱，在脊柱腹侧切除数节椎骨，然后转移至背侧切除数节椎骨。沿着脊柱全程交替两侧进行操作。将打开的脊髓置于显微镜下。通过定位脊柱中末端最远肋骨的附着位置，识别T13椎骨节段。注意不要将最远端的肋骨与邻近的肋间神经混淆。最远端的肋骨附着于T13椎体节段的近端，而T13背根神经节（DRG）位于T13椎骨远端和L1椎骨近端。沿远端方向辨认伴随的背根神经节。准备若干标好数字、盛有冰上预冷无菌PBS的培养皿。为避免在取出过程中损伤背根神经节（DRG），应使用5号镊子夹住背侧和腹侧根，而不是直接夹住DRG本身。使用显微剪刀，先切断外周神经，再依次切断背侧根和腹侧根。在幼鼠中，这些神经的可见度不如成年啮齿类动物清晰。为了尽可能靠近背根神经节（DRG）切断神经，可轻轻使剪刀尖端沿背根神经节滑动，以在剪切前定位剪刀尖端。使用闭合镊子的尖端轻轻舀出背根神经节，并将其转移至相应的培养皿中。在成年大鼠和成年小鼠中，背根神经节呈白色，背侧根和腹侧根清晰可见；而在幼鼠中，背根神经节则呈现为透明的球状结构。进行蛋白质印迹实验时，分离目标组织并将其放入裂解缓冲液中。随后，匀浆组织，离心，收集上清液，并按照标准操作流程进行蛋白质印迹。对于RNA分析，分离目标组织后应立即将其放入RNA稳定溶液中。接下来，按照标准方案进行qPCR。对于速冻组织的免疫组织化学，将干冰粉末准备在一片银箔上。将组织置于干冰粉末上，使其迅速冷冻。然后将组织转移至冷冻切片机中并包埋，以进行切片。在室温下用4%PFA固定组织10分钟，并根据标准方案进行免疫组织化学染色。对于冷冻切片的免疫组织化学实验，需在4°C条件下用4%PFA固定组织，随后在4°C条件下将其转移至25%（重量/体积）蔗糖溶液中过夜。将组织置于包埋剂中，并使用预冷的2-甲基丁烷冷冻组织。在冷冻切片机中切片，并根据标准操作流程进行免疫组织化学染色。对于石蜡切片的免疫组织化学染色，先将组织在4°C条件下用4% PFA固定，随后转移至25%（质量/体积）蔗糖溶液中，4°C过夜。将组织包埋于石蜡中，在切片机上对组织进行切片，并根据标准方案进行免疫组织化学染色。根据所使用的免疫组织化学染色抗体，示例中的任一组织处理方法均可适用。观看本视频后，您应能够充分掌握如何通过液压挤出法分离脊髓，以及如何一致地识别并分离背根神经节。此处展示的方法适用于所有年龄段的小鼠和大鼠，所分离的组织可用于多种分析，包括需要快速分离未固定组织的方法。

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