Sublimation of DAN Matrix for the Detection and Visualization of Gangliosides in Rat Brain Tissue for MALDI Imaging Mass Spectrometry

该升华方案的总体目标是提供详细、易于遵循的样品制备过程，用于 MALDI 成像质谱实验中神经节苷脂的检测。这种方法可以帮助回答神经生物学领域的关键问题，包括神经节苷脂在健康大脑和脑病理学中的解剖分布和功能。该技术的主要优点是它可以适应许多脂质种类的高质量成像，对方案几乎没有改变。

要开始此过程，请从大鼠中提取脑组织并按照文本协议中的说明准备低温恒温器。然后将组织放入低温恒温器中。将组织切片至所需的解剖位置。

确保切割厚度在 8 到 12 微米之间。使用低温恒温器防侧倾杆，缓慢切片扁平的组织切片。如果防滚杆位置不正确或刀片变钝，组织上可能会出现孔洞或标记。

使用干净的油漆刷将组织移动到切片平台的中心。要绘制组织图，请在切片时将导电载玻片或金属板放入低温恒温器中以冷冻导电载玻片或金属板。当载玻片完全冻结时，使用干净的油漆刷小心地将切片组织移动到载玻片的导电服务上。

将所有组织切片正确放置在载玻片上后，将手指放在载玻片下与组织相对的位置，然后按压直到切片解冻。然后将载玻片和组织放入干燥器中 5 到 10 分钟。或者，使用温热的玻片，将其导电面朝下轻轻按压在压平的组织切片上。

在通风橱中工作，将铝容器中的沙浴放在热板上。加热板应位于适当表面积的金属剪刀式升降机上。打开电炉并将温度设置为 140 摄氏度。

使用温度反馈探头在整个实验过程中监测砂温，并确保温度一致性。接下来，将 300 毫克 DAN 基质放在升华装置的底面上。将基质均匀地铺在装置中心的一层中，以达到被升华的载玻片的大致宽度和长度。

将金属板放在设备的内表面，金属板与冷凝器底部直接接触。用胶带将空白测试玻片对角线穿过金属板表面，并在玻片的外边缘放置胶带。用中间的橡胶 O 形圈连接设备的顶部和底部，以确保完全密封。

在设备中心周围放置一个金属 U 形接头，并拧紧虎钳，直到设备的顶部和下半部分密封在一起。然后将设备放入沙浴周围的金属 O 形圈中。接下来，将一把碎冰放入冷凝器中。

用冷水将冷凝器装满四分之一到二分之一，以形成冰泥。冰泥会冷却设备内部的金属板，然后冷却粘附在其上的载玻片。等待至少 5 分钟，让温度达到稳定状态。

然后，将 300 mL 甲醇倒入冷阱容器中，并将玻璃器皿放入容器中。使用橡胶管将真空泵连接到冷阱输出端。使用另一根橡胶管将冷阱输入连接到升华装置。

确保使用金属夹将管路紧紧固定。使用真空泵提供 30 至 50 毫托的真空。让泵运行至少 5 分钟以实现压力平衡。

将两到三小块干冰滴入冷阱容器底部的乙醇中。冷阱有助于防止基质颗粒在真空泵中积聚。一旦真空泵打开，升华仪 U 形圈上的台钳可能需要拧紧，因为设备中的压力会降低。

确保沙浴温度稳定在 140 摄氏度。还要检查真空是否打开，以及设备是否固定在沙浴上方的金属 O 形圈中，并连接了所有管道。将计时器设置为 7 分钟，但不要启动计时器。

慢慢地将剪刀式升降机和沙浴升至升华装置，直到升华器的 U 形接头远高于金属 O 形圈。这个额外的空间允许在沙地上调整设备。快速将升华器轻轻按压在沙子表面，以确保设备均匀地位于沙子上。

然后，立即启动计时器。当计时器响起时，关闭真空泵并小心地降低剪刀式升降机，直到升华器不再接触沙浴并牢固地坐在金属 O 形圈中。慢慢松开微型放空阀以释放设备中的压力。

松开升华仪橡胶管周围的金属夹，然后慢慢开始松开管子。稍微松开橡胶管后，将管子向一侧弯曲，让残余压力逸出。当环境压力恢复时，小心地从升华装置上取下橡胶管。

接下来，松开设备 U 形接头上的虎钳并将其取下。小心地将升华装置的两半分开，并从内部玻璃器皿的顶部拉下载玻片。检查载玻片以确认基质分布均匀。

如果升华基质的分布和数量足够，请将带有组织的新载玻片贴在升华器的内部并重复升华过程。继续按照文本协议中的说明进行成像和分析。质谱显示 1000 至 2000 质量范围内的阳极物的离子丰度。

主要的 A 系列神经节苷脂沿谱系标记。这里显示的是大鼠大脑中神经节苷锭脂的相应分子图像。分子图像通过颜色编码显示了几种神经节苷脂物种的解剖分布，这些神经节苷脂已使用 ImageJ 软件进行叠加和伪着色。

通常，刚接触这种方法的人可能会遇到困难，因为样品制备过程中有许多变量会影响 IMS 结果的质量，而这些结果通常被报告的方案遗漏。在尝试此过程时，重要的是要记住在每次实验后监测被升华的基质量，并相应地修改载玻片的升华时间。开发后，这项技术为研究人员探索神经节苷脂等膜脂质在脑损伤、ner-jone 病和自然衰老过程后的作用铺平了道路。

那些这种方法可以提供对大脑中脂质丰度和解剖分布的洞察，它也可以应用于其他系统，包括大脑外的组织，甚至植物和昆虫模型。处理受损的牙根可能非常危险，因此在执行此程序时应始终采取预防措施，例如手套、口罩和护目镜。