MitoCeption：将分离的人源MSC线粒体转移至胶质母细胞瘤干细胞

本实验的总体目标是将先前分离的线粒体从供体细胞（如间充质干细胞）转移至靶细胞（如胶质母细胞瘤干细胞）。该实验方法有助于回答代谢研究领域中的关键问题，例如通过隧道纳米管或微囊泡等机制在线粒体自发转移过程中所产生的代谢和生物学效应。该技术的主要优势在于，可独立于微环境中存在的其他因素（如细胞因子或代谢物）以及隧道纳米管中可能同时转运的其他化合物，单独评估线粒体的作用。

为了成像目的，可在通过MitoCeption进行线粒体转移前，使用活细胞染料对MSC线粒体和GSC进行标记。首先，根据文本方案用活细胞染料对GSC进行预标记后，于20摄氏度下以270 × g离心5分钟，将GSC神经球收集至50毫升离心管中。用5毫升HBSS洗涤细胞，并再次离心。

吸弃上清液，加入100微升0.25%胰蛋白酶-EDTA，轻轻重悬GSC沉淀。然后将细胞在37摄氏度孵育3分钟。接着，向管中加入10微升20毫摩尔氯化钙，并加入2微升浓度为10毫克/毫升的DNase I。

使用P200移液枪轻轻吹打神经球30至50次，使其解离，注意避免产生气泡。向细胞中加入10微升5%胰蛋白酶抑制剂（溶于10毫升HBSS中），将GSC离心7分钟。弃去上清液后，向样品中加入10毫升GSC基础培养基。

现在，使用血球计数板在再次离心前对细胞进行计数。加入适量的GSC增殖培养基，使细胞浓度达到每毫升含10⁶个GSC。然后每96孔板每孔接种10⁵个GSC。

离心培养板，使精原干细胞（GSCs）沉降至孔底。在显微镜下观察细胞。随后将培养板置于37°C孵育。

为进行间充质干细胞线粒体分离，首先将微量离心机的温度调节至四摄氏度。准备两个分别标记为 A 和 C 的 1.5 毫升离心管，管内含有用于线粒体提取的试剂。另准备两个标记为 MSC 和 MiTo 的离心管。

将离心管置于冰上。同时准备用于线粒体系列稀释的离心管，这些稀释将使用线粒体制剂进行。用10毫升预热至37°C的PBS洗涤MSCs。

然后用2 mL不含EDTA的胰蛋白酶洗涤细胞10秒，并额外加入1 mL胰蛋白酶，随后将细胞在37°C孵育5至10分钟。根据方案要求应避免使用EDTA，特别是在间充质干细胞（MSC）的胰蛋白酶消化以及线粒体提取过程中所用的蛋白酶抑制剂时。加入10 mL含10%胎牛血清（FBS）的Alpha MEM培养基终止消化，收集MSC细胞，并将细胞悬液转移至50 mL离心管中。

然后离心细胞。弃去上清液，并向细胞沉淀中加入10毫升含10%胎牛血清的Alpha MEM培养基。随后使用Malassez计数板对间充质干细胞（MSCs）进行计数，然后离心沉淀4至5 × 10⁵个细胞。

弃去上清液，向细胞沉淀中加入1毫升预冷的含10%胎牛血清的Alpha MEM培养基，并将细胞转移至预先准备好的标记为MSC的离心管中，期间始终保持管子置于冰上。随后，将MSC离心管在4°C条件下以900 × g离心5分钟，并彻底移除管内所有残留培养基。接下来，向MSC细胞中加入200微升不含EDTA的蛋白酶抑制剂的线粒体分离试剂A，中速涡旋振荡5秒。

然后将离心管置于冰上，精确放置两分钟。加入2.5 µL线粒体分离试剂B，以最大速度涡旋振荡10秒，随后将离心管放回冰上。每30秒重复涡旋一次，持续5分钟。

现在，向管中加入 200 µL 含无 EDTA 蛋白酶抑制剂的线粒体分离试剂 C，通过倾斜试管约 30 次混匀管内物质。在 4 °C 条件下以 700 × g 离心 10 分钟。将含有 MSC 线粒体的上清液转移至先前准备好的 MiTo 管中。

在4 °C条件下，以3,000 × g离心样品15分钟。弃去上清液后，用200 µL试剂C冲洗线粒体沉淀。然后在4 °C条件下，以12,000 × g离心5分钟，使细胞器沉淀。

为了将分离的MSC线粒体转移至GSCs，向线粒体沉淀中加入200微升预冷的GSC增殖培养基。用GSC增殖培养基稀释线粒体制备物，以确保始终可向GSCs中加入20微升线粒体悬液。接着，缓慢将线粒体加至孔板底部附近。

为防止间充质干细胞线粒体活力染料泄漏，将等量的线粒体悬液加入仅含神经干细胞增殖培养基的96孔板孔中。将培养板在4°C条件下以1,500 × g离心15分钟，随后立即将培养物置于37°C环境中。

第二天，为分析活力染料渗漏的对照孔，按前述方法接种GSC细胞，离心培养板，然后在37摄氏度下孵育培养物一小时。离心仅含有线粒体的96孔板。随后吸出GSC 96孔板中的培养基，并替换为线粒体上清液。

将GSCs与线粒体上清液在37摄氏度下孵育两小时。最后，根据文本方案进行线粒体转移分析、流式细胞术分析和共聚焦成像。GSCs是作为神经球培养的肿瘤干细胞，以维持其干细胞特性。

在线粒体转移之前，将细胞以单细胞形式接种，以实现较高的线粒体转移效率；如图所示，次日再次观察到细胞形成神经球。在该图中，可见荧光标记的间充质干细胞（MSC）线粒体定位于Gb4 GSC细胞内。MSC的线粒体分布于GSC细胞中，形态与GSC自身的线粒体相似。

通过胶质瘤干细胞（GSC）的共聚焦图像进行三维重建，可观察到大多数GSC中MSC线粒体的转移，从而证实了转移的MSC线粒体在细胞间的定位。预先用蓝色细胞活体染料和红色线粒体活体染料标记GSC，可直观显示转移的MSC线粒体（绿色）相对于内源性GSC线粒体的定位情况。如图所示，随着MitoCeption过程中加入的荧光标记MSC线粒体数量增加，流式细胞术（FACS）信号也随之增强，且信号强度比对照组高出数个数量级。

本文所述在线粒体转移实验中，对单细胞GSCs进行操作时表现出剂量依赖性反应和相对平均荧光强度。最后，尽管在GSC神经球中也实现了MSC线粒体的转移，但与先将GSCs以单细胞形式接种的条件相比，该条件下的转移效率较低。一旦掌握该技术，若操作得当，可在三小时内完成。

在进行该实验操作时，必须始终注意将线粒体制剂置于冰上。完成这些步骤后，可进一步采用其他方法，如流式细胞术（FACS）、共聚焦显微镜观察、线粒体DNA的定量PCR（QPCR），以观察并定量间充质干细胞（MSC）向靶细胞的线粒体转移。此外，还可开展功能学研究，以确定所转移线粒体的生物学效应。

需要注意的是，这些研究通常使用的线粒体量要少于用于观察线粒体转移的量。该技术将有助于探索在正常生理或病理条件下细胞间自发转移的线粒体所产生的结果及其生物学效应，从而推动新型治疗方法的开发。