从真核细胞蛋白质复合体串联亲和纯化
2017年1月26日
我们在这里描述了一种新颖、稳健且高效的串联亲和纯化 （TAP） 方法，用于表达、分离和表征真核细胞中的蛋白质复合物。该方案可用于离散复合物的生化表征以及鉴定调节其功能的新型相互作用物和翻译后修饰。
这种串联亲和纯化方法的总体目标是分离真核细胞表达的蛋白质复合物，用于生化表征和分子组装，并鉴定调节其功能的新型相互作用子和翻译后修饰。该方法可以从真核细胞中纯化完整的蛋白质复合物，以识别微调其功能的新型相互作用子和调节性翻译后修饰。该技术的主要优点是它允许为下游体外应用提供高纯度和高产量的蛋白质复合物，以研究其功能和活性。
转染后 48 小时从 STREP 亲和纯化中收集细胞。去除培养基并加入 8 毫升冷 PBS。上下移液以将细胞从板中分离。
收集细胞悬液并将其转移到 15 mL 试管中，并在 4 摄氏度下以 800 倍 g 的速度离心细胞 4 分钟。去除 PBS 上清液。在 4 摄氏度下以 800 倍 g 离心 1 分钟，以去除任何残留的 PBS。
要开始此程序，请将每个细胞沉淀重悬于被动裂解缓冲液 （PLB） 细胞沉淀体积的 5 倍中。将细胞悬液转移至 1.5 mL 微量离心管中。短暂涡旋悬浮液，并在 4 摄氏度下章动 30 分钟。
在 4 摄氏度下以 10， 000 倍 g 的速度离心细胞悬液 10 分钟。将可溶性裂解物转移到新的 1.5 mL 微量离心管中，丢弃细胞沉淀。将可溶性裂解物最终体积的 10% 保存为 STREP-AP 输入，并将其储存在 4 摄氏度下。
在第一个亲和纯化步骤中使用 STREP 微珠非常重要，因为用 STREP 微珠拉下的复合物比用 FLAG 微珠拉低的复合物回收的蛋白质要多得多。使用广口移液器吸头去除适量的 50%STREP 珠浆用于亲和纯化。在 4 摄氏度下以 1， 500 倍 g 的速度旋转 2 分钟。
去除上清液，向珠子中加入 500 μL PLB。在 4 摄氏度下对珠子混合物进行章动 5 分钟。再次旋转。
第三次洗涤后，去除上清液，将珠子重悬于 PLB 中，最终体积为 n 乘以 40 微升，其中 n 是样品数。向每个细胞裂解物样品中加入 40 μL 50%STREP 珠浆，并在 4 摄氏度下进行章动 2 小时。在蛋白质生产和回收过程中，可以使用多个细胞板，并且在 STREP 亲和纯化过程中，可以从不同板裂解的相同蛋白质样品与一份磁珠混合。
细胞裂解物和 STREP 微珠浆液混合物孵育 2 小时后，在 4 摄氏度下以 1， 500 倍 g 的速度离心 2 分钟。将上清液保存为 STREP AP 流过并储存在 4 摄氏度。向珠子中加入 500 μL STREP AP 洗涤缓冲液 1。
在 4 摄氏度下将微珠在缓冲混合物中章动 5 分钟，然后在 4 摄氏度下以 1， 500 倍 g 离心 2 分钟。弃去上清液，用 500 微升 STREP AP 洗涤缓冲液 1 再次洗涤。第三次洗涤后，将微珠溶液转移到新的 1.5 mL 微量离心管中，以降低蛋白质背景。
用 STREP AP 洗涤缓冲液 1 洗涤第四次。脱水后，去除上清液，加入 500 微升洗涤黄油 2。通过倒置试管来平衡微珠，然后在 4 摄氏度下以 1， 500 倍 g 的速度离心 2 分钟。
丢弃上清液。用 50 μL STREP 洗脱缓冲液洗脱目标蛋白。在 4 摄氏度下以 800 rpm 的速度涡旋 15 分钟。
在 4 摄氏度下以 1， 500 倍 g 的速度旋转珠子 1 分钟。收集上清液。该馏分对应于 STREP AP 洗脱样品。
将珠子组分保存在 4 摄氏度下以进行第二次洗脱。分装 10% 的 STREP AP 洗脱液，用于银染和/或蛋白质印迹。为了增加后续 FLAG 免疫沉淀的起始材料量，可以将第一次和第二次 STREP 洗脱液混合在一起，以便更高效地回收 FLAG 洗脱液。
使用宽口移液器吸头将适量的 FLAG 珠溶液转移到微量离心管中，开始此过程。在 4 摄氏度下以 1， 500 倍 g 的速度旋转 2 分钟。去除上清液，向珠子中加入 500 μL FLAG 洗涤缓冲液。
在4 摄氏度下以 1， 500 倍 g 的速度旋转 2 分钟。弃去上清液，再次用 FLAG 洗涤缓冲液洗涤。第三次洗涤后，去除上清液，将珠子重悬于 FLAG 洗涤缓冲液中，最终体积为 n 乘以 16 μL，其中 n 是样品数。
将 16 μL FLAG 珠浆液添加到剩余的 STREP AP 洗脱液中，并在 4 摄氏度下进行章动过夜。在 FLAG 微珠浆液和 STREP AP 洗脱液孵育过夜后，进行 FLAG 免疫沉淀。在 4 摄氏度下以 1， 500 倍 g 的速度旋转 FLAG 微珠悬浮液 2 分钟。
将上清液保存为 FLAG IP 流过并储存在 4 摄氏度。向珠子中加入 500 μL FLAG 洗涤缓冲液。在 4 摄氏度下章动 5 分钟，然后在 4 摄氏度下以 1， 500 倍 g 离心 2 分钟。
弃去上清液，用 500 μL FLAG 洗涤缓冲液再次洗涤。第三次洗涤后，将蛋白珠溶液转移到新的 1.5 mL 微量离心管中，以减少背景。用 FLAG 洗涤缓冲液洗涤第四次。
从最后一次离心中取出上清液，向珠子中加入 30 微升 FLAG 洗涤缓冲液，每微升 FLAG 肽含有 200 纳克。在 4 摄氏度下以 800 rpm 的速度涡旋 2 小时。2 小时后，在 4 摄氏度下以 1， 500 g 的浓度离心悬浮液 2 分钟。
收获上清液并在 4 摄氏度下储存为 FLAG IP 洗脱液。在本视频中，将 Tandem 亲和纯化或 TAP 方法应用于 Cyclin-T1 CDK9 复合物。STREP 标记的 Cyclin-T1 和 FLAG 标记的 CKD9 在 HEK293 T 细胞中过表达。
还使用 STREP 标记的 CDK9 和 FLAG 标记的 Cyclin-T1 进行了互惠实验。Western blot 分析显示，FLAG 标记的 CKD9 与 STREP 珠中标记的 Cyclin-T1 共洗脱，但在阴性对照中未洗脱，AP 缺乏 STREP 标记的 Cyclin-T1。在 FLAG 洗脱中检测到两种蛋白质，这进一步证实了复合物的形成。
倒数 TAP 结果显示，FLAG 标记的 Cyclin-T1 与 STREP 标记的 CDK9 共洗脱，进一步验证了 Cyclin-T1 CDK9 相互作用与所使用的表位无关。TAP 和倒数 TAP 的结果也通过银染分析。星号表示共洗脱的杂质。
FLAG 标记的 CKD9 与 STREP 磁珠上标记的 STREP 细胞周期蛋白-T1 共洗脱，但不从对照 AP.In 随后的 FLAG 磁珠上洗脱，STREP 标记的 Cyclin-T1 与 FLAG 磁珠上标记的 CDK9 共洗脱。同样，FLAG 标记的 Cyclin-T1 与 STREP 磁珠上标记的 CDK9 共洗脱，但不是来自对照 AP。在第二个 FLAG IP 步骤后，蛋白质-蛋白质复合物被有效回收。一旦掌握，这项技术可以在两天内完成，如果作得当，从准备好收集细胞开始。
在尝试此过程时，重要的是要记住相应地增加每个实验的细胞板数量，以确保可以回收和检测足够的蛋白质。例如，鉴定新的调节亚基和/或研究复杂亚基的翻译后修饰。开发后，这项技术为研究蛋白质-蛋白质相互作用的研究人员探索真核细胞中新的相互作用物和翻译后修饰铺平了道路。
观看此视频后，您应该对如何使用 STREP 和 FLAG 标签分离和表征蛋白质有很好的了解。
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概述
本文介绍了一种新型串联亲和纯化（TAP）方法，旨在从真核细胞中高效分离和表征蛋白质复合物。该方法能够识别新型相互作用物和影响蛋白质功能的翻译后修饰。
关键研究组成部分
科学领域
- 生物化学
- 细胞生物学
- 蛋白质相互作用
背景
- 串联亲和纯化是一种用于分离蛋白质复合物的技术。
- 了解蛋白质相互作用对阐明细胞功能至关重要。
- 翻译后修饰在调节蛋白质活性中起着重要作用。
- 该方法提高了蛋白质复合物的纯度和产量，以便进行进一步分析。
研究目的
- 开发一种用于蛋白质复合物分离的稳健的TAP方法。
- 促进蛋白质复合物的生化表征。
- 识别新型相互作用物和调节修饰。
使用的方法
- 从真核细胞中分离蛋白质复合物。
- 在转染后48小时使用STREP亲和纯化。
- 使用冷PBS脱离细胞。
- 进行下游体外应用以研究蛋白质功能。
主要结果
- 实现了高纯度和高产量的分离蛋白质复合物。
- 促进了新型相互作用物的识别。
- 表征了调节蛋白质功能的翻译后修饰。
- 该方法在生化表征方面被证明是有效的。
结论
- TAP方法是研究蛋白质复合物的有价值工具。
- 它允许识别关键的调节相互作用。
- 这种方法可以增强我们对蛋白质功能和活性的理解。
常见问题
Executive Industry Relevance
Tandem affinity purification (TAP) using STREP- and FLAG-tagged proteins enables high-purity isolation of eukaryotic protein complexes, supporting target validation and mechanistic de-risking in early discovery. The method facilitates identification of novel interactors and post-translational modifications, improving predictive confidence in protein function and complex assembly. This approach reduces biological ambiguity in target selection and supports scalable workflows for lead identification and preclinical characterization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating intact protein complexes from eukaryotic cells for functional characterization.
- Operational Value: Supports biological de-risking through high-yield purification of complexes containing transiently expressed regulatory subunits.
- Predictive Value: Enhances target confidence by enabling detection of co-purifying interactors and regulatory modifications via mass spectrometry.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated eukaryotic protein complexes for downstream biochemical assays measuring enzymatic activity or binding kinetics.
- Operational Value: Enables assay standardization through reproducible isolation of complexes with defined subunit composition and modification status.
- Scalability: Supports platform reuse across multiple targets by combining lysates from different cell plates during STREP bead incubation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Characterizes disease-relevant protein complexes formed by eukaryotic or pathogenic components, enabling mechanistic insight into host-pathogen interactions.
- Operational Value: Provides continuity from discovery through preclinical validation by generating complexes suitable for structural and functional studies.
- Risk Mitigation: Informs risk-adjusted advancement decisions by identifying novel regulatory subunits and post-translational modifications that fine-tune complex function.
Pipeline & Workflow Integration
The TAP method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing through lead identification, enabling biochemical characterization of protein complexes prior to compound screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by isolating complexes to identify novel interactors and regulatory post-translational modifications.
- Screening: Enables assay readiness by producing purified complexes suitable for in vitro activity and binding assays.
- Analytics: Generates quantitative outputs via mass spectrometry and Western blot analysis to compare complex composition under different conditions.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical continuity by characterizing complexes from eukaryotic or pathogenic systems for mechanistic de-risking.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability for multiple targets, as the same STREP and FLAG bead workflow can be applied across different epitope-tagged constructs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity, and identification of novel regulatory mechanisms.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of protein complex isolation across multiple experimental conditions.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions through improved target validation, capital efficiency in early discovery, and reduced late-stage biological failure risk.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of targets based on validated complex composition and modification status.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, eukaryotic cell culture, and affinity purification techniques.
- Depends on access to centrifugation equipment, microcentrifuge tubes, and STREP and FLAG affinity resins.
- Necessitates cross-team standardization of tag placement, lysis buffer composition, and wash stringency for reproducible results.
- Requires adaptation considerations when applying to different eukaryotic cell lines or pathogenic protein expression systems.
- Practical limitation: Efficiency depends on transfection efficiency and expression levels of epitope-tagged constructs in eukaryotic cells.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:52
Collecting the Cells
1:39
Lysing the Cells
6:01
Equilibrating the FLAG Beads
2:32
Equilibrating the STREP Beads
3:56
STREP Affinity Purification (AP)
7:04
FLAG Immunoprecipitation (IP)
8:39
Results: A Cyclin-CDK Complex is Successfully Purified by Tandem Affinity Purification (TAP)
10:26
Conclusion
