通过差速离心法从骨骼肌中分离完整线粒体用于高分辨率呼吸测定

本实验的总体目标是通过差速离心法分离骨骼肌线粒体，并测定线粒体呼吸链复合物 I、II 和 IV 的呼吸速率。该方法有助于解答线粒体生物能量学领域中的关键问题，例如与线粒体功能障碍相关的疾病和综合征，包括多种神经系统疾病、脓毒症以及衰老相关疾病。该技术的主要优势在于，所分离的线粒体样品中几乎不含大多数细胞学干扰因子，从而避免对线粒体功能分析造成干扰。本次实验操作将由本实验室的技术员 Sandra Nansoz 演示。

开始此操作时，按照文本方案获取装有骨骼肌样本的烧杯。将烧杯置于冰桶上。使用精细剪刀将肌肉剪切成大小为一至二毫米的碎片。

接下来，用20毫升冰浴的分离缓冲液将切碎的组织清洗两次，每次清洗使用20毫升。将清洗后的组织按每克组织加入10毫升分离缓冲液进行重悬，然后加入5毫克蛋白酶G组织。随后将烧杯置于冰浴中，并放入磁力搅拌器，搅拌10分钟。

此后，每克组织加入额外的10毫升分离缓冲液，该缓冲液中添加有0.2%去脂BSA，用于稀释悬液。接着，将烧杯中的全部分离缓冲液倾倒弃去。用含有0.2% BSA的预冷冰冻分离缓冲液洗涤组织两次，每次使用20毫升。

然后，每克组织加入10毫升添加了BSA的分离缓冲液重悬组织。使用带有松配合研杵的半自动玻璃匀浆器匀浆组织。接着，将匀浆液转移至离心管中，在4°C条件下以10,000 × g离心10分钟。

使用血清移液管弃去上清液。每克组织加入10毫升冰冻的含BSA的分离培养基重悬沉淀。4°C下以350 × g离心10分钟。

此后，使用刻度移液管保留上清液，弃去沉淀。将上清液通过两层纱布过滤至置于冰上的烧杯中。将过滤后的悬液转移至离心管中，在4°C条件下以7,000 × g离心10分钟。

然后弃去上清液。每克组织用5毫升添加了BSA的分离缓冲液重悬粗线粒体沉淀。将此悬浮液在4°C下以7,000 × g离心10分钟。

接下来，弃去上清液，并将沉淀重悬于 20 毫升洗涤缓冲液中。在 4 °C 条件下，以 7,000 ×g 离心 10 分钟。重复此重悬和离心步骤一次。

此后，弃去上清液，并将沉淀重悬于一毫升洗涤缓冲液中。采用任何标准方法测定蛋白质浓度。然后将浓缩的线粒体悬液置于冰上，直至准备进行呼吸测定实验。

首先，用呼吸缓冲液重悬线粒体浓缩物，使线粒体蛋白的终浓度为 0.4 毫克/毫升。接着，吸除已与空气平衡的氧电极室中的呼吸介质。加入 2.1 毫升分离的线粒体悬液。

插入塞子封闭氧电极室。随后，在37摄氏度下以700转/分钟持续搅拌线粒体悬液。记录基础状态下的细胞呼吸三到五分钟，直至获得稳定的氧通量信号。

为启动依赖复合体 I 的呼吸作用，通过密封塞上的钛注射口，向已加入分离线粒体悬液的氧电极室中注入 12.5 微升 0.8 摩尔的苹果酸。随后，注入 10 微升 2 摩尔的谷氨酸。记录细胞呼吸 3 至 5 分钟，直至获得稳定的氧通量信号。

随后，通过进样口向检测室中注入 10 微升 0.05 摩尔的 ADP。记录细胞呼吸，直至氧通量信号先升高，后下降并趋于稳定。对于复合体 II 依赖性呼吸，向已加入分离线粒体悬液的氧电极检测室中注入 2 微升 0.2 毫摩尔的鱼藤酮。

记录细胞呼吸，直至获得稳定的氧通量信号。然后，加入20微升1摩尔的琥珀酸。继续记录细胞呼吸，直至再次获得稳定的氧通量信号。

此后，通过进样口向检测室中注入10微升0.05摩尔的ADP。记录细胞呼吸，直至氧通量信号先升高，后下降并趋于稳定。对于复合体IV依赖性呼吸，向含有分离线粒体悬液的氧电极检测室中注入2.5微升0.8毫摩尔的抗坏血酸。

接下来，立即加入 2.5 µL 的 0.2 M TMPD 和 10 µL 的 0.05 M ADP。记录细胞呼吸，直至获得稳定的氧气通量信号。然后，加入 10 µL 的 1 M 叠氮化钠。

记录细胞呼吸，直至氧通量信号下降，然后趋于稳定。本研究中，从骨骼肌中分离完整的线粒体，随后通过高分辨率呼吸测定法测量复合物I依赖性呼吸速率。

可以看出，加入ADP后，线粒体呼吸速率立即升高。在ADP耗尽后，呼吸速率下降至与加入ADP前相似的水平。这表明被称为呼吸控制比（RCR）的态3与态4之比值较高，说明线粒体在分离过程中保持了良好的完整性。

随后通过鱼藤酮抑制复合物I的呼吸，并加入复合物II底物琥珀酸，观察依赖复合物II的呼吸速率。接着加入ADP，呼吸速率立即上升。当ADP耗尽后，呼吸速率下降至接近ADP添加前的水平，表明呼吸控制比（RCR）较高，说明线粒体在分离过程中保持了良好的完整性。

通过添加抗坏血酸、TMPD 和 ADP 来观察依赖复合体 IV 的呼吸速率。随后加入叠氮化钠以抑制复合体 IV。加入叠氮化钠前后氧气消耗量的差异被解释为真实的复合体 IV 呼吸速率。在状态 3 中观察到较高的依赖复合体 IV 的呼吸速率，表明线粒体在分离过程中保持了良好的完整性。

一旦熟练掌握，若操作得当，该技术可在一个半小时内完成。在进行该实验时，重要的是需记住在组织匀浆前预先对氧气传感器进行校准。在完成该步骤后，还可进一步采用其他方法，如测定细胞内ADP含量、线粒体膜电位、ATP合酶酶活性及底物水平，以回答更多相关问题，例如呼吸速率的变化是否由线粒体底物缺乏、膜电位异常或ATP合酶酶活性降低所致。

观看本视频后，您应能够充分理解如何通过差速离心法从骨骼肌中分离线粒体，以及如何利用高分辨率呼吸测定法测量线粒体复合物 I、II 和 IV 的呼吸速率。该技术发展后，为线粒体能量代谢领域的研究人员探索遗传性线粒体疾病、肌病、缺血-再灌注损伤等领域的线粒体能量功能提供了重要途径。请务必注意，使用抗霉素A、鱼藤酮、叠氮化钠和FCCP可能具有极高危险性。

进行该操作时，应始终采取佩戴手套和实验服等预防措施。