Name: 鞭毛马达功能的生物物理表征 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 8 s
Description: 探索鞭毛马达功能的生物物理表征方法，利用实时追踪探针微球技术测量大肠杆菌活体细胞中单个鞭毛马达的旋转行为。该技术可实时区分有效与无效数据，为机械生物学研究提供高精度分子马达行为分析手段，并可推广应用于其他鞭毛细菌物种。

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作者感谢Howard Berg提供了珠追踪显微镜/光电倍增管以及德克萨斯A&amp;M 工程实验站提供资金支持。

1. 细胞准备
<ol>
	<li>在胰蛋白胨肉汤（TB，1% 胰蛋白胨，0.5% NaCl）中培养携带黏性 fliC 等位基因15,22的目标菌株过夜，随后以1:100的比例接种至10 mL新鲜TB培养基中。在摇床培养箱中于33 °C培养至OD600 = 0.5。</li>
	<li>在1,500 × g离心5–7分钟收集菌体，然后将沉淀剧烈重悬于10 mL滤膜灭菌的运动缓冲液（MB；10 mM磷酸缓冲液：0.05–0.06 M NaCl，10−4 M EDTA，1 µM甲硫氨酸，pH 7.0）中。</li>
	<li>重复步骤1.2两次，最后将菌体沉淀重悬于1 mL MB中。</li>
	<li>将菌悬液通过聚乙烯管（7–12 cm长，内径0.58 mm）连接的21至23号针头适配器在两个注射器之间来回推注约75次进行剪切。剪切总时间应控制在30–45秒内。</li>
	<li>将剪切后的菌液在1,500 × g离心5–7分钟，然后将沉淀重悬于100–500 µL MB中。</li>
</ol>
2. 载玻片制备
<ol>
	<li>通过将两层双面胶带夹在盖玻片和载玻片之间制备成像室。对于趋化性实验，可使用任何能够交换MB和化学刺激物的微流控室。</li>
	<li>向腔室内加入0.01%的聚-L-赖氨酸溶液，5分钟后用MB（80 - 100 µL）轻轻冲洗表面。</li>
	<li>向腔室内加入40 µL细胞悬液，并留出足够时间使其附着于玻璃表面（7 - 8分钟）。从腔室一侧加入100 µL MB，同时从另一侧用滤纸吸液，以去除未贴壁的细胞。</li>
	<li>向腔室内加入10 - 15 µL乳胶微球，并留出足够时间使其沉降并附着于细胞（7 - 8分钟）。如步骤2.3所述，用100 µL MB轻轻冲洗以去除未贴附的微球。实验中可使用不同粒径的微球，只要能获得良好的对比度即可。</li>
</ol>
3. 微珠追踪
<ol>
	<li>将样品置于显微镜载物台上，扫描表面以寻找附着在马达上的微珠。可使用40倍相差物镜进行观察，但并非必须使用相差显微镜。也可采用明场成像，只要能保持足够的对比度，清晰区分暗背景下明亮的微珠即可。</li>
	<li>选定微珠后，横向移动载物台，将微珠定位至预先确定的角落，如图1B所示。将所有微珠置于同一角落，以确保正确判断微珠旋转方向。理想的微珠轨迹近似为圆形，但椭圆形轨迹也可接受。</li>
	<li>保持采样频率高于马达旋转频率的两倍，以避免混叠效应引起的误差。本研究中使用旋转频率为50 Hz的马达，并以10倍于该频率（即500 Hz）进行采样，以获得平滑的信号。</li>
</ol>
4. 数据分析
<ol>
	<li>对 PMT 输出电压进行居中和缩放，并在必要时通过仿射变换校正轨迹中的椭圆率23。使用功率谱分析确定旋转速率17。</li>
	<li>确定极角 θ(t) = atan(y(t)/x(t))。通过计算角速度 ω <img alt="角速度公式 dθ/dt，用于旋转运动分析。" src="/files/ftp_upload/55240/55240eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 1"> 来分析电机转速随时间的变化及切换行为14。</li>
	<li>采用中值滤波器对电机转速数据进行平滑处理。建议滤波窗口覆盖两次完整旋转的时间23,24。</li>
</ol>

<ol><li>Emody, L., Kerenyi, M., Nagy, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulence+factors+of+uropathogenic+Echerichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Antimicrob.+Ag%22%5BJournal%5D)">Virulence factors of uropathogenic Echerichia coli.</a> Int J Antimicrob. Ag. 22, 29-33 (2003).</li>
<li>Lane, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+motility+in+the+colonization+of+uropathogenic+Escherichia+coli+in+the+urinary+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Role of motility in the colonization of uropathogenic Escherichia coli in the urinary tract.</a> Infect Immun. 73 (11), 7644-7656 (2005).</li>
<li>Kao, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complex+interplay+among+bacterial+motility+and+virulence+factors+in+different+Escherichia+coli+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Clin+Microbiol+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">The complex interplay among bacterial motility and virulence factors in different Escherichia coli infections.</a> Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 33 (12), 2157-2162 (2014).</li>
<li>Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rotary+motor+of+bacterial+flagella%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">The rotary motor of bacterial flagella.</a> Annu Rev Biochem. 72, 19-54 (2003).</li>
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<li>Yuan, J., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resurrection+of+the+flagellar+rotary+motor+near+zero+load%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Resurrection of the flagellar rotary motor near zero load.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (4), 1182-1185 (2008).</li>
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<li>Meacci, G., Tu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+the+bacterial+flagellar+motor+with+multiple+stators%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Dynamics of the bacterial flagellar motor with multiple stators.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (10), 3746-3751 (2009).</li>
<li>Lele, P. P., Roland, T., Shrivastava, A., Chen, Y. H., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+flagellar+motor+of+Caulobacter+crescentus+generates+more+torque+when+a+cell+swims+backwards%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Phys%22%5BJournal%5D)">The flagellar motor of Caulobacter crescentus generates more torque when a cell swims backwards.</a> Nat Phys. 12 (2), 175-178 (2016).</li>
<li>Lele, P. P., Shrivastava, A., Roland, T., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+thresholds+in+bacterial+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Response thresholds in bacterial chemotaxis.</a> Sci Adv. 1 (9), e1500299(2015).</li>
<li>Berg, H. C., Turner, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Torque+Generated+by+the+Flagellar+Motor+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Torque Generated by the Flagellar Motor of Escherichia coli.</a> Biophys J. 65, 2201-2216 (1993).</li>
<li>Bai, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+Spread+as+a+Mechanism+for+Cooperativity+in+the+Bacterial+Flagellar+Switch%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Conformational Spread as a Mechanism for Cooperativity in the Bacterial Flagellar Switch.</a> Science. 327, 685-689 (2010).</li>
<li>Reid, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+maximum+number+of+torque-generating+units+in+the+flagellar+motor+of+Escherichia+coli+is+at+least+11%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The maximum number of torque-generating units in the flagellar motor of Escherichia coli is at least 11.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 8066-8071 (2006).</li>
<li>Chen, X., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Torque-Speed+Relationship+of+the+Flagellar+Rotary+Motor+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Torque-Speed Relationship of the Flagellar Rotary Motor of Escherichia coli.</a> Biophys J. 78, 1036-1041 (2000).</li>
<li>Turner, L., Caplan, S. R., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-induced+switching+of+the+bacterial+flagellar+motor%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Temperature-induced switching of the bacterial flagellar motor.</a> Biophys J. 71, 2227-2233 (1996).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

为了便于进行拴系珠追踪并准确估算马达扭矩，应审阅以下信息。在使用带鞭毛的细胞进行这些测量时，剪切是一个关键步骤。剪切可将鞭毛丝缩短为仅剩微小残端，从而确保作用于马达的黏性负载主要来自微珠，并可在10%的误差范围内进行估算16。剪切还能提高获得圆形轨迹且偏心度高度集中（&#60; 微珠直径14）的可能性。剪切不当会导致轨迹偏离，从而加剧追踪过程以及黏性阻力计算中的误差，并导致信噪比较差。使用示波器可快速剔除此类数据。由于不同物种的鞭毛丝生物力学特性可能存在差异，因此可能需要调整剪切方法，以确保目标细菌得到充分剪切。减少与剪切相关误差的一个有效方法是使用缺失编码鞭毛蛋白基因的细胞。随后可通过抗钩蛋白抗体将探针微珠直接连接至钩结构上。
找到一个适当连接的微珠可能具有挑战性。这是因为在视野中的大多数微珠要么粘附在细胞体上，要么粘附在玻璃表面。这类微珠可以很容易地调至清晰对焦。其他微珠则会明显地振动或旋转，振幅或偏心程度较大（&#62; 1.5 - 2倍微珠直径）。这些微珠通常连接在尚未完全剪切的鞭毛丝上，或在与焦平面倾斜的平面上旋转。对这类微珠进...

鞭毛马达通过旋转螺旋状的细胞外丝状结构，使细胞能够游动。对于给定长度的鞭毛，马达所能产生的扭矩大小（即，黏性负荷）决定了其游动速度。另一方面，其旋转方向的转换能力可控制细胞对化学物质的迁移反应，这一过程称为趋化性。趋化性和运动性均为毒力因子 1-3，鞭毛马达在近年来已被充分表征 4越来越多的证据表明，该马达可作为机械传感器——能够通过机械方式检测固体基质的存在 5,6这种能力可能有助于启动表面定植和感染 5,7因此，运动结构感知表面并启动信号传导的机制具有重要意义 8,9.
通过将鞭毛固定在基质上并观察细胞旋转，可方便地研究鞭毛马达。Silverman 和 Simon 首次实现了这种固定，他们使用大肠杆菌（E. coli）的多钩突变体，并利用抗钩抗体将钩结构成功附着于玻璃基质上10。固定细胞实验使研究人员能够研究马达开关对多种化学刺激的响应。例如，Segall 及其同事借助离子电渗 pipette 对固定细胞进行化学刺激，通过观察顺时针旋转比例（CWbias，即马达顺时针旋转的时间占比）的相应变化，测定了趋化信号网络的适应动力学11,12。尽管固定细胞实验在研究开关响应方面效果显著，但其仅能在有限的黏性负载范围内提供有关马达力学特性的信息13。为克服这一问题，Ryu 及其同事将球形乳胶微珠固定在附着于表面的细胞鞭毛残端上，随后利用弱光镊结合后焦面干涉技术追踪微珠运动14。通过使用不同尺寸的微珠，研究人员得以在更宽范围的负载条件下研究马达性能。该实验方法随后由 Yuan 和 Berg 改进，他们开发了一种基于光电倍增管的微珠追踪技术，并结合激光暗场照明，实现了对极微小金纳米微珠（约 60 nm）的追踪。由于这些微珠体积极小，其外部黏性阻力低于内部旋转黏性阻力15,16，从而得以测定大肠杆菌（E. coli）中马达可达到的最大转速（约 300 Hz）。在解藻酸弧菌（V. alginolyticus）中，类似的微珠实验测得了中等黏性负载下的旋转速率（约 700 Hz）17。微珠实验使研究人员能够在整个可能的黏性负载范围（从无负载到接近失速状态）内测量马达响应，从而为理解扭矩生成机制提供了重要的生物物理工具18,19。
最近，我们改进了Yuan-Berg实验方法，引入了光镊技术，从而能够对单个马达施加精确的机械刺激6。利用该技术，我们发现驱动马达旋转的力生成器是动态的机械传感器——它们会根据黏性负载的变化而发生重构。这类负载感应可能触发细胞分化为群游细菌，但其具体机制尚不明确。其他物种的鞭毛马达也可能具有机械敏感性20，但目前尚缺乏直接证据。本文讨论了基于光电倍增管（PMT）的方法，用于追踪连接在鞭毛丝上的乳胶微球的旋转15。与超高速相机追踪相比，光电倍增管装置的优势在于能够相对简便地对单个微球进行长时间的实时追踪。该方法在研究环境刺激引起的鞭毛马达复合物长期重构过程中尤为有用21。尽管我们详细描述的实验方案专门针对E. coli，但这些方法可轻松适用于其他物种鞭毛马达的研究。

<table><tbody><tr><td>聚-L-赖氨酸溶液（0.1%）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en&amp;amp;region=US</td></tr><tr><td>聚苯乙烯微球</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>7307</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en&amp;amp;region=US</td></tr><tr><td>1 mL 鲁尔滑动接头注射器</td><td>Exel Int.</td><td>26048</td><td>http://www.exelint.com/tuberculin_syringes.php</td></tr><tr><td>Clay Adams Intramedic 23 号鲁尔短管接头</td><td>贝克顿·迪金森公司</td><td>427565</td><td>http://www.bd.com/ds/productCenter/ES-LuerStubAdaptors.asp</td></tr><tr><td>聚乙烯管</td><td>哈佛仪器公司</td><td>59-8325</td><td>http://www.harvardapparatus.com/laboratory-polye-polyethylene-non-sterile-tubing.html</td></tr><tr><td>光电倍增管</td><td>滨松光子学株式会社</td><td>R7400U-20</td><td>光谱响应范围 300 至 920 nm，峰值波长 630 nm，&amp;nbsp;响应时间 0.78 ns&amp;nbsp;&lt;br/&gt; http://pdf1.alldatasheet.com/datasheet-pdf/view/212308/HAMAMATSU/R7400U-20.html</td></tr><tr><td>3 × 1 mm 精密狭缝</td><td>Edmund Optics</td><td>NT39-908</td><td>两个狭缝以直角相互固定在光电倍增管上</td></tr><tr><td>示波器</td><td>泰克公司</td><td>TBS 1032B</td><td>可接受其他品牌。数字示波器，TBS 1000B 系列，2 个模拟通道，30 MHz，500 MSPS，2.5 kpts&amp;nbsp;&lt;br/&gt; http://www.tek.com/oscilloscope/tbs1000b-digital-storage-oscilloscope</td></tr><tr><td>八极低通/高通滤波器</td><td>Krohn-Hite</td><td>3384</td><td>可接受其他品牌。建议频率范围为 0.1 Hz 至 200 kHz。&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&lt;br/&gt; http://www.krohn-hite.com/htm/filters/PDF/3384Data.pdf</td></tr><tr><td>Optiphot 显微镜</td><td>尼康公司</td><td>NA</td><td>可使用任何正置或倒置相差显微镜。&lt;br/&gt; https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=754</td></tr><tr><td>50:50（反射:透射）立方体分光棱镜</td><td>ThorLabs</td><td>BS013</td><td></td></tr></tbody></table>

鞭毛马达功能的生物物理表征

Biophysical Characterization of Flagellar Motor Functions

鞭毛马达在细菌运动性和趋化性中的作用已被充分阐明。最近的研究发现，鞭毛马达能够响应多种环境刺激而发生重塑，并成为表面定植和感染的触发因素之一。马达重塑并促进细胞适应性的精确机制可能依赖于关键的马达特性。本文介绍的基于光电倍增管的微珠追踪技术，可实现对马达功能（包括马达转速和切换动力学的适应性变化）的精确生物物理表征。该方法具有实时追踪以及长时间探测马达行为的优势。所讨论的实验方案可轻松拓展应用于研究多种细菌物种中的鞭毛马达。

光电倍增管（PMT）装置如图1A所示。重要的是，PMT在目标微球散射光波长范围内应具有高灵敏度。此处使用的PMT工作于可见光和近红外波段，能够检测由卤素光源照射微球所产生的散射光。最佳照明条件和供电电压因不同装置而异。在本研究使用的装置中，PMT增益约为104 - 105时已足够。每个光电倍增管均被遮蔽，仅在管前保留一个3 × 1 mm的狭缝。这些狭缝限制了样品池中可进入光电倍增管的光线区域，且两个狭缝相互正交。当旋转的微球处于正确位置时（图1B），随着微球进入检测视野，进入光电倍增管的光量增加；随着微球沿圆形轨迹远离视野，光量减少。正弦形PMT电压输出信号的频率反映旋转速度，两个信号之间的相位差则指示旋转方向。使用示波器显示PMT输出信号，可实现实时观察微球运动轨迹。
来自一个代表性电机的时间变化PMT信号 y(t) 和 x(t) 如<st...

最近的研究表明，细菌鞭毛马达能够感知多种环境信号，并随之发生结构重塑。本文所讨论的微珠检测方法有望帮助阐明这种结构重塑在细胞适应环境应激中的作用。

鞭毛马达在细菌运动性和趋化性中的作用已得到充分阐明。最近的研究发现表明，鞭毛马达能够进行重塑……

本实验方案的总体目标是测量附着在活细菌细胞单个鞭毛马达上的探针微珠的旋转情况。我们将介绍的技术具有实时追踪马达响应的优势，并能够实时区分有效数据与无效数据。该方法正在帮助我们回答力学生物学领域中的关键科学问题，并揭示分子马达行为背后的物理机制。尽管我们主要采用这些技术来研究大肠杆菌中的鞭毛马达，但这些方案可轻松地进行调整，以用于研究其他有鞭毛细菌物种中的马达。将携带黏性 fliC 等位基因的目标菌株在 TB 培养基中过夜培养。次日，以 1:100 的比例接种 10 毫升新鲜 TB 培养基。在 33 摄氏度的摇床培养箱中培养菌液，直至其在 600 纳米处的光密度达到 0.5。在1500 × g条件下离心5至7分钟，沉淀细胞。然后，将沉淀物在10毫升滤膜除菌的运动缓冲液中剧烈重悬。重复离心和重悬步骤两次。将最终的沉淀重悬于1毫升MB缓冲液中。使用聚乙烯管连接两个带有21至23号接头的注射器，将悬液在其中来回转移约75次以进行剪切。剪切操作的总时间应控制在30至45秒内。剪切后的细胞经离心后，将沉淀重悬于100至500微升MB缓冲液中。通过将两张双面胶带夹在盖玻片和载玻片之间，制备成成像腔室。在腔室中加入0.01%的聚-L-赖氨酸溶液，5分钟后用MB轻轻冲洗表面。向腔室中加入40微升细胞悬液，并留出足够时间使细胞贴附于玻璃表面。从腔室一侧加入100微升MB，同时从另一侧用滤纸吸去溶液，以洗去未贴附的细胞。接着，向腔室中加入10至15微升乳胶微球。使用一系列珠粒尺寸进行实验，以获得良好的对比度。让珠粒有足够的时间沉降并附着到细胞上。用 100 µL 的 MB 轻柔冲洗珠粒，以去除未结合的珠粒。将样品置于显微镜载物台上，扫描表面以寻找与马达蛋白结合的微珠。只要能够保持足够的对比度，可在明场下使用60倍物镜进行成像，以清晰区分暗背景下明亮的微珠。选定微珠后，横向移动载物台，将微珠移至预先确定的角落位置。将微珠置于同一角落，以确保正确判断微珠的旋转方向。采样频率应保持高于电机旋转频率的两倍，以避免混叠效应引起的误差。本研究中采用的采样频率为电机旋转频率的10倍，用于观测以50赫兹旋转的电机。如果在固定后，珠子的摆动幅度超过珠子半径的一至两倍，则建议增加细胞剪切次数。此处展示了适当固定的珠子与未固定珠子之间的直观对比。两个光电倍增管的输出信号以500赫兹的频率采样，并显示了测量过程中的一小段时间内的信号结果。经过滤后的光电倍增管（PMT）输出信号，在居中和缩放处理后，用于重建旋转微珠的环形轨迹，如图所示。理想的微珠轨迹近似为圆形，但椭圆形轨迹也可接受。单个分子马达的微珠轨迹所计算出的角速度，以三秒时间窗表示。电机在逆时针和顺时针旋转方向之间的反复转换通过正值和负值之间的切换来表示。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用此处介绍的基于光电倍增管的技术，高精度地追踪连接到单个鞭

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

囊泡或细胞器等货物的细胞内运输由分子马达蛋白沿极性微管进行。本方案描述了神经元内单个货物颗粒运输方向性与其相关马达蛋白的种类和相对含量之间的关联分析方法。...

利用“货物定位图谱”分析法表征运动性轴突运输货物上分子马达的组成

本实验方案的目的是在DNA折纸纳米结构上组装分子马达的集合体，并利用全内反射荧光显微镜观察该集合体的运动行为。...

在DNA折纸纳米结构上构建动力蛋白与驱动蛋白马达复合体用于单分子观测

许多细菌利用鞭毛驱动的运动能力来在环境中移动，并单独或集体定植于有利的环境。本文展示了三种成熟方法的应用，这些方法利用运动性作为筛选工具，以鉴定参与游泳和群集运动的组分或通路。...

研究鞭毛驱动的运动性 大肠杆菌 通过依次应用三种成熟技术

本文介绍了一种表达和纯化肌球蛋白5a的实验流程，并讨论了如何利用群体和单分子水平的体外荧光显微镜检测方法对其进行表征，以及如何修改这些方法以适用于非肌肉肌球蛋白2b的表征。...

基于体外荧光显微镜的运动分析技术针对肌球蛋白的特异性优化

本文介绍了一种针对持续性运动的肌球蛋白-5分子马达进行超快力钳实验的完整方案，该方案可轻松拓展应用于其他类型的持续性分子马达研究。本方案详细描述了从实验装置的搭建、样品制备，到数据采集与分析的全部必要步骤。...

利用超快力钳光谱技术解析行进性肌球蛋白的力-酶特性

本文描述了构建Aeromonas中特定糖基转移酶或含糖基转移酶区域的空突变株，以及为确定其编码酶在糖链生物合成中的作用和功能、并阐明该糖链在细菌致病性中的作用而开展的运动性测定和鞭毛纯化实验。...

构建无功能突变体以阐明细菌糖基转移酶在细菌运动性中的作用

双向有丝分裂驱动蛋白-5 Cin8 在运动过程中会聚集形成不断分裂和融合的簇状结构。聚集形成簇状结构还会改变 Cin8 的运动速度和方向性。本文介绍了一种利用纯化的 Cin8-GFP 进行运动性检测的实验方案，以及对 Cin8...

来自 S. cerevisiae 细胞的双向驱动蛋白-5 Cin8 单分子及分子簇的运动特性

利用光镊探测肌球蛋白在肌动蛋白细丝束中的集合力学行为

此处，我们介绍一种微管束的重建方案 体外...

直接测量重建的活性微管束内部作用力

本研究详细描述了利用Sf9-杆状病毒表达系统纯化驱动蛋白-3家族成员KIF1A(1-393LZ)的方法。体外对这些纯化的马达蛋白进行单分子及多马达滑动分析，结果显示其运动特性...

单分子分析Sf9纯化的超进程性驱动蛋白-3家族马达

本方案详细介绍了利用MultiBac杆状病毒系统重组表达人源肌球蛋白-7a全酶，并通过定制的体外丝状蛋白滑动实验研究其运动特性的操作步骤。...

基于MultiBac系统的入源肌球蛋白-7a的纯化及生物物理表征

探索鞭毛马达功能的生物物理表征方法，利用实时追踪探针微球技术测量大肠杆菌活体细胞中单个鞭毛马达的旋转行为。该技术可实时区分有效与无效数据，为机械生物学研究提供高精度分子马达行为分析手段，并可推广应用于其他鞭毛细菌物种。

鞭毛马达功能的生物物理表征

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