小儿食管上皮细胞重编程的条件在组织工程和疾病使用调查
2017年3月22日
利用条件重新编程人类小儿食管上皮细胞的扩张提供了可用于工程食管构造为自体移植来治疗缺损或损伤，并作为治疗性筛选测定的储存器单元的特定病人群调查。
该程序的总体目标是从内窥镜活检中扩增患者来源的食管上皮细胞，以研究食管疾病，或创建 3D 食管支架用于下游建模或食管组织置换。这种方法可用于更好地了解食管上皮细胞在食管疾病中的作用。它们还可用于查看用于建模或植入的 3D 支架。
这项技术的优势在于，它允许我们从非常小的组织中生成患者特异性的上皮细胞，而无需任何基因或永久性修饰。该技术的意义延伸到了解嗜酸性粒细胞性食管炎的发病机制，以及开发食管闭锁和嗜酸性粒细胞性食管炎的治疗方法。通常，刚接触这项技术的个体将难以在收获人食管上皮细胞之前完全去除饲养细胞以保持纯度。
演示这项技术的是我们实验室的技术人员 Christopher Foster。至少在获得患者样品前三天，将 3T3 细胞接种在经组织处理的 T75 培养瓶中的 3T3 培养基中。实验当天，就在获取样品之前，用每个培养瓶 5 毫升 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 分离 3T3 细胞，在 37 摄氏度下分离约 5 分钟。
当大多数细胞漂浮时，加入 5 ml 3T3 培养基以终止反应，并将细胞悬液转移到 15 ml 锥形管中进行离心。将沉淀重新悬浮在培养基中进行计数。然后，将适当数量的细胞转移到 15 mL 锥形管中。
接下来，向细胞中加入 25 毫升新鲜的 3T3 培养基，以 3000 拉德进行照射。然后，通过离心收集细胞，并以每 100 毫米板 5 毫升的速度将沉淀重悬于条件编程培养基中。在内窥镜检查时获得大约 6 次食管活检后，将 6 次活检放入含有完全无血清角质形成细胞培养基的 15 毫升锥形管中，并在湿冰上补充 Primo星。
将一份活检试剂盒放入湿冰上的 5 毫升缓冲福尔马林中，并将一份活检试剂盒放入含有包埋培养基的小型活检冷冻模具中。立即将模具浸入液氮容器内的冰或戊烷烧杯中。组织冷冻后，将冷冻模具放入标本袋中，放在聚苯乙烯泡沫容器中的干冰上。
然后，将活检管放入装运箱内的可密封袋中，并贴有含有湿冰的生物危害标签，并用生物危害标签密封和标记两个容器，以便运输到实验室。进入实验室后，立即将冷冻活检转移到零下 80 摄氏度的储存环境中，以进行下游切片或 RNA 提取。将福尔马林中的样品放入 4 摄氏度的冰箱中过夜固定，并将剩余的活检结果放入离心机中。
用 10 mL 分散酶溶液替换每管中的培养基，并密封试管，在 37 °C 下在水浴中孵育 15 分钟。在孵育结束时，再次旋转活检，并将样品重悬于 5 毫升 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 中。将活检转移到单个 100 毫升无菌板上，并使用两把消毒的剃须刀将组织尽可能细地切碎。
切开所有组织后，将组织碎片转移到新的 15 毫升试管中，然后用 5 毫升 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 冲洗板两次。将洗涤液汇集管中，并将样品放回 37 摄氏度的水浴中。10 分钟后，离心消化的样品块和饲养层细胞，并将沉淀物重悬于 5 mL 条件重编程培养基中。
然后，将饲养层和食管活检样本合并成一个试管，并向细胞中加入 rho 激酶或 ROCK 抑制剂，以便在明胶包被的组织培养皿上共培养。大约 5 天后，通过抽吸去除培养基和切碎的活检块，并用 5 毫升无菌 PBS 冲洗培养皿 2 到 3 次。最后一次洗涤后，向板中加入 10 毫升补充有 ROCK 抑制剂的新鲜培养基，然后将共培养物放回培养箱中，直到细胞达到 70% 汇合。
要扩增细胞，请在 37 摄氏度下用 5 毫升 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 取出饲养层，放置不超过两分半钟。用 5 mL 新鲜 PBS 冲洗板以去除漂浮的饲养细胞，并加入 5 mL 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 孵育 5 至 10 分钟，直到活检样品细胞从板底部松动。然后，用 10 mL 新鲜培养基终止反应，并将细胞转移到 50 mL 锥形管中进行离心。
将沉淀重悬于新鲜的条件重编程培养基中进行计数，现在，将 10 倍至第六个人食管细胞放入新的锥形管中。向食管细胞中加入 1.2 乘以 10 的第六个 3T3 细胞，并用新鲜的条件重编程培养基将管中的总体积增加到 15 毫升。然后，向细胞中加入新鲜的 ROCK 抑制剂，并将共培养物接种到涂有明胶的 150 毫米培养皿上。
要将食管细胞冷冻到零下 80 摄氏度储存，请移除饲养器并分离食管细胞，如刚才所示。接下来，将细胞转移到新的 50 毫升锥形管中进行离心，并以每 2 毫升冷冻培养基浓度 10 至 6 个细胞的 1 倍重新悬浮沉淀。然后，将 2 mL 细胞转移到每个预先标记的冻存管中，并将样品在零下 80 摄氏度下储存至少 24 小时，然后再将其移至长期液氮储存中。
上皮细胞集落将在大约 4 到 5 天内形成，并被成纤维细胞饲养细胞包围。随着这些殖民地的扩大，它们将与其他殖民地合并，形成更大的殖民地。一旦培养物达到 70% 汇合，就需要扩大它们。
去除饲养层细胞后，可以对贴壁上皮细胞进行胰蛋白酶消化并重新接种到新的辐照饲养层细胞上。通过 qRT-PCR 对这些细胞进行表型表征 6on 显示，与初始 biospy 样品相比，第一代结束时祖细胞标志物 P63 上调，表明细胞已被重编程为更祖细胞干样状态。当这些细胞转移到正常组织培养板中时，P63 表达降低，紧密连接蛋白 1 或 TJP1 和 E-钙粘蛋白表达增加，表明表型从祖细胞转移到分化程度更高的上皮细胞。
传代 1 后细胞的流式细胞术分析表明，超过 90% 的细胞也对 EpCAM 呈阳性。免疫荧光染色表明，细胞保留了其上皮标志物、祖细胞标志物、增殖标志物和上皮紧密连接蛋白表达。据计算，非患病患者的食管细胞倍增时间约为 36 至 40 小时，尽管患病细胞的倍增时间可能会更慢。
掌握后，这项技术应在大约一小时内完成。在尝试此程序时，请务必使用无菌技术以防止污染，并确保迅速工作以维持细胞活力。在此程序之后，可以进行其他检测，例如 transwell 培养，以评估哪些抗原导致食管炎症或发病机制。
开发后，该检测将为研究人员识别导致嗜酸性粒细胞性食管炎的触发抗原以及治疗这些患者的新治疗方案铺平道路。观看此视频后，您应该对如何从内窥镜活检中分离和扩增食管上皮细胞以用于研究食管疾病或生成 3D 模型有很好的了解。不要忘记，使用锋利的仪器和生物组织可能是危险的。
请务必妥善处理尖锐的器械，并采取良好的生物安全措施。
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概览
本文讨论了一种通过条件重编程扩增人类儿童食管上皮细胞的方法。这一技术允许生成可用于工程食管构造和治疗筛选的患者特异性细胞。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 组织工程
背景
- 患者来源的食管上皮细胞可以通过内窥镜活检获得。
- 这种方法有助于研究食管疾病和创建3D支架。
- 它不需要基因修饰，保持细胞纯度。
- 该技术对理解嗜酸性食管炎和食管闭锁有重要意义。
研究目的
- 扩增食管上皮细胞以用于疾病研究。
- 创建3D支架用于建模和组织替代。
- 增强对食管上皮细胞在疾病中的作用的理解。
使用的方法
- 食管上皮细胞的条件重编程。
- 内窥镜活检收集用于细胞来源。
- 3D支架开发用于组织建模。
- 培养后上皮细胞的纯化。
主要结果
- 成功扩增了患者特异性食管上皮细胞。
- 创建了可行的3D支架，用于潜在的植入。
- 对食管疾病的发病机制有了新的认识。
- 有可能开发新的食管疾病治疗方法。
结论
- 该方法提供了可靠的患者特异性细胞来源。
- 它增强了食管疾病理解的研究能力。
- 未来的应用可能会带来改进的治疗策略。
常见问题
Executive Industry Relevance
Conditional reprogramming of pediatric human esophageal epithelial cells enables scalable expansion of patient-specific primary cells for disease modeling and tissue engineering. This approach addresses the bottleneck of limited tissue availability and inefficient expansion, supporting translational research and preclinical pipeline continuity. The method enhances predictive confidence for therapeutic screening and construct seeding in esophageal disease portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of esophageal disease mechanisms using patient-derived epithelial cells.
- Supports functional target validation by preserving native cell phenotype during expansion.
- Facilitates mechanistic de-risking for esophageal disease triggers and pathways.
Screening & Assay Development
- Provides a reproducible source of primary epithelial cells for assay standardization.
- Enables quantitative readouts in antigen screening and inflammation assays.
- Supports scalability for high-content screening and downstream 3D model development.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant systems for modeling pediatric esophageal disorders.
- Enables continuity from discovery to preclinical validation using patient-matched cells.
- Supports risk-adjusted advancement of tissue-engineered constructs for implantation studies.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates from early discovery through preclinical research, enabling hypothesis testing, assay development, and translational modeling with patient-specific esophageal epithelial cells.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven investigation of esophageal disease mechanisms and antigen triggers.
- Screening: Delivers assay-ready, phenotypically stable epithelial cells for reproducible screening workflows.
- Analytics: Provides quantitative outputs via flow cytometry, qRT-PCR, and immunofluorescence for condition comparison.
- Translational Research: Maintains disease relevance for preclinical modeling and construct seeding.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for expanding primary epithelial cells across multiple studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in esophageal disease research.
- Operational Value: Standardizes cell expansion and characterization for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions for therapeutic and tissue engineering programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of disease models and engineered constructs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary cell culture and feeder cell management.
- Needs access to irradiation equipment and analytical platforms for cell characterization.
- Demands rigorous sterile technique and cross-team standardization for reproducibility.
- Adaptation may be needed for different patient samples or disease states.
- Feeder cell removal and cell purity are critical for downstream applications.
