骨骼肌完整的线粒体的分离差速离心高分辨率测量呼吸运动
March 8th, 2017
这里，从麻醉猪身上取股四头肌标本，通过差速离心分离线粒体。然后，使用高分辨率呼吸测定法测定线粒体呼吸链复合物 I、II 和 IV 的呼吸频率。
该程序的总体目标是通过差速离心分离骨骼肌线粒体并确定线粒体呼吸链复合物 I、II 和 IV 的呼吸频率.该方法可以帮助回答线粒体生物能量领域的关键问题，例如与线粒体功能障碍相关的疾病和综合征，例如各种神经系统疾病、败血症和与年龄相关的疾病。该技术的主要优点是分离的线粒体制备物中不存在大部分细胞学因子，这可能会干扰线粒体功能的分析。演示该程序的是我实验室的技术人员 Sandra Nansoz。
要开始此过程，请按照文本协议中概述的骨骼肌样本烧杯。将烧杯放在冰桶上。使用细剪刀将肌肉切成一到两毫米大小的块。
接下来，用冰冷的分离缓冲液冲洗碎纸组织两次，每次洗涤 20 毫升。将洗涤过的组织悬浮在每克组织 10 毫升分离缓冲液中，然后加入 5 毫克蛋白酶-G 组织。然后将烧杯放入带有磁力搅拌器的冰浴中，搅拌 10 分钟。
在此之后，用额外的 10 毫升分离缓冲液稀释悬浮液，每克组织补充有 0.2% 脱脂 BSA。接下来，从烧杯中倒出所有分离缓冲液。用补充有 0.2% BSA 的冰冷隔离缓冲液洗涤组织两次，每次洗涤 20 毫升。
然后，将组织重悬于每克组织 10 毫升补充有 BSA 的分离缓冲液中。使用带有松散杵的半自动玻璃匀浆器对组织进行匀浆。接下来，将匀浆转移到离心管中，并在 4 摄氏度下以 10， 000 倍 G 离心 10 分钟。
使用血清移液管，弃去上清液。每克组织用 10 毫升冰冷的 BSA 补充分离培养基重悬沉淀。将悬浮液在 4 摄氏度下以 350 倍 G 离心 10 分钟。
在此之后，使用血清移液管保留上清液，丢弃沉淀。通过两层纱布将上清液过滤到保存在冰上的烧杯中。将过滤后的悬浮液转移到离心管中，在 4 摄氏度下以 7， 000 倍 G 离心 10 分钟。
然后丢弃上清液。将粗线粒体沉淀重悬于每克组织 5 毫升补充有 BSA 的分离缓冲液中。在 4 摄氏度下将此悬浮液离心 7， 000 倍 G 10 分钟。
接下来，弃去上清液，将沉淀重悬于 20 mL 洗涤缓冲液中。在 4 摄氏度下以 7， 000 倍 G 离心 10 分钟。再次重复此再悬浮和离心过程。
之后，弃去上清液，将沉淀重悬于 1 mL 洗涤缓冲液中。使用任何标准方法测定蛋白质浓度。然后，将浓缩的线粒体悬浮液保持在冰上，直到准备好进行呼吸测定。
首先，将线粒体浓缩物重悬于呼吸缓冲液中，最终浓度为 0.4 毫克/毫升线粒体蛋白。接下来，从空气校准的氧样仪室中吸出呼吸介质。加入 2.1 毫升分离的线粒体悬液。
插入塞子以关闭氧合仪室。然后，在 700 摄氏度下以 37 RPM 的速度连续搅拌线粒体悬浮液。在基线时记录细胞呼吸 3 到 5 分钟，直到获得稳定的氧通量信号。
要开始复杂的 I 依赖性呼吸，通过塞子的钛注射口将 12.5 微升 0.8 摩尔苹果酸注入用分离的线粒体悬浮液制备的氧合仪室中。然后，注射 10 微升 2 磨牙谷氨酸。记录细胞呼吸 3 到 5 分钟，直到获得稳定的氧通量信号。
在此之后，通过注射口将 10 微升 0.05 摩尔 ADP 注入腔室。记录细胞呼吸，直到氧通量信号增加，然后减少并稳定下来。对于复合物 II 依赖性呼吸，将两微升 0.2 毫摩尔鱼藤酮注射到用分离的线粒体悬液制备的氧合仪室中。
记录细胞呼吸，直到获得稳定的氧通量信号。然后，注射 20 微升 1 摩尔琥珀酸盐。记录细胞呼吸，直到获得稳定的氧通量信号。
在此之后，通过注射口将 10 微升 0.05 摩尔 ADP 注入腔室。记录细胞呼吸，直到氧通量信号增加，然后减少并稳定下来。对于复杂的 IV 依赖性呼吸，将 2.5 微升 0.8 毫摩尔抗坏血酸注射到用分离线粒体悬液制备的氧合仪室中。
接下来，立即注射 2.5 微升 0.2 摩尔 TMPD 和 10 微升 0.05 摩尔 ADP。记录细胞呼吸，直到获得稳定的氧通量信号。然后，注射 10 微升 1 摩尔叠氮化钠。
记录细胞呼吸，直到氧通量信号减弱，然后稳定下来。在这项研究中，从骨骼肌中分离出完整的线粒体。然后通过高分辨率呼吸测量法测量复杂 I 依赖性呼吸频率。
可以看出，添加 ADP 后线粒体呼吸率立即增加。ADP 耗竭后呼吸率降低至与添加 ADP 之前观察到的水平相似的水平。这表明状态 3 和状态 4 的比率称为呼吸控制比率或 RCR，很高，并且在分离过程中线粒体完整性得到了很好的保留。
然后通过用鱼藤酮抑制复合物 I 呼吸并注射复合物 II 底物琥珀酸来观察复合物 II 依赖性呼吸频率。然后添加 ADP，导致呼吸立即增加。一旦 ADP 耗尽，呼吸就会降低到与添加 ADP 之前观察到的水平相似的水平，表明 RCR 很高，因为在分离过程中线粒体完整性得到了很好的保留。
通过添加抗坏血酸、TMPD 和 ADP 来观察复杂的 IV 依赖性呼吸率。然后加入叠氮化钠以抑制复合物 IV.加入叠氮化钠前后耗氧量的差异被解释为真正的复合物 IV 呼吸。在状态 3 中观察到的高复杂 IV 依赖性呼吸速率表明，在分离过程中线粒体完整性得到保留。
一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在不到一个半小时的时间内完成。在尝试此程序时，请务必记住在均质化之前提前对氧传感器进行校准。按照此程序，可以执行其他方法，例如测量细胞 ADP 含量、线粒体膜电位、ATP 合酶酶活性作为底物水平，以回答其他问题，例如呼吸频率的变化是否是由于缺乏线粒体底物、膜电位或 ATP 合酶活性降低。
观看此视频后，您应该对如何通过差速离心法从骨骼肌中分离线粒体以及如何使用高分辨率呼吸测定法测量线粒体复合物 I、II 和 IV 的呼吸频率有很好的了解。该技术发展后，为线粒体能量代谢领域的研究人员在遗传性线粒体疾病、肌病、离体线粒体缺血再灌注损伤等领域探索线粒体能量功能铺平了道路。不要忘记，使用抗霉素 A、鱼藤酮、叠氮化钠和 FCCP 可能非常危险。
执行此程序时应始终采取预防措施，例如佩戴手套和实验室外套。
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概述
本文描述了一种使用差速离心法从猪股四头肌中分离骨骼肌线粒体的方法。然后使用高分辨率呼吸测定法测量线粒体呼吸链复合物I、II和IV的呼吸速率。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物学
- 线粒体生物能量学
背景
- 线粒体功能障碍与多种疾病有关。
- 了解线粒体功能对于解决神经系统疾病、脓毒症和年龄相关疾病至关重要。
- 分离线粒体有助于消除可能干扰分析的细胞学因素。
- 该技术提高了线粒体功能评估的准确性。
研究目的
- 分离骨骼肌线粒体以进行功能分析。
- 确定线粒体呼吸链复合物的呼吸速率。
- 为了解与线粒体相关的疾病做出贡献。
使用的方法
- 使用差速离心法从骨骼肌中分离线粒体。
- 测量线粒体复合物I、II和IV的呼吸速率。
- 使用高分辨率呼吸测定法进行准确评估。
- 通过将肌肉样本切成小块来制备样本。
主要结果
- 成功从骨骼肌中分离出线粒体。
- 确定了线粒体复合物的呼吸速率。
- 对各种疾病相关的线粒体功能提供了洞见。
- 展示了该方法在实验室环境中的有效性。
结论
- 该方法提供了一种研究线粒体功能的可靠方法。
- 它有助于理解线粒体在健康和疾病中的作用。
- 未来的研究可以在这些发现的基础上探索线粒体功能障碍。
常见问题
Executive Industry Relevance
Isolation of intact mitochondria from skeletal muscle enables precise assessment of respiratory chain function, supporting target validation in mitochondrial dysfunction-related therapeutic areas. High-resolution respirometry provides quantitative, reproducible data that de-risks mechanistic hypotheses in preclinical models of neurological disease, sepsis, and age-related disorders. This workflow enhances predictive confidence in lead identification by isolating cytologic confounders that could obscure compound effects on bioenergetic pathways.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of mitochondrial respiratory chain complexes I, II, and IV as therapeutic targets in metabolic and neurodegenerative disease models.
- Operational Value: Provides a standardized isolation protocol that reduces variability in functional assays across discovery campaigns.
- Scientific Value: Supports biological de-risking by confirming mitochondrial integrity via high respiratory control ratios before compound screening.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates pure mitochondrial suspensions suitable for high-resolution respirometry, enabling reliable dose-response analysis of test compounds on OXPHOS function.
- Operational Value: Delivers quantitative oxygen flux measurements that serve as robust, scalable endpoints for assay standardization.
- Scientific Value: Facilitates mechanistic de-risking by isolating specific complex-dependent respiration (e.g., complex II via rotenone inhibition) to clarify compound mechanisms of action.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Connects early discovery findings to preclinical validation through disease-relevant skeletal muscle models linked to myopathies and ischemia-reperfusion injury.
- Operational Value: Enables continuity of mitochondrial functional assessment from isolated tissue to integrated respirometry platforms.
- Scientific Value: Supports risk-adjusted advancement decisions by providing respirometry-based biomarkers of mitochondrial health and drug-induced toxicity.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from early target hypothesis testing through lead optimization, where mitochondrial respirometry informs go/no-go decisions based on bioenergetic liability.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of mitochondrial dysfunction in disease models by isolating intact organelles for functional interrogation.
- Screening: Delivers assay-ready mitochondrial preparations with high purity and coupling efficiency, enabling reliable compound evaluation.
- Analytics: Provides quantitative dependent variable measurements (oxygen flux, respiratory control ratio) that allow comparison of experimental conditions and compound effects.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through use of skeletal muscle tissue, a disease-relevant system for mitochondrial myopathies and metabolic disorders.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable isolation and respirometry workflow applicable across multiple projects studying mitochondrial-targeted therapeutics.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through isolated mitochondrial analysis.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization of respirometry assays via standardized differential centrifugation and wash steps.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by providing early bioenergetic liability data, reducing late-stage failure risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on mitochondrial respiration profiles and complex-specific activity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue handling, mitochondrial isolation, and respirometry assay setup.
- Dependent on centrifugation equipment, temperature control, and oxygen-sensing instrumentation.
- Necessitates standardization of isolation buffer composition and tissue-to-buffer ratios across users and sites.
- Requires adaptation considerations when applying to different tissue types or species beyond skeletal muscle.
- Limited by tissue yield requirements; large amounts of skeletal muscle are needed for sufficient mitochondrial protein recovery.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:01
Skeletal Muscle Homogenization and Mitochondrial Isolation
4:00
High-resolution Respirometry
4:44
Complex I-dependent Respiration, Complex II-dependent Respiration, and Complex IV-dependent Respiration
8:35
Conclusion
6:51
Results: High-resolution Respirometry Measurements from Intact Mitochondria Isolated from Skeletal Muscle
