Name: 小儿食管上皮细胞重编程的条件在组织工程和疾病使用调查 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: 了解条件重编程技术用于小儿食管上皮细胞扩增的方法，该技术可从内镜活检样本中无遗传修饰地高效扩增患者特异性细胞，为食管疾病研究和组织工程应用提供可靠的细胞来源。

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我们感谢康涅狄格儿童医疗中心战略研究基金对本工作的支持。

在获得患儿父母/监护人的知情同意，并经机构审查委员会批准（IRB#13-094）后，采集食管活检组织。
1. 灭菌器械和明胶溶液
<ol>
	<li>在处理组织前，将镊子、剃刀刀片和剪刀进行高压灭菌，以防止污染。</li>
	<li>配制 200 mL 0.1% 明胶溶液时，将 200 mL 蒸馏水与 0.2 g 明胶混合。高压灭菌后冷却备用。</li>
</ol>
2. 包被组织培养板
<ol>
	<li>在细胞分离前约 2 小时，加入足量的 0.1% 明胶以覆盖组织培养皿（100 mm），并在细胞培养箱中于 37 °C 下孵育。 
	注意：这些培养皿也可提前制备，并在使用前存放于培养箱中。</li>
</ol>
3. 制备用于解离的酶溶液
<ol>
	<li>在细胞分离前约 30 分钟，根据瓶签上标注的单位每毫克浓度，在天平上称取 10 单位的中性蛋白酶（dispase）。将粉末放入含有 10 mL 改良伊格尔培养基（Dulbecco's Modified Eagle Medium, DMEM）的 15 mL 圆锥形离心管中，并置于 37 °C 水浴中。</li>
</ol>
4. 配制细胞培养基
<ol>
	<li>配制 50 mL 条件重编程培养基时，将以下成分混合至无菌锥形管中：35 mL F12（Ham's 培养基）、11.5 mL DMEM、0.5 mL L-谷氨酰胺、0.5 mL 100× 青霉素/链霉素、2.5 mL 胎牛血清（FBS）、250 μg 人胰岛素、500 ng 人表皮生长因子（EGF）。</li>
	<li>配制 500 mL 3T3 培养基时，将 50 mL FBS、5 mL 100× 青霉素/链霉素和 5 mL L-谷氨酰胺加入 500 mL DMEM 中混合。</li>
	<li>配制 500 mL 无血清角质形成细胞培养基时，解冻随培养基提供的表皮生长因子（EGF）和牛垂体提取物（BPE）添加剂，将这些添加剂加入 500 mL 基础培养基瓶中，并加入 5 mL 100× 青霉素/链霉素。</li>
</ol>
5. 作为饲养层来源的3T3细胞的培养与照射
<ol>
	<li>配制3T3培养基，包含DMEM、10% FBS、1×青霉素/链霉素和2 mM L-谷氨酰胺。</li>
	<li>在患者样本到达前至少3天，于组织培养处理过的T-75培养瓶中培养3T3细胞。
	<ol>
		<li>在患者样本到达前，用每瓶5 mL的0.25%胰蛋白酶-EDTA对3T3细胞进行消化，并于37 °C孵育5分钟，或直至大多数细胞呈悬浮状态</li>
	</ol>
	</li>
	<li>加入5 mL 3T3培养基以终止反应。吸出细胞悬液并转移至15 mL锥形管中。在300 x g下离心5分钟。</li>
	<li>吸弃培养基，并将细胞重悬于一定体积的台盼蓝溶液中用于细胞计数。取10 µL细胞与10 µL台盼蓝混合，以排除死细胞。取10 µL该混合液加入血细胞计数板进行细胞计数。 
	注意：本实验方案中，经照射的3T3细胞的接种密度为每平方厘米10,900个细胞2，相当于每100 mm培养皿600,000个细胞。</li>
	<li>根据每位患者的样本，分装足够接种一个100 mm培养皿的细胞数量，重悬于50 mL离心管中的25 mL 3T3培养基中，并以3000 rads剂量进行照射。</li>
	<li>照射后，以300 × g离心5分钟沉淀细胞，并用条件重编程培养基重悬，每100 mm培养皿加入5 mL。</li>
	<li>将试管放置一旁，待后续实验步骤中进行患者细胞的接种时再使用（参见步骤 7.6）。</li>
</ol>
6. 儿科食管活检样本的获取、保存与转运
<ol>
	<li>将 5 mL 含 100 µg/mL&#160; primocin 的完全型无血清角质形成细胞培养基加入 15 mL 圆锥形离心管中，并置于冰上运送至医疗机构。 
	注意：这些含培养基的离心管可在 4 °C 下保存长达 2 个月。</li>
	<li>在内镜检查时获取约 8 块食管活检组织，并按以下方式分装：
	<ol>
		<li>将六块活检组织放入含有含 100 µg/mL primocin 的完全型无血清角质形成细胞培养基的 15 mL 圆锥形离心管中，并置于湿冰上。</li>
		<li>将一块活检组织放入 5 mL 缓冲福尔马林溶液中，并置于湿冰上。</li>
		<li>将一块活检组织放入含有最佳切割温度包埋剂的小型活检冷冻模具中。
		<ol>
			<li>立即将该模具浸入盛有异戊烷并置于液氮中的烧杯中。待其完全冻结后，将冷冻模具放入标本袋中，并在聚苯乙烯泡沫容器中用干冰保存。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将含有活检组织的培养基或福尔马林的离心管放入可密封的袋子中，再放入装有湿冰的运输箱内。用生物危害标签密封并标记箱子，然后将其运送至实验室。 
	注意：装有干冰和冷冻活检组织的容器也需密封，并贴上生物危害标签。</li>
</ol>
7. 患者组织的处理以用于后续培养和分析
<ol>
	<li>到达实验室后，将置于干冰上的冷冻活检样本转移至 -80 °C 超低温冰箱，用于后续切片或 RNA 提取。将样本放入福尔马林中，置于 4 °C 冰箱内保存，并固定过夜。</li>
	<li>以 300 × g 离心剩余活检组织，吸除上清液。向锥形管中加入 10 mL 分散酶溶液，密封后于 37 °C 水浴中孵育 15 分钟。</li>
	<li>孵育结束后，以 300 × g 离心活检组织，吸除上清液，并将组织重悬于 5 mL 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 溶液中。</li>
	<li>将含有活检组织的 5 mL 胰蛋白酶-EDTA 溶液转移至一个 100 mm 无菌培养皿中，使用两把灭菌剃刀尽可能将组织切碎。</li>
	<li>将含有切碎组织的 5 mL 胰蛋白酶-EDTA 溶液转移至新的 15 mL 锥形管中。用额外的 5 mL 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 溶液冲洗培养皿两次，并将冲洗液一并加入锥形管中。将锥形管置于 37 °C 水浴中孵育 10 分钟。</li>
	<li>孵育结束后，以 300 × g（1.4 RPM）离心 5 分钟，吸除上清液。向锥形管中加入 5 mL 条件重编程培养基，以及含有经辐照饲养细胞的 5 mL 条件重编程培养基（见步骤 5.7）。</li>
	<li>向 10 mL 细胞悬液中加入 ROCK 抑制剂（1 μL/mL），并在吸除组织培养皿中的明胶后进行接种。于 37 °C 孵育。</li>
</ol>
8. 细胞的培养与扩增
<ol>
	<li>培养约5天后，吸除含有组织碎块的初始培养基，用5 mL无菌PBS冲洗培养皿2-3次。向培养皿中加入含10 μM ROCK抑制剂的新鲜培养基。</li>
	<li>当细胞融合度达到70%时进行传代扩增。向培养皿中加入5 mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA，于37 °C培养箱中孵育不超过2.5分钟，以去除饲养层细胞。孵育结束后，吸除胰蛋白酶-EDTA溶液，并用5 mL PBS冲洗培养皿。</li>
	<li>吸除PBS，向培养皿中加入5 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA，孵育5-10分钟，或直至细胞从培养皿表面脱落。加入等体积的培养基以终止反应，将全部液体转移至50 mL锥形离心管中，在300 × g条件下离心5分钟。</li>
	<li>用确定体积的条件重编程培养基重悬细胞，取10 μL细胞悬液与10 μL台盼蓝混合，使用血细胞计数板计数，确定总细胞数量。</li>
	<li>为扩增细胞，将100万个人类食管细胞与120万经辐照处理的3T3细胞混合，总体积为15 mL，接种至150 mm培养皿中。加入新鲜的10 μM ROCK抑制剂，并将细胞悬液接种至明胶包被的150 mm培养皿中。</li>
</ol>
9. 冻存和储存人食管上皮细胞
<ol>
	<li>配制冻存液时，向条件重编程培养基中加入10% DMSO。消化并计数细胞后，将细胞分装至新的50 mL离心管中，在300 × g条件下离心5分钟。</li>
	<li>吸除上清液，按每支冻存管2 mL的量加入冻存液。待细胞悬液混匀后，将106个细胞分装至预先标记好的冻存管中。将冻存管置于-80 °C冻存容器中至少24小时，之后转移至液氮中长期保存。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

从患者活检组织中分离和扩增食管上皮细胞最重要的步骤包括：1）充分解离活检组织，同时尽量减少细胞死亡；2）每次更换培养基时均需在细胞培养基中添加ROCK抑制剂；3） feeder细胞的使用量不得超过推荐数量；4）保持无菌的洁净培养环境；5）在细胞接近融合前及时传代。
由于不同患者的活检样本在条件重编程过程中存在个体差异，因此在生长动力学、表型以及多代传代扩增能力方面出现差异是合理的。通常，从每位患者获取4个食管活检样本用于细胞分离。解离后，第0天可获得约300,000–600,000个细胞。平均到第3代时，细胞数量可扩增至1,000万以上。形成的克隆形态应类似于上皮细胞系所描述的铺路石样形态25（图2）。培养中的细胞样本应通过qRT-PCR、流式细胞术和免疫荧光检测上皮标志物，以确认扩增的细胞群体确为上皮来源（图3）。若细胞不表达上皮标志物（E-钙黏蛋白、EpCAM、TJP1），则应终止并丢弃该细胞系。若细胞确为上皮来源，则其中超过90%的细胞应为EpCAM阳性。为评估...

食管组织工程与嗜酸性粒细胞性食管炎（EoE）在过去十年中成为众多实验室的研究重点。先天性缺陷（如食管闭锁）约每4,000例活产婴儿中即出现1例，导致食管发育不全，进而造成进食困难1自1993年该疾病被确认以来，嗜酸性食管炎的发病率和患病率持续上升。嗜酸性食管炎的发病率介于每万人年0.7至10例之间，患病率范围为每十万人中0.2至43例。2治疗长段型食管闭锁的一种新型且具有吸引力的外科方法是利用患者自体细胞制备可用于植入的组织工程构建物。这些细胞与合成支架材料结合后，可形成无需免疫抑制的自体组织构建物。已有研究团队开始探索利用类干细胞进行食管组织工程。 3 以及利用天然食管上皮细胞重建黏膜4-7儿科患者食管中存在的疾病通常难以在不进行干预的情况下诊断或研究。此外，利用动物模型或 体外 用于儿童疾病（如嗜酸性食管炎）的永生化细胞系模型无法完全涵盖确切的疾病发病机制及患者个体差异8因此，研究患者疾病进程的能力 体外 为了鉴定特异性致病抗原、评估潜在机制并研究药物治疗方案，将具有创新性，并为临床医生提供有助于患者治疗的信息。
已有多种自体或患者特异性细胞类型被提出用于组织工程及人类疾病发病机制的研究。然而，其中一些细胞类型在产生足量特定表型细胞方面存在局限性，难以满足大型支架接种或高通量实验的需求 体外 研究。尽管多能或多能干细胞的使用一直是大量研究讨论的主题，但其应用的局限性和不足之处已有充分描述9人类胚胎干细胞的使用存在广泛争议，并引发诸多伦理问题。最重要的是，如果这些细胞在植入活体宿主前未从其多能状态分化，则会形成类似于肿瘤的畸胎瘤10此外，使用胚胎干细胞不具有患者特异性，可能引发同种异体免疫反应，因而需要进行免疫抑制。10诱导性多能干细胞（iPSCs）是一类具有多能性的细胞，可来源于患者自身的体细胞。通过多种整合性与非整合性技术，可将皮肤细胞等体细胞重编程为多能状态。这些细胞随后可作为患者特异性的细胞来源，用于组织工程或疾病机制研究。将外源性遗传物质整合到细胞基因组中是目前备受关注的问题；即使外源序列被完全清除，iPSCs似乎仍会保留一种表观遗传记忆 &#34;记忆&#34; 向其来源的细胞类型11这些细胞也会形成畸胎瘤 体内 若未在移植前进行分化11已研究了多种分化方案，重点关注上皮细胞谱系12,13,14然而，必须注意的是，分化结束后获得的细胞类型并非均一，仅含有目标细胞类型的少量成分。这导致产量较低，需要进一步纯化以获得目标细胞类型。尽管诱导多能干细胞（iPSCs）是一种具有潜力的患者特异性细胞来源，但获取用于组织工程或疾病研究的目标细胞类型的过程效率极低。
人体上皮细胞已成功从人体多种病变及非病变组织中分离获得，包括：肺15乳腺16小肠17结肠18，膀胱19 和食管20需要注意的是，人类原代细胞维持表型的传代次数是有限的21,22遗憾的是，这意味着可能无法获得足够的细胞数量用于疾病研究，或用于接种工程化支架以进行移植。因此，需要开发新技术，在扩增患者细胞的同时仍能维持其上皮表型。2012年，Liu等人报道了一种利用滋养层细胞和ROCK抑制剂对正常及癌变上皮细胞进行条件重编程的方法。 等23该技术利用经照射的饲养细胞、ROCK抑制剂和条件重编程培养基，扩增从前列腺癌和乳腺癌活检组织中获得的癌性上皮细胞，旨在生成足够数量的细胞用于后续研究 体外 药物筛选等检测。该技术能够无限扩增上皮细胞 &#34;重编程&#34; 将这些细胞重编程至一种类似干细胞或祖细胞的状态，该状态具有高度增殖性。已有研究表明，这些细胞不具有致瘤性，也无法形成畸胎瘤。23,24此外，采用该技术对细胞进行体外传代后，未发现染色体异常或基因操作痕迹。23,24最重要的是，这些细胞仅能分化为目标原代细胞类型。因此，该技术无需细胞永生化，即可为疾病研究或组织工程提供大量患者特异性的上皮细胞资源。
获取特定器官的上皮组织以研究疾病过程常因患者风险而受限，且并非总能实现。对于患有食管疾病或缺陷的患者，内镜活检取材是一种微创获取上皮组织的方法，所获组织可经解离并进行条件重编程，从而获得源自该患者食管黏膜、可无限扩增的细胞来源。这使得 体外 对上皮细胞的研究可用于评估疾病进程并筛选潜在的治疗方法。其中，嗜酸性食管炎是一种可显著受益于该方法的疾病，该病已被描述为一种食管的过敏性疾病8过敏试验以及治疗方案均可进行评估 体外 利用患者自身的上皮细胞，这些数据可传递给主治医师，以制定个体化的治疗方案。条件重编程技术结合儿科患者的内镜活检，能够实现任意患者正常食管上皮细胞的无限扩增。因此，该细胞来源可与天然或合成支架材料联合使用，为缺损、疾病或创伤提供个体化的外科治疗选择。细胞数量的无限性将有助于构建食管组织工程结构，其管腔可被食管上皮细胞完全重接种，从而促进其他残余细胞类型的再生。

<table><tbody><tr><td>Primocin</td><td>InVivogen</td><td>ant-pm2</td><td></td></tr><tr><td>异戊烷</td><td>Sigma Aldrich</td><td>277258-1L</td><td></td></tr><tr><td>猪皮明胶</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1890-100G</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>冷冻模具</td><td>TissueTek</td><td>4565</td><td></td></tr><tr><td>冷冻基质OCT</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>6769006</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 锥形管</td><td>Denville Scientific</td><td>C1017-p</td><td></td></tr><tr><td>完全型角质形成细胞无血清培养基</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>10724011</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素溶液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I9278-5ml</td><td></td></tr><tr><td>人表皮生长因子（EGF）</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>ROCK抑制剂（Y-27632）</td><td>Fisher Scientific</td><td>125410</td><td></td></tr><tr><td>F-12 培养基&amp;nbsp;</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>11765054</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Denville Scientific</td><td>FB5001</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>17105041</td><td></td></tr><tr><td>0.05% 胰蛋白酶-EDTA</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>0.25% 胰蛋白酶-EDTA</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>100 mm 培养皿</td><td>Denville Scientific</td><td>T1110-20</td><td></td></tr><tr><td>150 mm 培养皿</td><td>Denville Scientific</td><td>T1115</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 锥形管</td><td>Denville Scientific</td><td>&amp;nbsp; C1062-9&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液片剂</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2944-100</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 移液管</td><td>Fisher Scientific</td><td>1367811D</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 移液管</td><td>Fisher Scientific</td><td>1367811E</td><td></td></tr><tr><td>25 mL 移液管</td><td>Fisher Scientific</td><td>1367811</td><td></td></tr><tr><td>9&quot; 巴氏移液管</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20D</td><td></td></tr><tr><td>NIH 3T3 细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL1658</td><td></td></tr></tbody></table>

用于组织工程与疾病研究的儿童人食管上皮细胞的条件性重编程

Conditional Reprogramming of Pediatric Human Esophageal Epithelial Cells for Use in Tissue Engineering and Disease Investigation

在培养中鉴定并扩增患者特异性细胞，用于组织工程和疾病研究，可能极具挑战性。利用各种类型的干细胞来获得目标细胞类型，通常成本高昂、耗时且效率极低。此外，在使用此类细胞来源前，必须去除不需要的细胞类型，这又增加了额外的操作步骤。为了获得足够数量的食管上皮细胞，以构建食管腔结构或筛选治疗食管疾病的方法，必须在不改变其基因表达或表型的前提下扩增天然食管上皮细胞。食管上皮组织的条件重编程技术为扩增患者特异性食管上皮细胞提供了一种有前景的方法。更重要的是，这些细胞无需进行分选或纯化，并且在脱离条件重编程培养环境后可恢复为成熟的上皮状态。该技术已在多项癌症筛查研究中被描述，能够实现这些细胞在多次传代过程中的无限扩增。开展食管筛查检测的能力，将有助于通过识别引发患者症状的触发机制，彻底改变嗜酸性粒细胞性食管炎等儿童食管疾病的治疗方式。对于患有先天性缺陷、食管疾病或损伤的患者，这种细胞来源可作为种子细胞用于接种合成支架，进而植入体内以修复或替代受损区域。

从患者活检组织中分离食管上皮细胞的关键步骤总结见图1。上皮细胞集落约在4-5天内形成，并由成纤维细胞饲养层细胞包围（图2A）。随着集落的扩展，它们将相互融合形成更大的集落（图2B）。当培养物达到约70%融合度时，需进行扩增（图2C）。为确保在去除上皮细胞前将成纤维细胞从培养皿中清除，可使用0.05%胰蛋白酶-EDTA处理最多2.5分钟以去除饲养层细胞。去除饲养层后的状态应与图2D相似。随后，贴壁的上皮细胞用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化，并重新接种至新的经辐照处理的饲养层细胞上（图2E）。
通过qRT-PCR对这些细胞进行表型表征，结果显示在第1代末期，祖细胞标志物P63表达上调，同时与初始活检样本相比，E-钙黏蛋白和TJP1的表达得以维持。这表明细...

利用条件重编程技术扩增人儿童食管上皮细胞，可为研究人员提供患者特异性的细胞群体，这些细胞可用于构建食管组织，以进行自体移植来治疗食管缺损或损伤，同时可作为治疗性筛选实验的细胞库。

在培养中鉴定并扩增可用于组织工程和疾病研究的患者特异性细胞可能极具挑战性。利用……

本实验的总体目标是从内镜活检获取的患者来源食管上皮细胞进行扩增，以研究食管疾病，或构建三维食管支架用于后续建模或食管组织替代。该方法可用于深入理解食管上皮细胞在食管疾病中的作用，也可用于构建三维支架以进行疾病建模或植入应用。该技术的优势在于，无需进行任何基因或永久性修饰，即可利用极小的组织样本生成患者特异性的上皮细胞。该技术的应用前景包括深入理解嗜酸性粒细胞性食管炎的发病机制，以及开发针对食管闭锁和嗜酸性粒细胞性食管炎的治疗方法。通常，初次操作该技术的研究人员在收获人食管上皮细胞前，难以彻底去除饲养层细胞，从而影响细胞纯度。本技术由本实验室的技术员 Christopher Foster 演示。在获取患者样本前至少三天，将3T3细胞以3T3培养基接种于组织培养处理的T75培养瓶中。实验当天，在获取样本前，每瓶加入5毫升0.25%胰蛋白酶-EDTA，在37°C下作用约5分钟，使3T3细胞脱落。当大部分细胞呈悬浮状态时，加入5毫升3T3培养基以终止反应，并将细胞悬液转移至15毫升锥形管中进行离心。用培养基重悬沉淀后进行细胞计数。然后，将适量细胞转移至15毫升锥形管中用于接种。接下来，向细胞中加入 25 毫升新鲜的 3T3 培养基，用于 3000 rads 的照射。然后通过离心收集细胞，并将沉淀重悬于条件重编程培养基中，每 100 毫米培养皿加入 5 毫升。在内镜检查时获取约六个食管活检样本后，将六个活检样本置于含有完全无血清角质形成细胞培养基的 15 毫升锥形管中，培养基中添加 Primocin，并将锥形管置于湿冰上。将一份活检组织置于含有5毫升缓冲福尔马林的湿冰中，另一份活检组织放入含有包埋介质的小型活检冷冻模具中。立即将模具浸入盛有冰或戊烷的烧杯中，再将烧杯置于液氮容器内。待组织完全冻结后，将冷冻模具放入装有干冰的聚苯乙烯泡沫容器中的标本袋内。然后，将活检样本管放入带有生物危害标签的密封袋中，并置于装有湿冰的运输箱内，用生物危害警示贴密封并标记内外两个容器，随后运送至实验室。进入实验室后，立即将冷冻活检样本转移至–80 °C条件下储存，用于后续切片或RNA提取。将样本置于福尔马林中，于4 °C冰箱内过夜固定，并将剩余活检样本放入离心机中。将每根试管中的培养基更换为10毫升dispase溶液，密封试管后于37°C水浴中孵育15分钟。孵育结束后，再次离心沉淀组织样本，并将样本重悬于5毫升0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液中。将组织样本转移至一个100毫升无菌培养皿中，使用两把灭菌的剃刀尽可能将组织切碎。当所有组织切割完毕后，将组织碎片转移至一个新的15毫升离心管中，并用5毫升0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液冲洗培养皿两次。将洗涤液合并至该离心管中，然后将样品重新置于37°C水浴中。10分钟后，离心消化后的组织片段和饲养细胞，分别用5毫升条件重编程培养基重悬沉淀。然后，将饲养层细胞和食管活检样本合并至同一管中，并加入Rho激酶（ROCK）抑制剂，将细胞接种于经明胶包被的组织培养皿中进行共培养。约五天后，通过抽吸去除培养基和组织碎块，并用5毫升无菌PBS冲洗培养皿两到三次。最后一次洗涤后，向培养板中加入10毫升含有ROCK抑制剂的新鲜培养基，将共培养物放回培养箱中继续培养，直至细胞达到70%融合度。为扩增细胞，使用5毫升0.05%胰蛋白酶-EDTA在37摄氏度条件下消化不超过2.5分钟以去除饲养层细胞。用5毫升新鲜PBS洗涤培养板，以去除悬浮的饲养细胞，随后加入5毫升0.25%胰蛋白酶-EDTA，孵育5至10分钟，直至活检样本细胞从培养板底部松脱。接着，加入10毫升新鲜培养基终止反应，并将细胞转移至50毫升锥形管中进行离心。将沉淀重悬于新鲜的条件重编程培养基中进行计数，取1×10⁶个人源食管细胞加入新的锥形管中。向食管细胞中加入1.2×10⁶个经辐照的3T3细胞，并用新鲜的条件重编程培养基将管内总体积补至15 mL。然后向细胞中加入新鲜的ROCK抑制剂，将共培养细胞接种至经明胶包被的150 mm培养皿中。为将食管细胞冷冻保存于-80摄氏度环境中，需先去除饲养层细胞，并按前述方法消化脱离食管细胞。随后，将细胞转移至新的50毫升锥形离心管中进行离心，再以每2毫升冻存液重悬1×10⁶个细胞的浓度重新悬浮细胞沉淀。接着，将2毫升细胞悬液分装至每个预先标记的冻存管中，并将样本在-80摄氏度条件下保存至少24小时，之后转移至液氮中进行长期保存。上皮细胞集落大约在四到五天内形成，并由成纤维细胞饲养层细胞包围。随着这些集落的扩展，它们将与其他集落融合，形成更大的集落。当培养物达到70%融合度时，需要进行扩增。去除饲养细胞后，可将贴壁的上皮细胞进行胰蛋白酶消化，并重新接种至新的经辐照处理的饲养细胞上。通过qRT-PCR对这些细胞进行表型表征，结果显示在第一代末期，祖细胞标志物P63的表达较初始活检样本显著上调，表明细胞已被重编程为更接近祖细胞的干细胞样状态。当这些细胞被转移至常规组织培养板时，P63的表达下降，而紧密连接蛋白1（TJP1）和E-钙黏蛋白的表达上升，表明细胞表型由祖细胞向更分化的上皮细胞发生转变。传代一次后对细胞进行流式细胞术分析表明，超过90%的细胞也呈EpCAM阳性。免疫荧光染色显示，这些细胞保留了上皮细胞标志物、前体细胞标志物、增殖标志物以及上皮紧密连接蛋白的表达。来自非疾病患者的食管细胞倍增时间计算约为36至40小时，尽管病变细胞的倍增时间可能会更长。一旦掌握，该技术应在大约一小时内完成。在操作过程中，务必使用无菌技术以防止污染，并需迅速操作以维持细胞活性。完成该步骤后，可进行其他检测，例如transwell培养，以评估引起食管炎症或发病机制的抗原。该检测方法开发完成后，将有助于研究人员识别引发嗜酸性食管炎的触发性抗原，并为治疗此类患者提供新的治疗选择。观看本视频后，您应能够充分掌握如何从内镜活检组织中分离并扩增食管上皮细胞，以用于食管疾病的研究或构建三维模型。请务必注意，使用锐利器械和生物组织可能存在安全风险。务必妥善处理锐器，并遵循良好的生物安全规范。

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发育生物学

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