Name: 从真核细胞蛋白质复合体串联亲和纯化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: 学习串联亲和纯化技术，从真核细胞中高效分离蛋白质复合体，用于生化表征和功能研究。该方法可鉴定新型相互作用蛋白及翻译后修饰，为细胞生物学研究提供高纯度样本。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本研究由美国国立卫生研究院（NIH）下属的国家过敏与传染病研究所（NIAID）资助，项目编号为 R01AI114362，以及 Welch 基金会授予 Iván D'Orso 的 I-1782 项目资助。

1. 细胞铺板
<ol>
	<li>转染前一天，将 3.5 × 106 个 HEK293T 细胞接种于每 100 mm 培养皿中，每皿加入 10 mL 添加了 10%（v/v）胎牛血清（FBS）和 1%（v/v）青霉素/链霉素（10,000 U/mL 储存液）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）。每次实验/条件需接种 3–5 个 100 mm 培养皿，以确保获得足够的蛋白产量。 
	&#8203;注意：所需培养皿数量需根据每个实验/条件的具体情况确定，取决于目标蛋白复合物的表达水平和溶解度。或者，若需要更大规模的纯化，可将细胞系适应于在旋转烧瓶中悬浮培养2，但该方法不适用于瞬时转染。</li>
</ol>
2. 转染细胞或诱导稳定细胞系&#160;
<ol>
	<li>次日，在显微镜下观察细胞。在继续操作前，细胞融合度必须达到 70 - 80%。</li>
	<li>每 100 mm 培养皿中，使用含有 7 µg 质粒 DNA 和 21 µl 转染试剂的总混合物对细胞进行转染。使用表达 GFP 的载体（表 1）作为转染效率的对照。 
	注意：若使用 HEK293-T-REx 或类似的稳定细胞系，该细胞系可在多西环素诱导下表达两个或多个复合亚基14,15，则需向细胞中加入诱导剂并孵育 48 小时。同样，为验证目的，也需要使用在加入诱导剂后可诱导表达 GFP 的稳定细胞系。然后进行步骤 2.7。</li>
	<li>为每 100 mm 培养皿配制转染混合液。取一个 1.5 ml 微量离心管，将 500 µl 未添加补充物的 DMEM 与 7 µg 总质粒 DNA（对应两个或多个质粒）混合。另取一个微量离心管，将 500 µl 未添加补充物的 DMEM 与 21 µl 转染试剂混合。每个转染反应均需重复此步骤。</li>
	<li>将转染试剂溶液加入质粒 DNA 溶液中（切勿以相反顺序混合）。通过移液至少吹打混合 4 次。</li>
	<li>室温孵育该混合物 10 - 15 分钟，但不得超过 15 分钟。</li>
	<li>倾斜培养皿以形成液体储区，小心地将转染混合物逐滴加至培养皿内壁，避免扰动细胞。将培养皿恢复至水平位置，轻轻摇晃以均匀分布混合液。</li>
	<li>将细胞置于 37 °C、含 5% CO2 的湿润化细胞培养箱中孵育（此条件在下文中统称为 &#34;tissue culture incubator&#34;）。转染后 5 小时更换培养基（可选）。</li>
</ol>
3. 检测转染或诱导效率
<ol>
	<li>转染后24小时，在荧光显微镜下观察细胞以检测转染效率（或检测表达GFP的对照HEK293T-REx稳定细胞系的诱导情况）。再孵育24小时。</li>
</ol>
4. STREP 亲和纯化（STREP AP）
<ol>
	<li>收集细胞
	<ol>
		<li>转染后48小时，弃去培养基，加入8 ml预冷的1×磷酸盐缓冲液（PBS）。用移液器吹打数次，使细胞从培养板上脱落。</li>
		<li>将细胞悬液收集并转移至15 mL离心管中，在4 °C、800 x g条件下离心4分钟。</li>
		<li>移除 PBS 上清液。再次离心（800 × g，4 °C，1 分钟）以彻底去除残留的 PBS。将细胞沉淀保存于 -80 °C，以备后续使用；或按照以下步骤继续进行蛋白质纯化。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>裂解细胞
	<ol>
		<li>使用被动裂解缓冲液（PLB：20 mM Tris-HCl pH 7.5，150 mM NaCl，1.5 mM MgCl₂）重悬细胞沉淀，缓冲液体积为细胞沉淀体积的5倍（每孔板约250 µl）。2，1 mM DTT，蛋白酶抑制剂混合物片剂，5% v/v 甘油，以及 1.0% NP-40），并将细胞悬液转移至 1.5 ml 微量离心管中。</li>
		<li>短暂涡旋混匀，4 °C 条件下振荡孵育 30 分钟。</li>
		<li>在 4 °C 条件下，以 10,000 × g 离心 10 分钟，沉淀细胞悬液。</li>
		<li>将可溶性裂解物转移至新的1.5 ml微量离心管中，弃去细胞沉淀。保留可溶性裂解物终体积的10%作为 &#34;STREP AP 输入&#34; 4 °C 下保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>平衡STREP磁珠 
	注意：第一步亲和纯化请使用STREP磁珠！使用STREP磁珠沉淀的复合物所回收的蛋白量显著高于使用FLAG磁珠沉淀的复合物。
	<ol>
		<li>取出 (n × 40 µl) + n µl 的 50% STREP 珠悬液（n = 样品数量），在 4 °C 下以 1,500 × g 离心 2 分钟。 
		注意：使用宽口吸头移取磁珠。</li>
		<li>移除上清液，向珠子中加入500 µl PLB。在4 °C下轻轻摇动珠子混合物5分钟。在4 °C下以1,500 x g离心2分钟。
		<ol>
			<li>重复洗涤共3次。将珠子重悬于PLB中，终体积为n × 40 µl。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>向每份细胞裂解液样品中加入40 µl 50% STREP磁珠悬液，4 °C下振荡孵育2小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>STREP AP
	<ol>
		<li>在 4 ˚C 下以 1,500 x g 离心 2 分钟。</li>
		<li>去除上清液并储存 &#34;STREP AP 流穿（FT）&#34; 在 4 °C 条件下。</li>
		<li>加入500 µl STREP AP Wash Buffer I（20 mM Tris-HCl pH 7.5, 250 mM NaCl, 1.5 mM MgCl₂）2，1 mM DTT，5% 甘油和 0.2% NP-40）加入珠子中。4 °C 下轻柔振荡孵育珠子混合物 5 分钟，然后在 4 °C 下以 1,500 × g 离心 2 分钟。弃去上清液。
		<ol>
			<li>重复上述步骤，共洗涤4次。 
			&#8203;注意：在第四次洗涤前，将珠子溶液转移至新的1.5 ml微量离心管中，以降低蛋白背景。此步骤至关重要。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>加入500 µl洗涤缓冲液II（100 mM Tris-HCl pH 8.0、150 mM NaCl和1 mM EDTA），通过倒置试管使磁珠充分平衡。在4 °C下以1,500 × g离心2分钟，弃去上清液。</li>
		<li>用50 µl STREP洗脱缓冲液（100 mM Tris-HCl pH 8.0、150 mM NaCl、1 mM EDTA和2.5 mM Desthiobiotin）洗脱目标蛋白。在4 °C下以800 rpm涡旋振荡15分钟。</li>
		<li>在 4 °C 条件下以 1,500 x g 离心 1 分钟，使磁珠沉淀。收集上清液。该组分对应于 &#34;STREP AP 洗脱&#34; 样品</li>
		<li>将珠子部分保存在 4 °C，用于第二次洗脱，第二次洗脱可能获得第一次洗脱所得蛋白量一半的蛋白。取 STREP AP 洗脱液的 10% 用于银染和/或 Western 印迹分析16.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>平衡 FLAG 琼脂糖珠
	<ol>
		<li>取出 (n × 16 µl) + n µl 的 FLAG beads 溶液（n = 样品数量），在 4 °C 下以 1,500 × g 离心 2 分钟。 
		&#8203;注意：使用宽口吸头移取珠子。</li>
		<li>移去上清液，向珠中加入500 µL FLAG洗涤缓冲液（100 mM Tris-HCl pH 8.0，150 mM NaCl，1 mM EDTA，0.1% NP-40）。在4 °C下以1,500 × g离心2分钟。重复洗涤共3次。</li>
		<li>用 FLAG 洗涤缓冲液重悬珠子，终体积为 n × 16 µl。</li>
		<li>向剩余的STREP亲和纯化洗脱液中加入16 µl FLAG磁珠悬液，4 °C下旋转孵育过夜。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. FLAG 免疫沉淀
<ol>
	<li>在4 °C下以1,500 × g离心FLAG磁珠悬液2分钟。保留上清液并作为 &#34;FLAG 免疫沉淀上清液&#34; (FT) 于 4 °C 条件下</li>
	<li>加入500 µl FLAG洗涤缓冲液至溶液中。在4 °C下振荡孵育5分钟，然后在4 °C下以1,500 x g离心2分钟。重复上述步骤，共洗涤4次，每次离心后弃去上清液。 
	注意：在第四次洗涤前，将蛋白-珠粒溶液转移至新的1.5 ml微量离心管中，以降低背景信号。此步骤至关重要。</li>
	<li>去除最后一次离心的上清液，向珠子中加入30 µL含有200 ng/µL FLAG肽的FLAG洗涤缓冲液。在4 °C下以800 rpm涡旋振荡2小时。</li>
	<li>在 4 °C 条件下以 1,500 x g 离心 2 分钟。收集上清液，并于 4 °C 保存作为 &#34;FLAG 免疫沉淀洗脱&#34; 
	注意：可使用标准方案通过银染和/或蛋白质印迹法对洗脱样品进行验证16，可用于后续的蛋白质检测。进行Western blot实验时，需上样以下所有样品：（1）STREP AP Input，（2）STREP AP FT，（3）STREP AP Elution，（4）FLAG IP FT，（5）FLAG IP Elution。上样体积需根据每个实验具体情况确定。所有收集的样品和磁珠可于4 °C短期保存，或于-80 °C长期保存。TAP样品可进一步通过质谱分析，以验证其组分身份、鉴定新的翻译后修饰（PTMs）和/或发现与纯化复合物发生的新蛋白相互作用。2,17为此，可在运行考马斯亮蓝染色胶或银染后，使用洁净的手术刀从凝胶中切下目标条带。此前已有多种优秀综述详细讨论了质谱分析方法18,19.</li>
</ol>

<ol><li>Sharan, R., Ulitsky, I., Shamir, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network-based+prediction+of+protein+function%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">Network-based prediction of protein function.</a> Mol Syst Biol. 3, 88-99 (2007).</li>
<li>Jager, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+landscape+of+HIV-human+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global landscape of HIV-human protein complexes.</a> Nature. 481, 365-370 (2012).</li>
<li>Fields, S., Song, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+genetic+system+to+detect+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A novel genetic system to detect protein-protein interactions.</a> Nature. 340, 245-246 (1989).</li>
<li>Luo, Y., Batalao, A., Zhou, H., Zhu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+two-hybrid+system%3A+a+complementary+approach+to+the+yeast+two-hybrid+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Mammalian two-hybrid system: a complementary approach to the yeast two-hybrid system.</a> Biotechniques. 22, 350-352 (1997).</li>
<li>Lee, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coimmunoprecipitation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Coimmunoprecipitation assay.</a> Methods Mol Biol. 362, 401-406 (2007).</li>
<li>Puig, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tandem+affinity+purification+%28TAP%29+method%3A+a+general+procedure+of+protein+complex+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification.</a> Methods. 24, 218-229 (2001).</li>
<li>Jager, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+HIV-human+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of HIV-human protein complexes.</a> Methods. 53, 13-19 (2011).</li>
<li>Price, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P-TEFb%2C+a+cyclin-dependent+kinase+controlling+elongation+by+RNA+polymerase+II%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">P-TEFb, a cyclin-dependent kinase controlling elongation by RNA polymerase II.</a> Mol Cell Biol. 20, 2629-2634 (2000).</li>
<li>Peterlin, B. M., Price, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+the+elongation+phase+of+transcription+with+P-TEFb%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Controlling the elongation phase of transcription with P-TEFb.</a> Mol Cell. 23, 297-305 (2006).</li>
<li>McNamara, R. P., McCann, J. L., Gudipaty, S. A., D'Orso, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factors+mediate+the+enzymatic+disassembly+of+promoter-bound+7SK+snRNP+to+locally+recruit+P-TEFb+for+transcription+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Transcription factors mediate the enzymatic disassembly of promoter-bound 7SK snRNP to locally recruit P-TEFb for transcription elongation.</a> Cell Rep. 5, 1256-1268 (2013).</li>
<li>Adelman, K., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promoter-proximal+pausing+of+RNA+polymerase+II%3A+emerging+roles+in+metazoans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Promoter-proximal pausing of RNA polymerase II: emerging roles in metazoans.</a> Nat Rev Genet. 13, 720-731 (2012).</li>
<li>D'Orso, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((7SKiing+on+chromatin%3A+move+globally%2C+act+locally%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">7SKiing on chromatin: move globally, act locally.</a> RNA Biol. 13, 545-553 (2016).</li>
<li>McNamara, R. P., Bacon, C. W., D'Orso, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+Elongation+Control+by+the+7SK+snRNP+Complex%3A+Releasing+the+Pause%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Transcription Elongation Control by the 7SK snRNP Complex: Releasing the Pause.</a> Cell Cycle. 15, 2115-2123 (2016).</li>
<li>Yao, F., Svensjo, T., Winkler, T., Lu, M., Eriksson, C., Eriksson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetracycline+repressor%2C+tetR%2C+rather+than+the+tetR-mammalian+cell+transcription+factor+fusion+derivatives%2C+regulates+inducible+gene+expression+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Tetracycline repressor, tetR, rather than the tetR-mammalian cell transcription factor fusion derivatives, regulates inducible gene expression in mammalian cells.</a> Hum Gene Ther. 9, 1939-1950 (1998).</li>
<li>McNamara, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KAP1+Recruitment+of+the+7SK+snRNP+Complex+to+Promoters+Enables+Transcription+Elongation+by+RNA+Polymerase+II%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">KAP1 Recruitment of the 7SK snRNP Complex to Promoters Enables Transcription Elongation by RNA Polymerase II.</a> Mol Cell. 61, 39-53 (2016).</li>
<li>Ausubel, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAusubel%2C+FM+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22">Current Protocols in Molecular Biology</a>. , Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience. New York. (1994).</li>
<li>Trudgian, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+evaluation+of+label-free+SINQ+normalized+spectral+index+quantitation+in+the+central+proteomics+facilities+pipeline%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Comparative evaluation of label-free SINQ normalized spectral index quantitation in the central proteomics facilities pipeline.</a> Proteomics. 11, 2790-2797 (2011).</li>
<li>Choudhary, C., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+signalling+networks+by+mass+spectrometry-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Decoding signalling networks by mass spectrometry-based proteomics.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 11, 427-439 (2010).</li>
<li>Bensimon, A., Heck, A. J., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+proteomics+and+network+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based proteomics and network biology.</a> Annu Rev Biochem. 81, 379-405 (2012).</li>
<li>Rogers, S., Wells, R., Rechsteiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+acid+sequences+common+to+rapidly+degraded+proteins%3A+the+PEST+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Amino acid sequences common to rapidly degraded proteins: the PEST hypothesis.</a> Science. 234, 364-368 (1986).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

此处所述的从真核细胞中表达和分离蛋白质复合物的方案不仅限于此类分子组装体的生化表征，还可用于鉴定可能调控其功能的新型相互作用蛋白及翻译后修饰。亲和标签的使用并不局限于本方案中提及的类型；但我们的经验表明，以STREP标签作为第一步亲和纯化（AP）步骤可显著提高最终蛋白质-蛋白质复合物的得率。与其它表位标签相比，STREP磁珠的结合与洗脱步骤均具有极高的效率。例如，FLAG）。此外，理论上，TAP 方法也可应用于其他蛋白质或结构域，仅需进行一些小的优化，例如缓冲条件、每实验所用培养板数量（适用于瞬时和稳定表达系统） 等等。 此外，如果特定蛋白质复合物需要特殊系统才能发挥功能，或与独特因子相互作用，TAP 方法也可应用于其他细胞系。为便于故障排查，强烈建议同时保存输入样品和穿流样品（FT 样品）。表2）。当洗脱液中无法观察到预期的蛋白条带时，可利用流穿组分（FT样品）排查实验问题，以确定样品是否已结合和/或从磁珠上洗脱。
成功的TAP严格依赖于高水平的蛋白质表达和回收率。因此，研究人员需要根据具体情况优化起始材料的用...

蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）对于生物过程的精确调控至关重要1，对这些蛋白质相互作用的进一步研究有助于阐明其功能2已设计出多种方法用于蛋白质相互作用（PPIs）的研究与表征，以及 从头合成 鉴定新的调控蛋白组分。1989年，Stanley Fields 及其同事报道了酵母双杂交（Y2H）实验3该方法可对特定目标蛋白（诱饵）的相互作用分子（猎物）进行无偏倚且全面的鉴定 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 除了在发现蛋白质相互作用（PPIs）方面具有显著效用外，酵母双杂交（Y2H）实验还可用于在酵母细胞中表征蛋白质配对、界定最小相互作用结构域，以及鉴定破坏此类相互作用的突变。通过改进Y2H实验，也可在哺乳动物细胞中研究蛋白质相互作用。4. Y2H 实验的变体（例如酵母三杂交系统也可用于研究细胞内蛋白质-RNA以及蛋白质-小分子有机配体的相互作用。
另一种在同源系统中研究蛋白质相互作用（PPIs）的常用工具是共免疫沉淀（co-IP）实验5通过使用抗体对目标蛋白进行免疫沉淀，共免疫沉淀（co-IP）实验使研究人员能够在不同环境条件和实验情况下监测细胞内的蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）。利用表位标签蛋白（例如，FLAG、Myc、STREP 和 HA 等标签在亲和纯化（AP）方法中的应用，已促进从复杂的蛋白质混合物中分离蛋白质，用于多种下游检测，包括蛋白质印迹、银染及酶学分析。然而，这些既往方法均无法实现大量蛋白质复合物的分离，以用于进一步的表征分析 体外 检测、通过质谱法发现调节亚基以及翻译后修饰的鉴定。AP方法的一种改进版本称为串联亲和纯化（Tandem AP，TAP），该技术通过构建含有两个表位标签的融合蛋白，并依次进行两次亲和纯化，用于研究蛋白质相互作用。6,7在本文中，我们介绍了一种改良的TAP方法，用于纯化蛋白质复合物，该方法对两个亚基分别标记不同的表位标签，并通过两次连续的亲和纯化（先进行STREP亲和纯化，再进行FLAG免疫沉淀）完成纯化。我们首先对TAP方法进行简要概述。图1）然后详细描述所有实验步骤（图2），以便研究人员能将其应用于目标蛋白质复合物。
为了验证TAP方法的适用性，我们选择了一个特征明确的周期蛋白-CDK复合物（称为P-TEFb激酶），该复合物由调节亚基周期蛋白T1（CycT1）和激酶CDK9组成，参与RNA聚合酶II（Pol II）转录过程的调控8,9,10。P-TEFb可磷酸化Pol II的C末端结构域及其相关的负延伸因子，从而解除启动子处的转录暂停，促进转录延伸11,12,13。基于这一已知的相互作用，我们在HEK293T细胞中过表达带有STREP标签的CycT1和带有FLAG标签的CDK9。为进一步验证蛋白相互作用与所用表位标签无关，还进行了反向TAP实验，即使用带有STREP标签的CDK9和带有FLAG标签的CycT1。转染48小时后收集细胞并进行裂解。将可溶性裂解液通过TAP（先STREP亲和纯化，再FLAG免疫沉淀）进行纯化。输入样品及纯化后的蛋白通过Western印迹和银染分析（图3）。

<table><tbody><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）</td><td>GE Healthcare Life Sciences/Hyclone</td><td>SH3002.2FS</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>GE Healthcare Life Sciences/Hyclone</td><td>SH30071</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>MP Biomedicals</td><td>MP091670049</td><td></td></tr><tr><td>PolyJet</td><td>SignaGen Laboratories</td><td>SL100688</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合物&amp;nbsp;</td><td>Roche&amp;nbsp;</td><td>11836153001</td><td></td></tr><tr><td>STREP-Tactin Superflow</td><td>IBA Lifesciences</td><td>2-1208-010</td><td></td></tr><tr><td>STREP-tag 洗脱缓冲液</td><td>IBA Lifesciences</td><td>2-1000-025</td><td></td></tr><tr><td>EZview Red ANTI-FLAG M2 亲和凝胶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2426</td><td></td></tr><tr><td>Corning 100 mm &amp;times; 20 mm 培养皿，细胞培养处理，无热原聚苯乙烯，20/袖套</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>Protein Lo-Bind Eppendorf 管</td><td>Eppendorf</td><td>022431081</td><td></td></tr><tr><td>数字涡旋混合器</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>02-215-370</td><td></td></tr><tr><td>48 孔微量离心管泡沫架</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-215-386</td><td></td></tr><tr><td>Labquake 摇床旋转器&amp;nbsp;</td><td>Thermo&amp;nbsp;</td><td>415110</td><td></td></tr></tbody></table>

从真核细胞中对蛋白质复合物进行串联亲和纯化

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

活性蛋白质-蛋白质复合物及蛋白质-核酸复合物的纯化对于酶活性的表征以及新亚基和翻译后修饰的从头鉴定至关重要。de novo 细菌系统可用于表达和纯化多种单一多肽和蛋白质复合物。然而，该系统无法纯化含有翻译后修饰（例如，磷酸化和乙酰化）的蛋白质亚基，也无法鉴定仅在真核系统中存在或表达的新型调控亚基。本文详细介绍了一种新颖、稳健且高效的串联亲和纯化（TAP）方法，该方法利用STREP标签和FLAG标签蛋白，可从真核细胞中纯化瞬时或稳定表达的表位标签蛋白所形成的蛋白质复合物。本方案可用于表征蛋白质复合物的功能、发现复合物亚基上的翻译后修饰，并通过质谱技术鉴定新型调控复合物组分。值得注意的是，该TAP方法可用于研究由真核或病原体（病毒和细菌）组分形成的蛋白质复合物，从而为下游实验提供广泛的可能性。我们建议从事蛋白质复合物研究的研究人员可多方面应用此方法。

本文中，我们展示了TAP方法在已充分表征的CycT1-CDK9复合物（也称为P-TEFb激酶）中的适用性。
将编码Cyclin T1-STREP（CycT1:S）和CDK9-FLAG（CDK9:F），或CDK9-STREP（CDK9:S）和Cyclin T1-FLAG（CycT1:F）的质粒（表1）转染至HEK293T细胞中。阴性对照包括空载体以及CDK9:F或CycT1:F质粒的转染（分别见图3A和图3B）。蛋白表达48小时后收集细胞。每个实验使用多块培养板的细胞（本研究所示数据中每样本使用五块培养板，见图3），以提高蛋白产量和回收率。细胞在各自的微量离心管中裂解后，将同一样本的细胞裂解液合并至一个微量离心管中，再加入STREP磁珠。将蛋白样本与一份磁珠结合可提高最终蛋白浓度，有助于提高难表达蛋白的回收效率。初次洗脱...

本文介绍一种新颖、稳健且高效的串联亲和纯化（TAP）方法，用于从真核细胞中表达、分离和表征蛋白质复合物。该方案可用于对特定复合物进行生物化学表征，以及鉴定调控其功能的新型相互作用蛋白和翻译后修饰。

活性蛋白质-蛋白质复合物及蛋白质-核酸复合物的纯化对于酶活性的表征以及从头测序……至关重要

该串联亲和纯化方法的总体目标是从真核细胞中分离表达的蛋白质复合物，用于生化表征、分子组装，并鉴定调控其功能的新型相互作用蛋白和翻译后修饰。该方法能够从真核细胞中纯化完整的蛋白质复合物，以鉴定新的相互作用蛋白以及精细调控其功能的调控性翻译后修饰。该技术的主要优势在于，可获得高纯度和高得率的蛋白质复合物，适用于后续体外实验，以研究其功能与活性。转染后48小时，从STREP亲和纯化中收集细胞。移除培养基，加入8毫升冷的PBS，用移液器吹打数次，使细胞从培养板上脱落。收集细胞悬液并转移至15毫升离心管中，在4摄氏度下以800 × g离心4分钟。弃去PBS上清液。在4摄氏度下以800 × g再次离心1分钟，以彻底去除残留的PBS。开始此操作时，用五倍于细胞沉淀体积的被动裂解缓冲液（PLB）重悬每个细胞沉淀。将细胞悬液转移至1.5毫升微量离心管中。短暂涡旋振荡悬液，并在4°C下旋转孵育30分钟。在4 °C条件下，以10,000 × g离心10分钟，使细胞悬液沉淀。将上清裂解液转移至新的1.5 mL微量离心管中，并弃去细胞沉淀。保留上清裂解液终体积的10%作为STREP-AP输入样品，并于4 °C保存。第一步亲和纯化必须使用STREP磁珠，因为使用STREP磁珠捕获的复合物所回收的蛋白量显著高于使用FLAG磁珠捕获的复合物。使用宽口移液器吸头吸取适量的50% STREP磁珠悬液用于亲和纯化。在4°C条件下，以1,500 × g离心2分钟。移除上清液，并向珠子中加入 500 微升的 PLB。在 4 摄氏度下轻轻摇动珠子混合物 5 分钟。再次离心。第三次洗涤后，弃去上清液，并将磁珠重悬于 PLB 中，终体积为 n 乘以 40 微升，其中 n 为样品数量。向每份细胞裂解液样品中加入 40 微升 50% STREP 磁珠悬液，在 4 摄氏度下轻轻旋转孵育两小时。在此蛋白质表达与回收过程中，可使用多块细胞培养板，且来自不同培养板的相同蛋白样品可在 STREP 亲和纯化过程中合并后与一份磁珠共同孵育。细胞裂解液与STREP磁珠悬液混合物孵育两小时后，在4°C条件下以1,500 × g离心两分钟。保留上清液作为STREP AP穿流液，并于4°C保存。向磁珠中加入500 µL STREP AP洗涤缓冲液一。将磁珠在缓冲液混合物中于4°C轻轻振荡孵育5分钟，然后在4°C下以1,500 × g离心2分钟。弃去上清液，并用500 µL STREP AP洗涤缓冲液1洗涤一次。第三次洗涤后，将磁珠溶液转移至新的1.5 mL微量离心管中，以降低蛋白背景。使用 STREP AP 洗涤缓冲液一进行第四次洗涤。离心后，移去上清液，并加入 500 微升的洗涤缓冲液二。通过倒置试管使磁珠平衡，然后在 4 摄氏度下以 1,500 × g 离心两分钟。弃去上清液。用50微升STREP洗脱缓冲液洗脱目标蛋白。在4摄氏度下以800转/分钟涡旋振荡15分钟。在4 °C条件下，以1,500 × g离心1分钟，使磁珠沉淀。收集上清液。此组分对应于STREP亲和纯化洗脱样品。将珠子组分保存在 4°C 下用于第二次洗脱。取 10% 的 STREP 亲和纯化洗脱液用于银染和/或 Western 印迹分析。为了增加后续 FLAG 免疫沉淀的起始材料量，可将第一次和第二次 STREP 洗脱液合并，以更高效地回收 FLAG 洗脱产物。使用宽口移液器吸头将适量的FLAG磁珠溶液转移至微量离心管中，开始此操作。在4°C下以1,500 × g离心2分钟。弃去上清液，并向磁珠中加入500 µL的FLAG洗涤缓冲液。在4°C、1,500 × g条件下离心2分钟。弃去上清液，并用FLAG洗涤缓冲液再次洗涤。第三次洗涤后，移除上清液，将磁珠重悬于FLAG洗涤缓冲液中，终体积为n × 16微升，其中n为样品数量。向剩余的STREP亲和纯化洗脱液中加入16 µL FLAG磁珠悬浊液，并在4°C下轻柔旋转孵育过夜。在FLAG磁珠悬浊液与STREP亲和纯化洗脱液过夜孵育后，进行FLAG免疫沉淀实验。于4°C下以1,500 × g离心2分钟，使FLAG磁珠沉淀。将上清液保存为 FLAG 免疫沉淀的穿流液，并在 4 °C 下保存。向琼脂糖珠中加入 500 µL FLAG 洗涤缓冲液。在 4 °C 下轻轻摇动孵育 5 分钟，然后在 4 °C 下以 1,500 ×g 离心 2 分钟。弃去上清液，再用500微升FLAG洗涤缓冲液洗涤一次。第三次洗涤后，将蛋白珠溶液转移至新的1.5毫升微量离心管中以降低背景。用FLAG洗涤缓冲液进行第四次洗涤。从最后一次离心的上清液中去除液体，并向珠粒中加入30微升含有200纳克/微升FLAG肽的FLAG洗涤缓冲液。在4°C下以800转/分钟涡旋振荡两小时。两小时后，在4°C下以1,500 × g离心两分钟，使悬浮液沉淀。收集上清液，并于4摄氏度保存，作为FLAG免疫沉淀洗脱液。在本视频中，串联亲和纯化（TAP）方法被应用于Cyclin-T1 CDK9复合物。STREP标记的Cyclin-T1和FLAG标记的CDK9在HEK293 T细胞中过表达。还进行了反向实验，使用STREP标记的CDK9和FLAG标记的Cyclin-T1。Western印迹分析显示，FLAG标记的CDK9与STREP标记的Cyclin-T1一同从STREP磁珠中洗脱出来，但在阴性对照（缺乏STREP标记的Cyclin-T1的AP）中未检测到。两种蛋白均在FLAG洗脱组分中被检测到，进一步证实了复合物的形成。反向TAP实验结果表明，FLAG标记的Cyclin-T1与STREP标记的CDK9共洗脱，进一步验证了Cyclin-T1与CDK9的相互作用与所使用的表位标签无关。TAP及反向TAP实验结果亦通过银染进行分析。星号表示共洗脱的杂质。FLAG标记的CDK9与STREP标记的Cyclin-T1一同从STREP磁珠中共同洗脱，而不会从对照AP中洗脱。在后续的FLAG洗脱步骤中，STREP标记的Cyclin-T1与FLAG标记的CDK9一同从FLAG磁珠中共同洗脱。类似地，FLAG标记的Cyclin-T1与STREP标记的CDK9一同从STREP磁珠中共同洗脱，而不会从对照AP中洗脱。该蛋白-蛋白复合物在第二次FLAG免疫沉淀步骤后可被高效回收。若操作得当，在细胞准备收集后，掌握该技术者可在两天内完成整个实验。在进行该实验操作时，重要的是要相应增加每个实验所用的细胞培养板数量，以确保能够回收并检测到足够的蛋白。例如，用于鉴定新的调节亚基和/或研究复合物亚基上的翻译后修饰。该技术建立后，为研究真核细胞中蛋白质相互作用的研究人员探索新的相互作用蛋白及翻译后修饰开辟了道路。观看本视频后，您应能充分掌握如何利用STREP标签和FLAG标签进行蛋白质的分离与表征。

tandem-affinity-purification-protein-complexes-from-eukaryotic

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

从真核细胞蛋白质复合体串联亲和纯化

串联亲和纯化是一种用于鉴定蛋白质结合伴侣的可靠方法。作为概念验证，该方法已应用于研究较为深入的翻译起始因子...

使用串联亲和纯化鉴定蛋白质相互作用伙伴

结合质谱技术的标签蛋白亲和纯化（APMS）是一种强大的方法，可用于系统性绘制蛋白质相互作用网络，并研究生物过程的分子机制基础。本文中，我们描述了一种为大肠杆菌（Escherichia...

蛋白质复合物的鉴定 大肠杆菌 使用连续肽亲和纯化与串联质谱联用技术

本视频展示了串联亲和纯化技术——一种用于从真核细胞中纯化蛋白质复合物以研究蛋白质-蛋白质相互作用的方法。该复合物包含两种带有不同表位标签的蛋白质。通过依次使用两种对不同标签具有亲和力的树脂纯化该复合物后，若在洗脱液中同时检测到这两种蛋白质，则可证实二者之间存在相互作用。...

串联亲和纯化实验用于研究蛋白质-蛋白质相互作用

蛋白质复合物催化细胞内的关键功能。对许多重要复合物进行详细的功能和结构表征需要通过重组表达来实现。MultiBac 是一种杆状病毒/昆虫细胞表达系统，专为表达真核蛋白及其复合物而设计。MultiBac...

欧洲分子生物学实验室的 MultiBac 蛋白复合物生产平台

鉴定蛋白质-蛋白质相互作用 果蝇 通过串联亲和纯化（TAP）法纯化成年果蝇头部蛋白复合物

串联亲和纯化（TAP）方法已广泛用于从细胞提取物（主要是真核细胞）中分离天然复合物，以进行蛋白质组学研究。本文介绍了一种经过优化的TAP方法实验方案，适用于为结构研究纯化天然复合物。...

使用串联亲和标签法纯化用于结构研究的天然复合物

本文描述了在低温条件下通过固态研磨破碎哺乳动物细胞，从所得细胞粉末制备细胞提取物，并利用抗体偶联的微米级顺磁性珠进行亲和捕获以分离目标蛋白复合物的实验方案。...

从冷冻研磨的哺乳动物细胞中进行蛋白质复合物亲和捕获

本文介绍了蛋白质复合物的亲和纯化及其通过蓝色天然PAGE分离的实验方案，随后采用无标记定量质谱技术进行蛋白质相关性分析。该方法有助于将相互作用组解析为不同的蛋白质复合物。...

通过蓝色天然PAGE和蛋白质相关性分析解析亲和纯化蛋白质复合物

蛋白质-蛋白质相互作用以及蛋白质-代谢物相互作用对所有细胞功能至关重要。本文介绍了一种可对目标蛋白质的这些相互作用进行并行分析的实验方案。该方案针对植物细胞培养体系进行了优化，结合了亲和纯化与基于质谱的蛋白质及代谢物检测技术。...

一步亲和纯化并行分析蛋白质-蛋白质与蛋白质-代谢物复合物的2合1方法

本文介绍了一种经过验证的纯化叶绿体蛋白导入复合物（TOC-TIC复合物）的实验方案，该方法利用TAP标签进行一步亲和纯化。该一步亲和分离方案原则上可适用于任何蛋白，并可用于通过质谱技术鉴定新的相互作用蛋白伙伴。...

使用TAP标签亲和纯化叶绿体转运子蛋白复合物

本文提供了一种人源重组蛋白 flap 内切酶 1（FEN1）的亲和纯化方法，该蛋白带有...

使用快速蛋白液相色谱系统亲和纯化6X-His标签蛋白

学习串联亲和纯化技术，从真核细胞中高效分离蛋白质复合体，用于生化表征和功能研究。该方法可鉴定新型相互作用蛋白及翻译后修饰，为细胞生物学研究提供高纯度样本。

从真核细胞中对蛋白质复合物进行串联亲和纯化

探索更多视频