Name: MitoCeption:转让人离MSC线粒体脑胶质瘤干细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: 学习MitoCeption技术将人间充质干细胞线粒体转移至胶质母细胞瘤干细胞，研究其对肿瘤细胞代谢和生物学功能的影响。该方法可独立评估线粒体效应，为癌症代谢研究提供新工具。

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我们感谢Andrea Parmeggiani（L2C和DIMNP，蒙彼利埃）、Benoit Charlot（IES，蒙彼利埃）以及实验室成员的有益讨论，感谢Christophe Duperray在FACS分析方面的协助，感谢蒙彼利埃RIO影像平台（MRI）为FACS和共聚焦显微镜提供适宜的环境。B.N.M.获得LabEx Numev（合同号ANR-10-LABX-20）研究生奖学金的支持。A.B.获得华沙大学和欧洲联盟本科奖学金的支持（n&#176; POKL.04.01.02-00-221/12）。M.L.V. 是法国国家科学研究中心（CNRS）的科研人员。

第1天
1. 间充质干细胞（MSC）线粒体的标记（可选）
<ol>
	<li>在线粒体制备前两天，将人源MSCs接种于100 mm培养皿中，加入10 ml含10%胎牛血清的αMEM培养基，使第1天培养的MSCs数量达到4 × 105个。</li>
	<li>用4 ml PBS洗涤MSCs，然后加入4 ml预热至37 °C的含1%胎牛血清的αMEM培养基。</li>
	<li>加入适量的线粒体活体染料，将细胞置于37 °C培养箱中孵育30分钟。</li>
	<li>移除线粒体染料溶液，用4 ml预热（37 °C）的含1%胎牛血清的αMEM培养基洗涤细胞两次，再加入4 ml含10%胎牛血清的αMEM培养基，于37 °C继续孵育细胞。</li>
	<li>在30分钟后更换培养基（10 ml含10%胎牛血清的αMEM培养基），并在2小时后再次更换一次。</li>
</ol>
第1天
2. 胶质母细胞瘤干细胞（GSC）的标记（可选，参见讨论部分）
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>细胞培养基</td>
			<td>成分</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="5">GSC 基础培养基&#160;</td>
			<td>DMEM/F-12 添加以下成分：&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>胰岛素 20 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 添加剂 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>葡萄糖 3 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-谷氨酰胺 2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="9">GSC 增殖培养基</td>
			<td>在基础培养基中添加：&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 添加剂 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF 10 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF 10 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>两性霉素B 10 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>制霉菌素 0.25 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>肝素 2 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>环丙沙星 2 μg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>庆大霉素 2 μg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="4">MSC 增殖培养基&#160;</td>
			<td>αMEM 添加以下成分：</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-谷氨酰胺 2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% 胎牛血清（FBS）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF 2 ng/ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：培养基。
<ol>
	<li>解离在聚羟乙基甲基丙烯酸酯（poly-HEMA）包被的细胞培养瓶中生长的GSCs（Gb4细胞系，32，10 × 106 个细胞），培养形式为神经球（参见步骤3.1至3.12）。</li>
	<li>将GSCs以每孔105个细胞的密度接种于48孔板中，每孔加入500 µl GSC增殖培养基（见表1）。</li>
	<li>在20 °C下，以270 × g离心5分钟。</li>
	<li>加入所需量的细胞活体染料，并在37 °C下孵育30分钟。</li>
	<li>向48孔板的每孔中加入500 µl GSC基础培养基（表1）。</li>
	<li>在20 °C下，以270 × g离心5分钟，吸除上清液。</li>
	<li>重复步骤2.5至2.6。</li>
	<li>每孔加入500 µl GSC基础培养基，并在37 °C下孵育30分钟。</li>
	<li>在20 °C下，以270 × g离心5分钟，吸除上清液。</li>
	<li>向48孔板的每孔中加入500 µl GSC增殖培养基，并置于37 °C培养箱中孵育。 
	注意：所指示的GSCs数量（10 × 106 个细胞）足以进行不同的剂量-反应实验和FACS对照。一旦实验条件更明确，可减少该细胞用量。</li>
</ol>
第2天
3. 胶质母细胞瘤干细胞的接种
<ol>
	<li>在50 ml离心管中，以270 × g、20 °C离心5分钟，收集GSC神经球（10 × 106个细胞）。</li>
	<li>用5 ml HBSS洗涤细胞，并在20 °C下以270 × g离心5分钟。</li>
	<li>吸除上清液。</li>
	<li>每10 × 106个细胞，用100 µl胰蛋白酶-EDTA（0.25%）轻柔重悬GSC沉淀。</li>
	<li>在37 °C孵育3分钟。</li>
	<li>加入10 µl CaCl2（20 mM）和2 µl DNase I（10 mg/ml）。</li>
	<li>使用P200移液器轻轻吹打30–50次，使神经球解离。避免产生气泡。在显微镜下检查，确保所有GSC均已解离。</li>
	<li>加入10 µl胰蛋白酶抑制剂（5%）和10 ml HBSS。</li>
	<li>在20 °C下以270 × g离心GSC 7分钟。</li>
	<li>弃去上清液，加入10 ml GSC基础培养基（表1）。</li>
	<li>使用Thoma计数板对GSC进行计数，然后在20 °C下以270 × g离心7分钟。</li>
	<li>加入适量GSC增殖培养基（表1），使细胞浓度达到106个GSC/ml。</li>
	<li>每孔96孔板接种105个GSC（100 µl细胞悬液）。</li>
	<li>将96孔板在20 °C下以270 × g离心7分钟，使GSC沉降至孔底。</li>
	<li>将96孔板在37 °C孵育，直至第5节实验步骤。</li>
</ol>
第2天
4. 间充质干细胞线粒体的分离
<ol>
	<li>将微量离心管离心机的温度调节至 4 °C。</li>
	<li>准备两个 1.5 ml 离心管，分别标记为&#34;A&#34;和&#34;C&#34;，其中分别加入线粒体提取试剂（200 µl 试剂 A 和 400 µl 试剂 C，均含有不含 EDTA 的蛋白酶抑制剂）。另准备两个标记为&#34;MSC&#34;和&#34;Mito&#34;的离心管。所有离心管均置于冰上。同时准备用于线粒体系列稀释的离心管。</li>
	<li>用 10 ml 预热至 37 °C 的 PBS 洗涤 MSCs。</li>
	<li>用 2 ml 不含 EDTA 的胰蛋白酶洗涤 MSCs 10 秒，然后加入 1 ml 不含 EDTA 的胰蛋白酶。在 37 °C 下孵育细胞 5–10 分钟。</li>
	<li>加入 10 ml αMEM/FBS 10% 收集 MSCs，并转移至 50 ml 离心管中。</li>
	<li>在 20 °C 下以 270 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>弃去上清液，并向细胞沉淀中加入 10 ml αMEM/FBS 10%。</li>
	<li>使用 Malassez 血细胞计数板对 MSCs 进行计数。</li>
	<li>将 MSCs（4–5 × 105）在 20 °C 下以 270 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>弃去上清液，向细胞沉淀中加入 1 ml 冰冷的 αMEM/FBS 10%，并将细胞转移至步骤 4.2 中准备的标记为&#34;MSC&#34;的离心管中。将离心管置于冰上。</li>
	<li>在 4 °C 下以 900 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>彻底去除管中残留的培养基。</li>
	<li>加入 200 µl 线粒体分离试剂 A（含不含 EDTA 的蛋白酶抑制剂）。以中等速度涡旋振荡 5 秒，然后将离心管准确置于冰上静置 2 分钟。</li>
	<li>加入 2.5 µl 线粒体分离试剂 B。以最高速度涡旋振荡 10 秒，然后将离心管放回冰上。每 30 秒重复一次，持续 5 分钟。</li>
	<li>加入 200 µl 线粒体分离试剂 C（含不含 EDTA 的蛋白酶抑制剂）。通过倾斜离心管混合（约 30 次，切勿涡旋振荡）。在 4 °C 下以 700 × g 离心 10 分钟。</li>
	<li>将上清液（含 MSC 线粒体）转移至步骤 4.2 中准备的标记为&#34;Mito&#34;的离心管中。</li>
	<li>在 4 °C 下以 3,000 × g 离心 15 分钟，以获得线粒体沉淀。弃去上清液。沉淀即为分离的线粒体。</li>
	<li>用 200 µl 试剂 C 冲洗线粒体沉淀。然后在 4 °C 下以 12,000 × g 离心 5 分钟，以获得线粒体沉淀。</li>
</ol>
5. 分离的间充质干细胞线粒体向胶质瘤干细胞的转移（MitoCeption）
<ol>
	<li>向从MSCs（4 × 105）中分离得到的线粒体沉淀中加入200 µl预冷（0 °C）的GSC增殖培养基。</li>
	<li>将线粒体制备物（溶于GSC增殖培养基中）进行稀释，以确保向GSCs中恒定加入20 µl线粒体悬液。</li>
	<li>将分离得到的线粒体按所需浓度（0.1 至 10 µg）加入含有GSCs（来自步骤3.15）的96孔板孔中。加样时应缓慢靠近孔底，至少覆盖整个孔底表面一次。</li>
	<li>为控制MSC线粒体活力染料的泄漏，将相同量的线粒体制备物（0.1 至 10 µg）加入仅含GSC增殖培养基（不含GSCs）的96孔板孔中（活力染料泄漏检测见第6.2部分）。</li>
	<li>将含有接受线粒体的GSCs及MSC线粒体的96孔板（步骤5.3）以及对照板（步骤5.4）在4 °C下以1,500 × g离心15分钟。</li>
	<li>离心后立即将培养板放入37 °C细胞培养箱中。 
	注意：线粒体转移方案依赖于在线粒体供体/受体细胞系统中，以适当的离心力将线粒体悬液离心至培养细胞表面，离心次数可根据具体细胞系统进行调整。</li>
</ol>
第3天
6. 通过流式细胞术和共聚焦成像分析线粒体转移
<ol>
	<li>用于FACS分析的GSC样本制备 
	注意：如果MSC线粒体在之前已用活体染料标记（第1节），则可在线粒体转移24小时后通过FACS监测其效率。
	<ol>
		<li>将含有MitoCepted GSCs的96孔板在20 °C下以270 × g离心5分钟。</li>
		<li>弃去上清液。</li>
		<li>每孔加入100 µl胰蛋白酶（不含EDTA），在37 °C孵育3分钟。用移液器吹打数次，以解离24小时内形成的神经球。</li>
		<li>加入100 µl GSC基础培养基。</li>
		<li>将96孔板在20 °C下以270 × g离心5分钟，并弃去上清液。</li>
		<li>将GSCs重悬于300 µl GSC基础培养基中，并转移至适用于FACS的试管中。</li>
		<li>进行FACS分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>线粒体活体染料从分离线粒体中泄漏的对照实验（FACS） 
	注意：此步骤的目的是确定FACS背景信号，该信号并不代表真正的MSC线粒体转移，而仅仅是由于用于MitoCeption的标记MSC线粒体中活体染料的泄漏所致（步骤5.3）。
	<ol>
		<li>按照步骤3.1至3.15所述方法接种GSC细胞。</li>
		<li>在37 °C孵育细胞1小时。</li>
		<li>将仅含线粒体的96孔板（来自步骤5.4至5.6）在20 °C下以1,500 × g离心5分钟。</li>
		<li>吸去GSC 96孔板（步骤6.2.2）中的培养基，并替换为仅与线粒体孵育过的培养基（步骤6.2.3的上清液）。</li>
		<li>将含有GSCs的96孔板在37 °C孵育2小时。</li>
		<li>按照步骤6.1.1至6.1.7进行FACS分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用于共聚焦成像的GSC样本制备 
	注意：若需通过荧光成像分析MSC线粒体向GSCs的转移，则需事先分别使用线粒体（步骤1）和细胞（步骤2）活体染料对MSCs和GSCs进行标记。
	<ol>
		<li>按照步骤6.1.1至6.1.5的方法制备GSCs。</li>
		<li>将GSCs重悬于2 ml含2% FBS的GSC增殖培养基中，并接种至35 mm培养皿（玻璃底）中。</li>
		<li>24小时后，对携带转移荧光MSC线粒体的GSCs进行共聚焦成像。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

C.J. 和 M-L.V. 所属的法国国家健康与医学研究院（INSERM）已就 MitoCeption 技术提交了专利申请（EP14306154.7）。

越来越多的研究表明，细胞之间可以交换线粒体，而这些线粒体对受体细胞的代谢和功能具有深远影响。因此，掌握将线粒体从供体细胞定量转移至受体细胞的技术至关重要，这有助于准确研究其生物学效应。
本方案最初设计用于将人源间充质干细胞中分离的线粒体转移至贴壁生长的癌细胞系 MDA-MB-231 33如图所示，该方法可适用于以神经球形式生长的肿瘤干细胞 体外尽管当间充质干细胞的线粒体被添加至胶质瘤干细胞神经球时确实会发生线粒体转移，但如本方案所述，该过程在单细胞状态的胶质瘤干细胞中效率更高。本方案也可推广至其他非贴壁细胞（如T细胞），但需针对MitoCeption步骤调整接种细胞浓度。
线粒体的制备应在冰上进行，以保持其完整性。为了获得细胞质化合物污染较少的线粒体制剂，采用3,000 × g离心15分钟以回收线粒体。为了监测用于向GSCs转移的MSC线粒体用量，需测定线粒体的蛋白含量。为此，使用添加了蛋白酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液制备线粒体蛋白提取物。按照制造商的说明，采用...

线粒体是存在于真核细胞中的细胞器，在营养摄取以及能量和代谢物生成中发挥核心作用。这些细胞器含有环状的线粒体DNA（mtDNA），长度为16.6 kb，编码电子传递链复合物的蛋白质、tRNA和rRNA1。这些细胞器的功能对细胞稳态至关重要，多种病理状况已被证实与线粒体功能障碍相关1,2,3。例如，线粒体状态已被证实与炎症、感染性疾病和癌症相关，在癌症中尤其影响转移及治疗耐药性4,5,6,7。
线粒体具有在&#34;供体&#34;与&#34;靶细胞&#34;之间转移的显著能力。这种转移会导致靶细胞的能量代谢发生变化，以及其他功能改变，例如组织修复能力及对化疗药物的耐受性增强，这一点已被多个实验室近期的研究证实8,9,10,11,12,13,14,15,16。人类间充质干细胞（MSCs）具备将线粒体转移至多种靶细胞的能力，这些靶细胞包括心肌细胞、内皮细胞、肺泡上皮细胞、肾小管上皮细胞以及肿瘤细胞，从而改变这些细胞的功能特性8,9,10,12,17,18。
线粒体交换现已被认为是一种广泛存在的机制，可使多种不同类型的细胞相互交流并改变其生物学特性。这种线粒体交换可通过形成隧道纳米管（TNT）实现，该过程涉及含连接蛋白43（connexin 43）的间隙连接8，或由M-Sec/TNFaip2与胞吐复合物（exocyst complex）介导19。此外，研究也发现线粒体转移可由含抑制蛋白结构域蛋白1（arrestin domain-containing protein 1）介导的微囊泡（ARMMs）所介导20。有趣的是，线粒体转移的效率与Rho GTP酶1 MIRO1的表达水平相关21，这一关键因子可用于解释iPSC-MSCs与成体BM-MSCs之间线粒体转移效率差异的原因22。
尽管已有大量关于细胞间线粒体交换的数据，但对这种线粒体转移的代谢和生物学后果仍知之甚少。因此，建立适当的工具以全面评估该转移的生物学效应显得尤为必要。多年来，已提出多种将线粒体从供体细胞转移至受体细胞的技术方法，包括将线粒体直接注射到卵母细胞中23,24,25、通过细胞融合生成线粒体异质细胞（transmitochondrial cybrids）26,27 ，以及近年来利用光热纳米刀（photothermal nanoblades）转移分离的线粒体28。
我们及其他研究者此前已证实，分离的线粒体可被活细胞摄取，这一点在体外和体内均已被观察到 体外 和 体内 29,30,31，通过拟议的巨胞饮作用机制 32我们进一步开发了一种名为MitoCeption的方法，可将分离的线粒体（来自MSCs）定量转移至靶细胞，以贴壁生长的MDA-MB-231乳腺癌细胞系为例进行了示范 31本方案在此针对分离的人源MSC线粒体向胶质母细胞瘤干细胞（GSCs）的转移进行了优化。
胶质母细胞瘤是一种侵袭性极强的脑部恶性肿瘤，由于肿瘤内存在的胶质母细胞瘤干细胞（GSC），会迅速产生治疗耐药性 33这些GSC以神经球形式生长 体外 在异种移植模型中形成肿瘤。胶质母细胞瘤中的癌细胞具有细胞间连接的能力，这一点最近在星形细胞脑肿瘤细胞中得到证实：这些细胞通过延伸的微管相互连接，线粒体（以及钙离子和细胞核）可在其中迁移，从而形成对放射治疗具有抵抗性的星形细胞瘤网络 34胶质母细胞瘤能够募集肿瘤微环境中的多种不同细胞，包括间充质干细胞（MSCs） 35,36我们发现，间充质干细胞（MSCs）在共培养条件下能够与胶质瘤干细胞（GSCs）形成细胞间连接，并向其转移线粒体（数据未显示），这有望改变GSC的功能特性。本方案描述了如何利用MitoCeption技术，将预先从人源MSCs中分离的线粒体转移至人源GSCs，以评估其功能性的生物学效应。多能性高且具有强致瘤性的Gb4 GSC细胞系 37 在本研究中使用。

<table><tbody><tr><td>组织线粒体分离试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>10579663</td><td></td></tr><tr><td>N-2 补充剂（100 倍浓缩）</td><td>Fisher Scientific</td><td>11520536</td><td></td></tr><tr><td>B-27 补充剂（不含维生素 A，50 倍浓缩）</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>11500446</td><td></td></tr><tr><td>不含钙的HBSS&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 不含 Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td><td>&amp;nbsp;Sigma</td><td>H4385</td><td></td></tr><tr><td>多聚血红素&amp;nbsp;</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>P3932</td><td></td></tr><tr><td>不含谷氨酰胺的aMEM</td><td>Ozyme</td><td>BE12-169F</td><td></td></tr><tr><td>不含谷氨酰胺的DMEM/F-12培养基</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>11540566</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen&amp;nbsp;</td><td>25030-024&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖&amp;nbsp;</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素&amp;nbsp;</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>I 1882&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>人类&amp;nbsp;bFGF&amp;nbsp;</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>人表皮生长因子&amp;nbsp;</td><td>Peprotech&amp;nbsp;</td><td>AF-100-15&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>肝素</td><td>Sigma</td><td>H3149&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>默克</td><td>2382</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶抑制剂</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>T9003</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>SIGMA&amp;nbsp;</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>0.25% 胰蛋白酶 / EDTA 1&amp;nbsp;mM</td><td>Invitrogen&amp;nbsp;</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>15090-046</td><td></td></tr><tr><td>不含EDTA的蛋白酶抑制剂</td><td>Sigma</td><td>4693159001</td><td></td></tr><tr><td>环丙沙星&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>17850-5G-F</td><td></td></tr><tr><td>真菌素&amp;nbsp;</td><td>Invivogen</td><td>ant-fn-1</td><td></td></tr><tr><td>两性霉素B&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15290018</td><td></td></tr><tr><td>庆大霉素</td><td>Euromedex</td><td>EU0410</td><td></td></tr><tr><td>MitoTracker Green FM</td><td>分子探针</td><td>M7514</td><td></td></tr><tr><td>MitoTracker Red CMXRos</td><td>分子探针</td><td>&amp;nbsp;M7512</td><td></td></tr><tr><td>MitoTracker Deep Red FM</td><td>分子探针</td><td>&amp;nbsp;M22426&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Green CMFDA</td><td>分子探针</td><td>C7025</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Blue CMF2HC</td><td>分子探针</td><td>C12881</td><td></td></tr><tr><td>RIPA</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-24948</td><td></td></tr><tr><td>FluoroDish 无菌培养皿</td><td>世界精密仪器公司</td><td>FD35-100</td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>Fisher Scientific</td><td>267110</td><td></td></tr><tr><td>FACS 管</td><td>贝克曼库尔特</td><td>2,523,749</td><td></td></tr><tr><td>FACS 仪器</td><td>Gallios&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;3L 10C</td><td></td></tr><tr><td>LC FAST START DNA MASTER PLUS&amp;nbsp;</td><td>罗氏</td><td>3515885001</td><td></td></tr></tbody></table>

mitoception：将分离的人源msc线粒体转移至胶质母细胞瘤干细胞

MitoCeption: Transferring Isolated Human MSC Mitochondria to Glioblastoma Stem Cells

线粒体在细胞代谢、能量生成以及凋亡调控中发挥核心作用。线粒体功能异常已被证实与多种疾病相关，范围涵盖神经系统疾病到癌症。有趣的是，最近研究发现线粒体具有在不同类型细胞之间转移的能力，尤其是在共培养条件下，可从人源间充质干细胞（MSC）转移至癌细胞，从而对接受线粒体的细胞产生代谢和功能上的影响，这进一步提升了人们对这些细胞器生物学特性的关注。
评估从间充质干细胞（MSC）转移至靶细胞的线粒体对靶细胞的影响，对于理解此类细胞间相互作用的生物学效应至关重要。本文所述的MitoCeption技术，可将预先从供体细胞中分离的线粒体转移至靶细胞，本方案以MSC来源的线粒体与胶质母细胞瘤干细胞（GSC）作为模型系统。此前，该技术已成功用于将从MSC中分离的线粒体转移至贴壁生长的MDA-MB-231癌细胞。本研究对该线粒体转移方案进行了优化，以适用于具有神经球样生长特性的GSC。 体外可通过荧光激活细胞分选（FACS）和共聚焦成像结合线粒体活体染料来追踪分离线粒体的转移。利用具有不同单倍型（SNPs）的线粒体供体细胞和靶细胞，还可根据转移线粒体的环状线粒体DNA（mtDNA）在靶细胞中的浓度来检测其转移情况。在通过上述标准验证该实验方案后，可进一步分析携带转移线粒体的细胞，以确定外源性线粒体对细胞代谢、可塑性、增殖能力及治疗反应等生物学特性的影响。

从间充质干细胞（MSC）中分离线粒体，并通过MitoCeption技术将线粒体转移至靶向的胶质母细胞瘤干细胞（GSC）的操作步骤如图1所示。GSC是具有干细胞特性的肿瘤干细胞，以神经球形式培养以维持其干细胞特性。在本实验方案中，为提高线粒体转移效率（参见流式细胞术数据图3B），在进行线粒体转移（步骤3）前数小时，需将GSC以单细胞形式接种。在第5节操作后（第3天），这些细胞再次呈现为形成神经球的状态（图1）。
在Gb4 GSCs接受荧光标记的MSC线粒体进行MitoCeption处理72小时后，对其进行成像显示，MSC来源的线粒体已定位于Gb4 GSCs内部，共聚焦显微镜获取的正交视图证实了这一点（图2B）。转移的MSC线粒体在GSCs中呈广泛分布，这与内源性GSC线粒体的分布模式一致（图2A</str...

本文介绍了一种线粒体转移方案（MitoCeption），旨在将从人源间充质干细胞（MSC）中分离的线粒体转移至胶质母细胞瘤干细胞（GSC），以研究其对GSC代谢和功能的生物学影响。该方案可经适当调整后用于其他细胞类型间的线粒体转移。

MitoCeption：将分离的人源MSC线粒体转移至胶质母细胞瘤干细胞

线粒体在细胞代谢、能量生成和凋亡调控中发挥核心作用。研究发现，线粒体功能异常与多种疾病相关……

本实验的总体目标是将先前分离的线粒体从供体细胞（如间充质干细胞）转移至靶细胞（如胶质母细胞瘤干细胞）。该实验方法有助于回答代谢领域中的关键科学问题，例如通过隧道纳米管或微囊泡等机制在线粒体自发转移过程中所产生的代谢与生物学效应。该技术的主要优势在于，可独立于微环境中存在的其他因素（如细胞因子或代谢物）以及隧道纳米管中可能同时转运的其他化合物，单独评估线粒体自身的作用效应。为了成像目的，可在通过MitoCeption进行线粒体转移前，使用活细胞染料对MSC线粒体和GSC进行标记。首先，根据文本方案用活细胞染料对GSC进行预标记后，于20摄氏度下以270 × g离心5分钟，将GSC神经球收集至50毫升离心管中。用5毫升HBSS洗涤细胞，并再次离心。吸弃上清液，加入100微升0.25%胰蛋白酶-EDTA，轻轻重悬GSC沉淀。然后将细胞在37摄氏度孵育3分钟。接着，向管中加入10微升20毫摩尔氯化钙，并加入2微升浓度为10毫克/毫升的DNase I。使用 P200 移液器轻轻吹打神经球 30 至 50 次，使其解离，注意避免产生气泡。向细胞中加入 10 微升 5% 胰蛋白酶抑制剂（溶于 10 毫升 HBSS 中），将 GSC 离心 7 分钟。然后弃去上清液，并向样品中加入 10 毫升 GSC 基础培养基。现在，使用血球计数板在再次离心前对细胞进行计数。加入适量的GSC增殖培养基，使细胞浓度达到每毫升含10⁶个GSC。然后每96孔板每孔接种10⁵个GSC。离心培养板，使精原干细胞（GSCs）沉降至孔底。在显微镜下观察细胞。随后将培养板置于37°C条件下孵育。为进行间充质干细胞线粒体分离，首先将微量离心机的温度调节至四摄氏度。准备两个分别标记为 A 和 C 的 1.5 毫升离心管，管内含有用于线粒体提取的试剂。另准备两个标记为 MSC 和 MiTo 的离心管。将离心管置于冰上。同时准备用于线粒体系列稀释的离心管，稀释将使用线粒体制备物进行。用10毫升预热至37摄氏度的PBS洗涤MSCs。然后用2 mL不含EDTA的胰蛋白酶洗涤细胞10秒，并额外加入1 mL胰蛋白酶，在37°C条件下孵育5至10分钟。根据方案要求应避免使用EDTA，特别是在间充质干细胞（MSC）的胰蛋白酶消化以及线粒体提取过程中所用的蛋白酶抑制剂时。加入10 mL含10%胎牛血清（FBS）的Alpha MEM培养基终止消化，收集MSC细胞，并将细胞悬液转移至50 mL离心管中。然后离心细胞。弃去上清液，并向细胞沉淀中加入10毫升含10%胎牛血清的Alpha MEM培养基。随后使用Malassez计数板对间充质干细胞（MSCs）进行计数，然后离心沉淀4至5 × 10⁵个细胞。弃去上清液，向细胞沉淀中加入1毫升预冷的含10% FBS的Alpha MEM培养基，将细胞转移至预先准备好的标记为MSC的离心管中，并始终保持在冰上。随后，将MSC离心管在4°C、900 × g条件下离心5分钟，并彻底去除管中残留的培养基。接着，向MSC中加入200微升含无EDTA蛋白酶抑制剂的线粒体分离试剂A，中速涡旋振荡5秒。然后将离心管置于冰上，精确放置两分钟。加入2.5微升线粒体分离试剂B，以最大速度涡旋振荡细胞10秒，随后将离心管再次放回冰上。每30秒重复涡旋一次，持续5分钟。现在，向管中加入 200 µL 含无 EDTA 蛋白酶抑制剂的线粒体分离试剂 C，通过倾斜试管约 30 次混匀管内物质。在 4 °C 条件下以 700 × g 离心 10 分钟。将含有 MSC 线粒体的上清液转移至预先准备好的 MiTo 管中。在4 °C条件下，以3,000 × g离心样品15分钟。弃去上清液后，用200 µL试剂C冲洗线粒体沉淀。然后在4 °C条件下，以12,000 × g离心5分钟，使细胞器沉淀。为了将分离的间充质干细胞（MSC）线粒体转移至胶质瘤干细胞（GSC）中，向线粒体沉淀中加入200微升预冷的GSC增殖培养基。用GSC增殖培养基稀释线粒体制备物，以便始终向GSC中加入20微升线粒体悬液。接着，缓慢将线粒体加至孔板底部附近。为防止间充质干细胞线粒体活力染料泄漏，将等量的线粒体样品加入仅含有胶质瘤干细胞增殖培养基的96孔板孔中。将培养板在4°C条件下以1,500 × g离心15分钟，随后立即将培养物置于37°C环境中。第二天，为分析活力染料渗漏的对照孔，按前述方法接种GSC细胞，离心培养板，然后在37°C下孵育培养物1小时。离心仅含有线粒体的96孔板。随后吸出GSC 96孔板中的培养基，并替换为线粒体上清液。将GSCs与线粒体上清液在37摄氏度下孵育两小时。最后，根据文本方案进行线粒体转移分析、流式细胞术分析和共聚焦成像。GSCs是作为神经球培养的肿瘤干细胞，以维持其干细胞特性。在线粒体转移前，将细胞以单细胞形式接种，以实现较高的线粒体转移效率；如图所示，次日可再次观察到细胞形成神经球。在本图中，可见荧光标记的间充质干细胞（MSC）线粒体定位于Gb4 GSC细胞内。MSC的线粒体分布于GSC细胞中，其分布模式与GSC自身的线粒体相似。通过胶质瘤干细胞（GSC）的共聚焦图像进行三维重建，可观察到大多数GSC中MSC线粒体的转移，从而证实了转移的MSC线粒体在细胞间的定位。预先用蓝色细胞活体染料和红色线粒体活体染料标记GSC，可直观显示转移的MSC线粒体（绿色）相对于内源性GSC线粒体的定位情况。如图所示，随着MitoCeption过程中荧光标记的MSC线粒体用量增加，流式细胞术（FACS）信号相应增强，且信号强度比对照组高出数个数量级。本文所述在线粒体转移实验中，对单细胞状态的GSCs进行操作，结果显示了剂量依赖性反应和相对平均荧光强度。最后，尽管在GSC神经球中也实现了MSC线粒体的转移，但在这些条件下，与先将GSCs以单细胞形式接种后再进行线粒体转移相比，其转移效率较低。一旦掌握该技术，若操作得当，可在三小时内完成。在进行该实验操作时，必须始终注意将线粒体样品置于冰上。完成这些步骤后，可进一步采用其他方法，如流式细胞术（FACS）、共聚焦显微镜观察、线粒体DNA的定量PCR（QPCR），以观察并定量间充质干细胞（MSC）向靶细胞的线粒体转移。此外，还可开展功能学研究，以确定所转移线粒体的生物学效应。请注意，这些研究通常使用的线粒体量要少于用于观察线粒体转移的量。该技术将有助于探究在正常生理或病理条件下细胞间自发转移的线粒体所产生的结果及其生物学效应，从而推动新型治疗策略的开发。

mitoception-transferring-isolated-human-msc-mitochondria-to

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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利用癌细胞系生成线粒体杂交细胞

本文介绍了一种实验方案，包括线粒体示踪、间充质干细胞（MSCs）与视网膜色素上皮细胞（ARPE19）的直接共培养操作，以及观察和统计分析隧道纳米管（TNT）形成和线粒体转移的方法，用于表征MSCs与ARPE19细胞之间通过隧道纳米管进行的线粒体交换。...

间充质干细胞与视网膜色素上皮细胞间通过隧道纳米管进行线粒体转移的体外研究

脑类器官是研究线粒体脑肌病、乳酸酸中毒及中风样发作（MELAS）的宝贵模型，有助于揭示其潜在的病理生理机制，并为药物筛选提供平台。源自携带不同异质性水平致病基因细胞系的类器官表现出显著的表型差异。...

利用脑类器官模拟线粒体疾病：聚焦线粒体脑肌病、乳酸酸中毒及卒中样发作

人类胚胎干细胞（ES细胞）的传代培养

许多组织培养操作需要了解活细胞的精确数量。本实验方案描述了如何区分活细胞与死细胞，并使用血细胞计数板对细胞进行定量。尽管本方案以人神经干细胞/前体细胞（hNSPCs）的计数为例，但也可适用于其他类型的细胞。...

计数人类神经干细胞

学习MitoCeption技术将人间充质干细胞线粒体转移至胶质母细胞瘤干细胞，研究其对肿瘤细胞代谢和生物学功能的影响。该方法可独立评估线粒体效应，为癌症代谢研究提供新工具。

MitoCeption：将分离的人源MSC线粒体转移至胶质母细胞瘤干细胞

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