果蝇梳理行为的量化分析

本方法的总体目标是通过定量和比较在梳理与未梳理条件下果蝇个体体表残留的亮黄色染料，来测量果蝇的梳理行为。该方法有助于解答神经生物学与行为遗传学领域中的一些关键问题，例如精细运动技能的协调机制及其相关的分子调控因子与神经环路。该技术的主要优势在于快速、稳健，且易于不同技能水平的实验人员和学生操作实施。

本实验操作将由我实验室的学生 Frankie Barradale 演示。实验开始前，准备一个吸气装置，用于将活体果蝇从培养管转移至梳理行为观察室。使用剪刀剪取 1.5 英尺长的Tygon软管。

剪下一支1毫升一次性移液器吸头的尖端至少一英寸长，将一块一厘米见方的筛网覆盖在剪下的吸头196英寸开口端。将一支新的1毫升移液器吸头紧密套在筛网上方和剪下的吸头外，形成一个用于容纳果蝇的暂存室。剪去该新移液器吸头最末端的尖端，以扩大开口，使其足以允许单只果蝇通过。

孔的大小应与梳理室的开口大致相同。将嵌套的管尖紧密地套在Tygon管的末端。将管尖推入管中，以确保紧密贴合，从而保证真空压力的传导。

在导管的另一端，剪去一个200微升微量移液器吸头的尖端，并将剪窄的一端插入导管中，形成吸液器的口吸端。准备粉尘分装管时，先将5毫克亮黄色染料称量于称量纸上，然后将粉尘倒入8毫升微量离心管中，并拧紧管盖。

接下来，准备乙醇管：将 1 毫升 100% 乙醇移液至 15 毫升的微量离心管中。标记管子，盖上盖子，并将乙醇管保存好以用于完成梳理行为实验。同时需至少设置一个空白对照样本，其中仅加入 1 毫升乙醇而不放入果蝇，作为阴性对照。

将带有较小孔洞的滑动顶板与每个梳理室组装，但保留带有较大孔洞的底板不安装，以便后续添加粉尘。将每个所需的梳理室平放在桌面上，顶面朝下。通过轻敲装有亮黄色染料的离心管，使其五毫克分装量落入目标孔位上方的梳理室表面，完成加样。

轻敲培养室，使所有灰尘通过筛网落至培养板顶部。然后将底板旋紧到每个培养室上，确保锥形开口的较宽端朝外，且孔洞不覆盖在孔井上方。牢固固定底板，防止其滑动并导致染料泄漏。

将小室翻转过来，轻轻敲击桌面数次，使灰尘通过网筛落在底板上。将小室的顶板滑动至打开位置，使小孔与15个孔井对齐，以便将果蝇引入各个孔井中。将吸虫管的一端轻轻含入口中，像使用吸管一样轻吸，将一只果蝇吸入吸虫管内。

将果蝇轻轻吹出，并将开口朝向目标位置。加载完一个孔后，滑动上层板使果蝇被困在检测室内，并在加载其他孔的过程中用胶带封住已加载孔的开口，以防止果蝇逃逸。若多个果蝇被吸入同一孔中，保持该孔开口敞开，直至仅剩一只果蝇。

在所有必要的孔中装入果蝇后，将装置翻转，使底板朝上，使粉尘能够通过筛网落下并覆盖果蝇。拧紧顶部和底部板的螺丝以牢固固定装置，随后涡旋震荡装置 4 秒，使果蝇被染料粉尘覆盖。将装置顶部朝下在桌面上轻击两次，使染料穿过筛网到达另一侧。

然后，将小室翻转，使顶板朝上，轻敲小室两次，确保染料沉降至底部小室的底面，远离位于顶室中的果蝇。对于不允许梳理的对照果蝇，立即进行样品制备。将小室平放在桌面或台面上，顶板朝上，静置30分钟，以允许果蝇进行梳理。

将培养室置于无噪音和振动的环境中，以确保所有梳理行为实验的环境条件保持恒定。保持培养室水平且顶板朝上，轻轻拧开底板并将其从培养室上取下，注意不要丢失任何染料。将培养室放置于二氧化碳垫上，并调至低气流，直至果蝇被麻醉。

从培养室上部拆下顶板，小心使用镊子夹住果蝇的一条腿，从每个培养室中取出一只沾有染料的果蝇，并将其放入含有乙醇的1.5毫升微量离心管中。当每个微量离心管中均含有一只果蝇后，盖紧管盖，并将管子倒置三次，以振荡并充分混匀染料与乙醇溶液。将含有乙醇和果蝇的离心管在室温下孵育5小时，以确保染料完全从果蝇体内溶解至溶液中。

孵育五小时后，短暂涡旋振荡每个离心管两秒钟，以确保染料从果蝇身上完全清除。从实验用的1.5毫升离心管中吸取50微升样品，转移至96孔板的一个孔中，并记录每个样品在板上的具体位置。加入200微升乙醇，将样品稀释五倍，以避免因果蝇体表粉尘过多或存在较大 grooming 缺陷而产生的封边效应。

使用酶标仪在 397 纳米波长下分析每个样品。通过酶标仪记录样品，并将板上样品的记录保存至电子表格中。我们采用该方法通过比较强低表达 DopR 突变体、DopR 空突变体与野生型品系的理毛行为，来研究 DopR 的功能。

DopR突变体保留的染料显著多于其野生型或拯救型对照，表明DopR突变体的梳理行为效率较低。在对Rutabaga果蝇进行的平行实验中，突变体表现出比DopR突变体更高的染料积累水平，提示DopR在梳理行为中具有重要作用。观看本视频后，您应能充分掌握果蝇行为学实验的操作方法，并学会如何测量梳理行为。