Name: 使用人类流感病毒感染的斑马鱼模型到屏幕抗病毒药物和表征宿主免疫细胞反应 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: 学习使用斑马鱼模型研究人类甲型流感病毒，通过全身感染模型筛选抗病毒药物，并利用局部感染模型表征宿主免疫细胞反应。该方法为流感免疫机制研究提供高通量平台。

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作者感谢Mark Nilan在斑马鱼饲养与维护方面提供的帮助，以及Meghan Breitbach和Deborah Bouchard在NS1-GFP扩增和IAV滴度测定方面的工作。本研究得到了NIGMS资助项目NIH P20GM103534以及缅因州农业与林业实验站（出版物编号3493）的支持。

所有操作均应按照美国疾病控制与预防中心（CDC）规定的生物安全二级（或BSL2）标准进行，并遵守机构动物护理和使用委员会（IACUC）制定的相关规定。请咨询相关主管部门，以确保操作安全并符合规范。
1. 斑马鱼的饲养与维护
<ol>
	<li>繁殖斑马鱼并收集实验所需数量的胚胎。必要时，可采用Adatto et al.32所述的大规模繁殖装置，以获取大量发育阶段一致的胚胎。</li>
	<li>将胚胎置于深型培养皿中，在28 °C条件下，于含60 µg/ml海盐（例如，Instant Ocean）的无菌卵水中低密度（&#60;100个胚胎/皿）培养，直至达到目标发育阶段（全身性IAV感染实验[第3节]为受精后48小时，局部性鳔感染实验[第4节]为受精后5天）。
	<ol>
		<li>使用塑料移液管清除死亡胚胎，并每日更换卵水，以确保胚胎健康和正常发育。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 材料与试剂的准备
<ol>
	<li>配制4 mg/ml的Tricaine-S储备液（用蒸馏水溶解并调节pH至7.0–7.4），经高压灭菌后，于4 °C保存。</li>
	<li>使用拉针仪将带细丝的硼硅酸盐玻璃毛细管拉制成针例如 微量移液器拉制仪设置如下：压力 = 100，加热温度 = 550，拉制 = [无数值]，速度 = 130，时间 = 110。 
	注意：在修剪针头之前，从针尖开始变细处至针尖末端的长度通常约为12–15 mm。然而，该长度可根据个人偏好和具体应用有所调整。较长且渐变的锥形针尖可能更为理想，因其穿透胚胎的能力更强，且针头弯曲或断裂的风险更低。</li>
	<li>将2 g琼脂糖在100 ml蛋水中用微波炉融化。将融化的琼脂糖倒入深型培养皿中，待其凝固，制成用于排列和注射胚胎的琼脂糖板。</li>
	<li>在无核酸酶水中配制10 mg/ml的扎那米韦储备液。分装后于-20 °C保存。</li>
	<li>使用微波炉将0.5 g琼脂糖溶于50 ml卵水（egg water）中，制备用于胚胎固定的琼脂糖溶液。成像前置于50 °C水浴中保温备用。</li>
</ol>
3. 全身性 IAV 感染（受精后 48 小时）
警告：所有研究人员在开始进行流感病毒（IAV）相关工作前，应咨询其主管和医生，了解是否需要接种疫苗。
<ol>
	<li>在实验当天使用 #5 镊子手动去除胚胎的卵膜。注意将过程中受伤的胚胎移除，并在 200 µg/ml 的 Tricaine 溶液中实施安乐死。</li>
	<li>用于显微注射的流感病毒（IAV）制备 
	注：已证实可感染斑马鱼胚胎的毒株包括流感病毒 A/PR/8/34 (H1N1) (APR8)、流感病毒 A X-31 A/Aichi/68 (H3N2) (X-31)，以及荧光报告病毒株 NS1-GFP33。有关 APR8 和 X-31 及其他毒株的详细信息，可参见流感研究数据库
	<ol>
		<li>按照先前描述的方法34,35，在受精鸡胚中扩增 IAV 的 NS1-GFP 毒株。收集、分装并测定含有 IAV 的羊水液滴度，然后于 -80 °C 保存。预测定滴度的 APR8 和 X-31 病毒可商业购买。
		<ol>
			<li>在感染前，用手套快速融化一份 IAV 分装样品，随后立即置于冰上，以减少滴度损失。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>病毒稀释
		<ol>
			<li>若使用 APR8 或 X-31 病毒，于超净台中将其稀释至 3.3 x 106 鸡胚半数感染剂量（EID50）/ml，溶剂为无菌、冰冻的 PBS，并添加 0.25% 酚红（便于观察）。同时设置对照组，仅含添加 0.25% 酚红的无菌 PBS。</li>
			<li>若使用 NS1-GFP 毒株33，于超净台中将其稀释至约每 nl 含 1.5 x 102 空斑形成单位（PFU），溶剂为含 0.25% 酚红的无菌、冰冻 PBS。同时设置对照组，使用未感染鸡胚的羊水液，按与病毒相同的稀释比例溶于含 0.25% 酚红的无菌 PBS 中。</li>
			<li>在使用前始终将 IAV 置于冰上保存。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在即将使用前，使用微加载吸头将病毒溶液吸入显微注射针中。将显微注射针插入注射装置的相应针座中（例如 MPPI-3 压力注射系统）。</li>
		<li>在体视显微镜下，用锋利且已灭菌的 #5 镊子轻轻剪断显微注射针尖。 
		注：建议逐步轻微剪切注射针尖。</li>
		<li>踩下压力注射系统的脚踏开关，将液体注入置于校准测微载玻片上的显微镜浸油液滴中。测量液滴直径，并利用公式 V=4/3πr3 计算其体积，其中 V 为体积（单位为 nl），r 为半径（单位为 µm）。 
		注：若液滴直径过小，可进一步剪切玻璃针尖，或调整压力和时间参数；若液滴过大，则可调整压力和时间参数。</li>
		<li>调整压力注射仪的压力和时间参数，或重新剪切针尖，直至达到所需注射体积（通常为 1–3 nl）。典型的压力设置范围为 20 至 30 psi，脉冲持续时间设置范围为 40 至 80 毫秒。调节回压，使其抵消毛细作用力，但不导致 IAV 泄漏（净压力为零）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>排列胚胎以进行注射
	<ol>
		<li>将去膜后的胚胎置于 200 µg/ml 的 Tricaine 中麻醉。</li>
		<li>待胚胎停止活动后，用塑料移液管将 10–20 个胚胎转移至 2% 琼脂糖板（按第 2.3 节制备）。使用塑料移液管去除多余液体。</li>
		<li>用火焰抛光并密封的硼硅酸盐玻璃毛细管轻轻排列胚胎以进行显微注射。在体视显微镜下，轻柔调整胚胎方向，使库瓦氏管或后主静脉与显微注射针对齐（图 1A）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>IAV 显微注射
	<ol>
		<li>将显微注射针轻轻插入库瓦氏管或后主静脉。踩下脚踏开关，将所需体积的 IAV 注入胚胎循环系统（图 1A）。如有必要，可对同一胚胎进行多次注射。 
		注：注射的液体应迅速进入循环并分布至全身。若注射体积在注射部位积聚，则应将该胚胎移出实验并实施安乐死。</li>
		<li>使用与所选病毒株对应的对照溶液，对其他胚胎重复进行注射操作。对于 APR8 和 X-31，使用第 3.2.2.1 节所述对照；对于 NS1-GFP 毒株，使用第 3.2.2.2 节所述对照。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将胚胎转移至含有无菌卵水的标记培养皿中，并置于 33 °C 的培养箱中培养。 
	注：感染后的胚胎应在 33 °C 下培养，以促进病毒高效复制。此外，33 °C 的培养条件更接近人体上呼吸道的温度环境，该部位与外界较低温度直接接触，也是 IAV 感染发生的主要部位。胚胎可适应较宽的温度范围34。</li>
</ol>
4. 转基因斑马鱼（受精后5天）Tg(mpx:mCherry) 中局部性 swim bladder IAV 感染
<ol>
	<li>流感病毒微注射前准备
	<ol>
		<li>按照第3.2节所述方法稀释NS1-GFP毒株及对照注射溶液。</li>
		<li>按照第2.2节所述方法制备注射针头。</li>
		<li>按照第3.3节所述方法排列携带充气 swim bladder 的 Tg(mpx:mCherry)35 幼鱼，但需注意以下例外：应以使针头能够刺入 swim bladder 并将病毒注入 swim bladder 后部的方式排列幼鱼，如先前所述36（图2A）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>流感病毒微注射
	<ol>
		<li>将微注射针头轻柔插入 swim bladder，并向该结构的后部注射所需体积（例如 5 nl）（图2A）。 
		注意：注射液应聚集于后部，swim bladder 的气泡应被向前推移。注射后3小时应开始观察到GFP表达。</li>
		<li>按照第3.4.2节所述方法，使用针对所选病毒株的对照溶液重复注射操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将幼鱼转移至含有无菌卵水的培养皿中，并置于33 °C恒温培养箱中培养。</li>
</ol>
5. 抗病毒药物治疗
注意：以下方案描述了 Gabor 等19 之前报道的扎那米韦治疗方案。该方案可进行修改，用于筛选其他抗病毒药物，并具有进一步优化为在96孔板中高通量筛选多种化合物的潜力。
<ol>
	<li>感染后3小时，将NS1-GFP感染鱼和对照感染鱼的卵水更换为含有0、16.7或33.3 ng/ml扎那米韦的无菌卵水。 
	注：选择这些浓度是为了尝试模拟人类患者使用扎那米韦后达到的生理浓度（100、200或600 mg，静脉注射，每日两次，或10 mg吸入，每日两次）。人类患者的血清浓度范围为9.83至45.3 ng/ml36。</li>
	<li>在5天内，每12小时更换一次卵水，并替换为含有相应浓度扎那米韦的无菌卵水。</li>
	<li>监测感染进程。
	<ol>
		<li>用200 µg/ml三卡因麻醉斑马鱼。通过体视荧光显微镜监测GFP表达，以直观观察流感病毒感染鱼与对照鱼之间以及在不同药物浓度中浸泡的鱼之间的感染模式差异。</li>
		<li>在感染后5天内持续监测发病和死亡情况。
		<ol>
			<li>记录与疾病病理相关的感染动态观察结果，包括嗜睡迹象、水肿表现、色素沉着差异、眼部和颅面畸形以及脊柱弯曲。对照感染鱼通常在注射后24–48小时出现明显病理表现，具体时间取决于注射的病毒量。在注射后24小时采集图像。</li>
			<li>在感染后5天内，每隔24小时记录一次死亡、发病和健康幼鱼的数量。以无法检测到明显心跳作为死亡标准。根据需要绘制数据图表。例如，可将数据绘制成堆叠柱状图，纵轴表示健康、发病或死亡鱼的百分比，横轴表示处理组别。19 
			注：死亡率可采用Kaplan-Meier生存估计进行评分。根据具体应用，可能需要开发其他评估鱼类发病程度的方法，例如建立评分矩阵，依据上述观察到的病理特征对发病严重程度进行量化。</li>
			<li>咨询统计学家以应用适当的统计分析方法。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 中性粒细胞迁移
注意：以下方案描述了一种在局部上皮性流感病毒A（IAV）感染后，追踪中性粒细胞迁移至鳔的方法。所述方法可进行修改，以检测遗传和化学干预的影响。利用该技术，可深入表征中性粒细胞在IAV感染期间行为背后的分子机制。
<ol>
	<li>用于成像的斑马鱼固定
	<ol>
		<li>用 200 µg/ml 的 Tricaine 对待成像的幼鱼进行麻醉。</li>
		<li>将已感染 NS1-GFP 的单条 Tg(mpx:mCherry) 幼鱼转移至 24 孔玻璃底培养板的一个孔中，使用少量卵水（约 50–100 µl）。对其他感染 IAV 及对照组的斑马鱼重复此步骤。</li>
		<li>缓慢向每个孔中加入 1% 琼脂糖胚胎固定培养基（见第 2.5 节），注意避免引入大气泡。
		<ol>
			<li>轻轻调整幼鱼的位置，使其侧向固定。Goody 和 Henry37 描述了如何利用固定在带细丝的硼硅酸盐玻璃毛细管中并用超级胶水固定的昆虫针制作适用于此操作的探针。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>待琼脂糖凝固后，轻轻向各孔中加满含有 200 µg/ml Tricaine 的卵水。</li>
		<li>使用共聚焦显微镜，以 20X 物镜对准鳔，采集一系列明场和荧光图像的 z 轴层扫数据。
		<ol>
			<li>设定上下限，确保涵盖所有可见的绿色和红色荧光信号。</li>
			<li>以每像素 2.0 µsec 的速度采集图像，步进距离 ≤ 4 µm。增加每像素时间并减小步进距离（例如 0.5 – 1.0 µm）可提高图像分辨率和质量。</li>
			<li>通过合并图层生成二维图像。</li>
			<li>比较 IAV 感染组与对照注射组斑马鱼鳔中 mpx-mCherry 阳性中性粒细胞的数量。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

为了最大限度地利用小型动物模型研究人类宿主与病原体相互作用的优势，重要的是提出并检验能够充分利用该模型系统内在优势的研究问题和假设。作为人类甲型流感病毒（IAV）感染的模型，斑马鱼具有多个优势，包括繁殖力高、组织透明、适合药物筛选，以及存在多种可标记中性粒细胞等免疫细胞的转基因品系。斑马鱼已发展成为研究炎症和先天免疫日益有力的小鼠模型替代系统。由于斑马鱼在发育的前4至6周内缺乏功能性适应性免疫应答，因此其抵御损伤和感染依赖于先天免疫应答37。在此发育早期阶段，可以分离并研究仅来源于先天免疫应答的抗病毒反应机制。这一研究得益于诸如Tg(mpx:mCherry)等转基因斑马鱼品系的建立，该品系利用红色荧光蛋白标记中性粒细胞。
近期已有研究描述了类似于人类疾病的甲型流感病毒（IAV）感染斑马鱼模型19。研究表明，斑马鱼细胞表面具有α-2,6连接的唾液酸残基，使IAV病毒能够识别、结合并侵入细胞。在本论文以及Gabor et al.<sup class="xr...

根据世界卫生组织（WHO）的数据，流感病毒每年感染5%至10%的成年人和20%至30%的儿童，导致全球范围内出现300万至500万例重症病例，最多造成50万人死亡1。每年接种流感疫苗仍是预防该疾病的最佳手段。诸如WHO全球行动计划等举措已提高了季节性疫苗的使用率、疫苗生产能力，并推动了更高效疫苗策略的研发，以降低季节性流感暴发所致的发病率与死亡率2。在部分国家，已有神经氨酸酶抑制剂类抗病毒药物（例如扎那米韦和奥司他韦）可供使用，若在症状出现后的前48小时内给药，已被证实可有效缓解症状3,4,5。尽管全球已付出诸多努力，但目前控制季节性流感暴发仍面临巨大挑战，因为流感病毒的抗原漂移速度往往超过当前应对病毒基因组变化的能力6。针对新病毒株的疫苗策略必须提前开发，有时由于流感季节中最终占主导地位的病毒株类型发生不可预见的变化，导致疫苗效果未能达到最佳。基于上述原因，显然有必要开发用于控制感染并降低死亡率的替代性治疗策略。通过更深入地理解宿主与病毒之间的相互作用，有望研发出新型抗流感药物及辅助治疗手段7,8。
人类宿主与甲型流感病毒（IAV）之间的相互作用十分复杂。为了深入了解宿主与病毒的相互作用，已开发出多种用于模拟人类IAV感染的动物模型，包括小鼠、豚鼠、棉鼠、仓鼠、雪貂和猕猴9。尽管这些模型提供了重要的数据，增进了对宿主-IAV动态关系的理解，但每种模式生物都存在显著缺陷，在尝试将研究结果转化为人类医学应用时必须予以充分考虑。例如，使用最广泛的模型小鼠在感染人源流感分离株后通常难以表现出明显的IAV诱导感染症状9。其原因是小鼠缺乏对人源流感分离株的天然嗜性，因为小鼠上皮细胞表达的是α-2,3唾液酸连接，而人类上皮细胞表达的是α-2,6唾液酸连接10。人源IAV分离株中的血凝素蛋白更倾向于通过受体介导的内吞作用结合并进入带有α-2,6唾液酸连接的宿主细胞9,11,12,13。因此，目前公认在构建用于研究人类流感的小鼠模型时，必须谨慎选择合适的小鼠品系与流感毒株配对，以获得能够模拟人类疾病部分特征的疾病表型。相比之下，雪貂上呼吸道上皮细胞具有与人类细胞相似的α-2,6唾液酸连接14。感染后的雪貂表现出许多与人类疾病相似的病理和临床特征，包括人源和禽源流感病毒的致病性和传播能力14,15。此外，雪貂也十分适用于疫苗效力试验。然而，雪貂作为人类流感模型仍存在若干缺点，主要与其体型和饲养成本较高有关，这使得获取具有统计学意义的数据变得困难。此外，雪貂在药物药代动力学、生物利用度和毒性方面曾表现出与人类的差异，从而增加了疗效测试的难度。例如，雪貂对M2离子通道抑制剂金刚烷胺表现出毒性16。因此，显然在选择用于研究人类IAV感染的动物模型时，必须综合考虑该模型固有的优势与局限性，以及所研究的宿主-病毒相互作用的具体方面。
斑马鱼， Danio rerio是一种动物模型，为研究微生物感染、宿主免疫反应以及潜在的药物治疗提供了独特的机会17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28斑马鱼细胞表面存在α-2,6连接的唾液酸，提示其对甲型流感病毒（IAV）具有易感性，感染实验结果及成像分析证实了这一点 体内 使用流感病毒A的荧光报告菌株19在感染IAV的斑马鱼中，抗病毒基因的表达增加 ifnphi1 和 mxa 转录本分析表明，先天免疫反应已被激活，感染IAV的斑马鱼表现出的病理特征（包括水肿和组织破坏）与人类流感感染中观察到的病理相似。此外，IAV抗病毒神经氨酸酶抑制剂扎那米韦（Zanamivir）可降低斑马鱼的死亡率并减少病毒复制19.
本报告描述了一种在斑马鱼胚胎中建立系统性甲型流感病毒（IAV）感染的实验方案。通过使用临床相关剂量的扎那米韦作为概念验证，证明了该斑马鱼IAV感染模型在筛选具有抗病毒活性化合物方面的实用性。此外，还描述了一种在斑马鱼鳔内建立局部性、上皮性IAV感染的实验方案；该器官在解剖结构和功能上被认为与哺乳动物肺脏具有相似性21,29,30,31。利用这一局部IAV感染模型，可追踪中性粒细胞向感染部位的募集过程，从而有助于研究中性粒细胞生物学在IAV感染及炎症反应中的作用。这些斑马鱼模型补充了现有用于人类IAV感染研究的动物模型，尤其适用于小分子化合物和免疫细胞反应的检测，因其具备更高的统计效能、中等到高通量检测能力，以及利用光学显微镜追踪免疫细胞行为与功能的优势。

<table><tbody><tr><td>Instant Ocean</td><td>Spectrum Brands</td><td>SS15-10</td><td></td></tr><tr><td>100 mm x 25 mm 无菌一次性培养皿&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>89107-632</td><td></td></tr><tr><td>移液管&amp;nbsp;</td><td>Fisherbrand</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>三卡因-S（MS-222）</td><td>Western Chemical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>带细丝的硼硅酸盐玻璃毛细管&amp;nbsp;</td><td>Sutter Instrument&amp;nbsp;</td><td>BF120-69-10</td><td></td></tr><tr><td>Flaming/Brown 微量移液管拉制仪&amp;nbsp;</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>扎那米韦</td><td>AK Scientific</td><td>G939</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 镊子&amp;nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72700-D</td><td></td></tr><tr><td>微量加样器吸头</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td></td></tr><tr><td>显微镜浸油</td><td>Olympus</td><td>IMMOIL-F30CC</td><td></td></tr><tr><td>显微镜载物台校准载玻片&amp;nbsp;</td><td>AmScope</td><td>MR095</td><td></td></tr><tr><td>MPPI-3 压力注射仪&amp;nbsp;</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Olympus</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>背压装置</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>BPU</td><td></td></tr><tr><td>微量移液管固定器套件</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>MPIP</td><td></td></tr><tr><td>脚踏开关</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>FSW</td><td></td></tr><tr><td>显微操作器</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>MM33</td><td></td></tr><tr><td>磁力底座</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>Magnetic Base</td><td></td></tr><tr><td>酚红&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>P-4758</td><td></td></tr><tr><td>低温培养箱</td><td>VWR</td><td>2020</td><td></td></tr><tr><td>SteREO Discovery.V12</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>照明器</td><td>Zeiss</td><td>HXP 200C</td><td></td></tr><tr><td>冷光源</td><td>Zeiss&amp;nbsp;</td><td>CL6000 LED</td><td></td></tr><tr><td>玻璃底多孔板，24 孔</td><td>Mattek</td><td>P24G-0-13-F</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Olympus</td><td>IX-81 配备 FV-1000 激光扫描共聚焦系统</td><td></td></tr><tr><td>Fluoview 软件</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prism v6</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>流感病毒 A/PR/8/34 (H1N1)&amp;nbsp;</td><td>Charles River&amp;nbsp;</td><td>490710</td><td></td></tr><tr><td>流感病毒 A X-31, A/Aichi/68 (H3N2)&amp;nbsp;</td><td>Charles River&amp;nbsp;</td><td>490715</td><td></td></tr><tr><td>流感 NS1-GFP</td><td></td><td></td><td>参见 Manicassamy &lt;em&gt;等&lt;/em&gt;，2010</td></tr><tr><td>Tg(mpx:mCherry)</td><td></td><td></td><td>参见 Lam &lt;em&gt;等&lt;/em&gt;，2013</td></tr></tbody></table>

利用斑马鱼模型研究人类甲型流感病毒感染以筛选抗病毒药物并表征宿主免疫细胞反应

Using Zebrafish Models of Human Influenza A Virus Infections to Screen Antiviral Drugs and Characterize Host Immune Cell Responses

每年，季节性流感暴发都会对全球社会造成深远影响。尽管全球已付出诸多努力，流感仍然是难以解决的医疗负担。防控感染的主要策略是每年接种疫苗。对于已感染流感的个体，抗病毒药物可缓解症状。显然，目前仍迫切需要开发应对流感的替代性策略。已有多种动物模型被用于模拟宿主与流感病毒的相互作用。本文描述了建立斑马鱼模型以研究全身性和局部性人甲型流感病毒（IAV）感染的实验方案。利用全身性IAV感染模型，可对具有潜在抗病毒活性的小分子进行筛选。作为原理验证，文中介绍了一项展示抗病毒药物扎那米韦在IAV感染斑马鱼中疗效的实验方案，说明如何量化疾病表型，以评估潜在抗病毒药物在IAV感染斑马鱼中的相对疗效。近年来，人们日益认识到中性粒细胞在人体对流感病毒感染的免疫应答中发挥着关键作用。斑马鱼已被证实是研究中性粒细胞生物学不可或缺的模型，对人类医学具有直接推动意义。本文描述了一项在 Tg(mpx:mCherry) 斑马鱼品系中建立局部IAV感染的实验方案，用于在局部病毒感染背景下研究中性粒细胞生物学。中性粒细胞向局部感染部位的募集为评估可能具有治疗应用价值的实验干预提供了另一项可量化的表型指标。文中所述的两种斑马鱼模型均真实再现了人IAV感染的多个方面。斑马鱼模型具有多种内在优势，包括繁殖力高、组织光学通透性好、适用于药物筛选，以及拥有多种转基因品系（例如，可用荧光蛋白标记中性粒细胞等免疫细胞）。本文详述的实验方案充分利用了这些优势，有望揭示宿主与IAV相互作用的关键机制，最终推动临床转化。

本文提供了数据，说明如何利用斑马鱼的系统性流感病毒（IAV）感染模型来测试药物疗效（图1A）。在受精后48小时的胚胎通过库维叶管注射APR8（图1C、1F）、X-31（图1D、1G）或NS1-GFP（图1H-1I）以建立病毒感染。另一组在受精后48小时的胚胎被注射作为病毒感染的对照组（图1B、1E）。感染后48小时，注射了IAV的斑马鱼表现出心包水肿（图1C、1D）和循环停止（图1F）的迹象，红细胞分布于整个心包腔（图1G）。使用NS1-GFP病毒时，通过荧光显微镜观察到感染后3小时即可检测到GFP的初始表达。此时，将斑马鱼暴露于33.3 ng/ml剂量的神经氨酸酶抑制剂扎那米韦（Zanamivir）。该剂量大致相当于给予人类患者的200 mg剂量。未接受扎那米韦处理的感染对照组鱼类（图1...

展示了用于人类甲型流感病毒的全身性及局部感染斑马鱼模型。利用全身性感染模型，可将斑马鱼用于抗病毒药物的筛选；利用局部感染模型，可将斑马鱼用于宿主免疫细胞反应的表征。

每年，季节性流感暴发都会对全球社会产生深远影响。尽管全球已做出诸多努力，流感仍然是一个棘手的公共卫生问题……

这些实验的总体目标是利用斑马鱼作为流感模型，研究宿主对病毒感染的免疫应答，并筛选抗病毒化合物。这些方法有助于回答流感领域中的关键问题，例如吞噬细胞在感染过程中对免疫和炎症反应的作用，以及潜在抗病毒疗法的疗效。由于斑马鱼在发育过程中的光学通透性以及能够进行中高通量检测，斑马鱼流感模型使得此前未能解答的问题得以研究。根据文本方案准备好试剂并将胚胎培养至所需阶段后，在实验当天，使用5号镊子去除胚胎的卵膜。如果使用APR-8或X31病毒，需在超净工作台中将病毒稀释至每毫升含3.3 × 10⁶ EID₅₀（50%卵感染剂量），稀释液为添加了0.25%酚红的无菌冰上预冷的PBS。如果使用NS1-GFP毒株，则将病毒稀释至每纳升约含1.5 × 10² PFU。同时，设置一个对照组，其中包含来自未感染鸡胚的尿囊液，其稀释倍数与病毒液相同。然后，使用微量加样器吸头将病毒溶液移入显微注射针中，并将显微注射针插入注射装置相应的针座内。根据文本方案剪切针尖后，调节压力注射仪的压力和时间参数，或再次修剪针尖，直至达到所需的注射体积。胚胎麻醉后，使用塑料移液管将10至20个胚胎转移至2%琼脂糖平板上，并用移液管吸除多余液体。在体视显微镜下，使用经火焰抛光并密封的硼硅酸盐玻璃毛细管轻轻排列和调整胚胎方向，使古维叶管或后主静脉与显微注射针尖对齐。为进行IAV的显微注射，应轻柔地将显微注射针插入古维叶管或后主静脉中。然后，踩下脚踏板，将所需体积的 IAV 注入胚胎的循环系统。为实现全身性感染，关键在于注射的药液必须迅速进入循环系统并分布至全身。若药液积聚在感染部位，应将该胚胎从实验中剔除并实施安乐死。受精后第五天，按照本视频前面所述方法准备显微注射针。参照此前演示的方法排列含有膨胀鳔的TG MPX mCherry幼鱼，但调整幼鱼位置，使针头可刺入鳔并使病毒注入鳔的后部。轻柔地将显微注射针插入鳔内，并将所需体积的病毒液注入该器官后部。注射液应聚集于鳔的后部，同时使鳔内的气泡向前移动。为成功建立鳔感染，注射的液体必须聚集在鳔的后部，从而使气泡向前移位。注射后3小时即可开始观察到绿色荧光蛋白（GFP）的表达。完成注射（包括对照溶液的注射）后，将幼鱼转移至含有无菌卵水的培养皿中，并在33摄氏度条件下培养鱼类。为进行抗病毒药物处理，在感染后3小时，将NS1-GFP感染组和对照组感染鱼的卵水更换为含有0、16.7或33.3纳克/毫升扎那米韦的无菌水。从注射后24至48小时开始，开始记录与疾病病理相关的感染动态观察结果，包括嗜睡迹象、水肿证据、色素沉着差异、眼部及颅面畸形以及脊柱弯曲症。感染后连续五天，每天记录死亡、病态及健康幼虫的数量。将数据绘制成堆叠柱状图，以Y轴表示健康、病态或死亡鱼体的百分比，X轴表示处理组。为进行成像，将一条感染了NS1-GFP的转基因MPX mCherry幼鱼转移至24孔玻璃底板的一个孔中，并加入少量卵水。对其他感染IAV和对照组的鱼重复上述步骤。向每个孔中缓慢加入1%琼脂糖胚胎固定介质，注意避免产生大气泡。轻轻调整幼鱼的位置，使其侧向固定。琼脂糖凝固后，使用含200微克/升三卡因的卵水轻轻填充各个孔。利用共聚焦显微镜，采用20倍物镜聚焦于鱼鳔，采集一系列明场和荧光图像的z轴层扫图像。定量并比较感染IAV与对照注射的斑马鱼鱼鳔中MPX mCherry阳性中性粒细胞的数量。此处展示的数据表明，可利用斑马鱼的系统性IAV感染来测试药物的有效性。在48小时体节期（HPF）时，通过静脉导管向胚胎注射APR8、X31或NS1-GFP以建立病毒感染。作为病毒感染对照的胚胎也在48 HPF时进行注射。感染48小时后，注射流感A病毒（IAV）的斑马鱼表现出心包水肿和循环停止的迹象，心包腔内可见红细胞。未暴露于扎那米韦的感染鱼在全身性GFP表达中显示出水肿特征。在暴露于扎那米韦的NS1-GFP感染幼鱼中，GFP荧光显示的大体病理学损伤减轻。在本实验的局部斑马鱼鳔感染模型中，将NS1-GFP病毒注射到受精后五天的转基因MPX mCherry幼鱼的鳔内，并追踪mCherry标记的中性粒细胞向鳔的募集情况。感染后20小时，与注射PBS的对照组相比，甲型流感病毒（IAV）感染鱼的鳔内观察到明显的中性粒细胞迁移，表明IAV能够招募中性粒细胞至鳔，正如其在人体中招募中性粒细胞至肺部一样。这些技术的应用前景涉及抗病毒治疗领域，因其有望揭示宿主与甲型流感病毒（IAV）相互作用的关键机制，最终可能转化为临床应用。请注意，操作流感病毒可能具有极高危险性，在进行本实验时，必须采取包括接种疫苗和穿戴适当的个人防护装备（PPE）在内的各项预防措施。

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科研

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