MitoCeption: Transferring Isolated Human MSC Mitochondria to Glioblastoma Stem Cells

该程序的总体目标是将先前分离的线粒体从供体细胞（如间充质干细胞）转移到靶细胞（如胶质母细胞瘤干细胞）。该程序可以帮助回答代谢领域的关键问题，例如线粒体的代谢和生物学效应，这些线粒体通过隧道纳米管或微泡等过程在细胞之间自发转移。该技术的主要优点是可以独立于微环境中存在的其他因素（例如细胞因子或代谢物）以及其他化合物来评估线粒体的影响，这些化合物也可以在隧道纳米管中运输。

出于成像目的，MSC 线粒体和 GSC 可以在线粒体转移之前通过 MitoCeption 用活性染料标记。首先，根据文本方案用活性染料预标记 GSC 后，通过在 20 摄氏度下以 270 倍 g 离心 5 分钟，在 50 毫升试管中收集 GSC 神经球。使用 5 毫升 HBSS 洗涤细胞并再次旋转试管。

吸出上清液，并用 100 微升 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 轻轻重悬 GSC 沉淀。然后将细胞在 37 摄氏度下孵育 3 分钟。接下来，将 10 微升 20 毫摩尔氯化钙分 2 微升，以每毫升 10 毫克的 DNase I 加入试管中。

使用 P200 移液器轻轻上下移液 30 至 50 次，避免形成气泡，从而分离神经球。向细胞中加入 10 μL 5% 胰蛋白酶抑制剂和 10 mL HBSS 中，并将 GSC 离心 7 分钟。然后将上清液和 10 mL GSC 基础培养基弃去到样品中。

现在，使用 Thoma 计数室，在再次旋转之前对细胞进行计数。加入适当体积的 GSC 增殖培养基，以达到每毫升 10 至 6 个 GSC 的细胞浓缩物。然后在 96 孔板的每孔中接种 10 到 5 个 GSC。

离心板，使 GSC 沉淀在孔的底部。在显微镜下检查细胞。然后将板在 37 摄氏度下孵育。

要进行 MSC 线粒体分离，首先将微量离心机温度调节至 4 摄氏度。准备两支标有 A 和 C 的 1.5 毫升试管，含有用于线粒体提取的试剂。准备两个额外的管子，标记为 MSC 和 MiTo。

将试管放在冰上。还要准备用于线粒体连续稀释液的试管，这些稀释液将与线粒体制备物一起设置。使用 10 毫升预热至 37 摄氏度的 PBS 洗涤 MSC。

然后用 2 毫升不含 EDTA 的胰蛋白酶洗涤细胞 10 秒，再加入 1 毫升胰蛋白酶，然后将细胞在 37 摄氏度下孵育 5 到 10 分钟。应按照方案避免使用 EDTA，特别是用于 MSC 胰蛋白酶消化和线粒体制备中使用的蛋白酶抑制剂。通过添加 10 毫升 Alpha MEM 10% FBS 回收 MSC，并将悬浮液转移到 50 毫升试管中。

然后离心细胞。弃去上清液，向细胞沉淀中加入 10 毫升 Alpha MEM 10%FBS。然后使用 Malassez 计数室计数 MSC，然后旋转 4 到 5 乘以 10 至第五个细胞。

弃去上清液，向细胞沉淀中加入 1 毫升冰冷的 Alpha MEM 10%FBS，并将细胞转移到先前制备的 MSC 标记管中，同时继续将其保持在冰上。然后将 MSC 管在 4 摄氏度下以 900 倍 g 离心 5 分钟，并去除管中所有残留的培养基。接下来，向 MSC 中加入 200 微升含不含 EDTA 的蛋白酶抑制剂的线粒体分离试剂 A，并以中速涡旋 5 秒。

然后将试管放在冰上整整两分钟。加入 2.5 μL 线粒体分离试剂 B，以最大速度涡旋细胞 10 秒，然后将试管放回冰上。每 30 秒重复一次涡旋，持续 5 分钟。

现在，向试管中加入 200 微升含不含 EDTA 的蛋白酶抑制剂的线粒体分离试剂 C，并通过将试管倾斜约 30 次来混合内容物。将试管在 4 摄氏度下以 700 倍 g 离心 10 分钟。将含有 MSC 线粒体的上清液转移到先前制备的 MiTo 管中。

样品在 4 摄氏度下以 3， 000 x g 离心 15 分钟。弃去上清液后，使用 200 微升试剂 C 冲洗线粒体沉淀。然后将悬浮液在 4 摄氏度下以 12， 000 倍 g 旋转 5 分钟，以沉淀细胞器。

要将分离的 MSC 线粒体转移到 GSC 中，向线粒体沉淀中加入 200 微升预冷的 GSC 增殖培养基。在 GSC 增殖培养基中稀释线粒体制剂，以始终允许向 GSC 中添加 20 μL 线粒体悬浮液。接下来，慢慢加入靠近孔底的线粒体。

为了控制 MSC 线粒体重要染料泄漏，将等量的线粒体制剂添加到仅含有 GSC 增殖培养基的 96 孔板的孔中。将板在 4 摄氏度下以 1， 500 倍 g 离心 15 分钟。然后立即将培养物置于 37 摄氏度。

第二天，为了分析对照孔中是否存在重要的染料泄漏，如前所述接种 GSC 细胞，离心板，然后在 37 摄氏度下孵育培养物 1 小时。离心仅包含线粒体的 96 孔板。然后从 GSC 96 孔板中吸出培养基，并用线粒体上清液替换。

将 GSC 与线粒体上清液在 37 摄氏度下孵育 2 小时。最后，根据文本方案进行线粒体转移分析、FACS 分析和共聚焦成像。GSC 是以神经球形式生长的癌症干细胞，以保持其干细胞特性。

在线粒体转移之前，它们被接种为单个细胞以实现高线粒体转移效率，第二天如图所示，再次观察到细胞形成神经球。在该图中，可以看到荧光标记的 MSC 线粒体位于 Gb4 GSC 内。MSC 线粒体出现在整个 GSC 中，类似于 GSC 线粒体。

在 GSC 共聚焦图像的 3D 重建中可以观察到大多数 GSC 的 MSC 线粒体转移，证实了转移的 MSC 线粒体的细胞间定位。用蓝色细胞和红色线粒体活性染料预标记 GSC 可以可视化相对于内源性 GSC 线粒体的绿色转移 MSC 线粒体的定位。如此处所示，荧光 MSC 线粒体量增加的 MitoCeption 导致 FACS 信号增加，并且比对照信号高几个数量级。

此处介绍的在单细胞 GSC 上进行的线粒体转移方案显示出剂量依赖性反应和相对平均荧光强度。最后，尽管 MSC 线粒体转移也在 GSC 神经球上实现，但与线粒体转移到首次作为单细胞接种的 GSC 相比，在这些条件下转移到 GSC 的功效较低。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在三个小时内完成。

在尝试此过程时，重要的是要记住始终将线粒体制备物放在冰上。遵循这些程序后，可以执行其他方法，如 FACS、共聚焦显微镜、线粒体 DNA 上的 QPCR，以可视化和量化 MSC 线粒体向靶细胞的转移。也可以进行功能研究以确定转移的线粒体的生物学效应。

请记住，这些研究通常使用比用于可视化线粒体转移的线粒体量更少的线粒体进行。该技术将允许探索线粒体在正常生理或病理条件下在细胞之间自发转移的结果和生物学效应，从而有助于开发新的治疗方法。